一种检测卡那霉素的均相生物传感方法及其应用与流程

本发明涉及生物分析
技术领域：
，具体是一种检测卡那霉素的均相生物传感方法及其应用。
背景技术：
：卡那霉素是一种的氨基糖苷类高效广谱抗生素，对多数肠杆菌科细菌如大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、普罗菲登菌属、耶尔森菌属，以及流感嗜血杆菌、布鲁菌属、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等均有良好抗菌作用，因而被广泛用于人和动物各种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌感染性疾病的治疗。然而，卡那霉素的过量使用不仅可以引起听力减退、耳鸣，甚至肾毒性反应和药物过敏等严重的副作用，而且还会产生严重的耐药性。近年来，抗生素的滥用引起的食物、水体、土壤中抗生素残留超标及其通过食物链在人体中的富集对人类健康产生了的极大威胁，引起了社会普遍关注。因此，包括我国在内的许多国家和地区都对食物中卡拉霉素等抗生素残留提出了严格的限制标准。目前，国家标准一般采用液相色谱-质谱联用法来进行卡那霉素残留的检测，但是该方法仪器昂贵，检测成本高，且一般只能在实验室进行，很难满足实际应用中实时、现场检测的需要。为解决这一问题，近年来人们将抗原（抗体）、dna等生物识别作用与电化学、比色等分析方法相结合，发展了大量可用于抗生素快速、方便检测的生物传感方法。但是，这些方法一般都是基于异相分析模式而构建，往往需要十分繁琐的固相界面修饰，以及多步温育、分离和洗涤操作，甚至还要结合纳米材料信号放大来提高其分析灵敏度，因而不仅分析时间较长，操作繁琐，而且多步操作还会一定程度上影响方法的重复性，提高分析成本，十分不利于其广泛使用。因此，发展一种操作简单，且具有灵敏度高、准确性好、成本低廉等优良性能的智能型生物传感新方法具有十分重要的意义。技术实现要素：本发明的目的就是针对目前检测卡拉霉素的方法操作繁琐、成本较高、时间较长、重复性不好等问题，提供一种可简单、快速检测样品中卡拉霉素含量的均相生物传感方法，该方法操作方便，成本低廉，灵敏度高，稳定性好，分析时间较短，对操作人员的要求低，对于食品、水体等复杂介质中卡拉霉素残留现场、快速检测具有很好的应用价值。本发明的一种检测卡那霉素（kana）的均相生物传感方法，包括以下步骤：（1）g-四链体特征序列与卡那霉素核酸适配体杂交双链制备向pv管中加入990µl浓度为10mmph=7.4三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液，所述缓冲溶液中含有200mmnacl、10mmkcl、质量分数为1%dmso和质量分数为0.05%tritonx-100，再向其中加入5µl10µmg-四链体dna链（s1）和5µl10µm卡那霉素核酸适配体（s2）溶液，所述g-四链体dna链（s1）的碱基序列为5’-gggtagggcgggttgggaacctcaagaccacttggacatttt-3’，所述卡那霉素核酸适配体（s2）的碱基序列为5’-tgtccaagtggtcttgaggtttttt-3’，室温震荡反应45min后得到适配体杂交双链复合物溶液待用；（2）均相反应测定标准溶液中卡那霉素（kana）的含量取6份上述适配体杂交双链复合物溶液各100µl，向其中分别加入含有卡拉霉素（kana）的浓度梯度为0.0001ng/ml、0.001ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml20mmph=7.4tris-hcl缓冲溶液50µl，该缓冲溶液中含有100mmnacl，2mmmgcl2和5mmkcl，再向每份溶液中加入5µl2µm卡那霉素核酸适配体部分互补序列（s3）、5µl5u/µl核酸外切酶iii（exoiii）以及5µl1µm的氯化血红素（hemin），所述卡那霉素核酸适配体部分互补序列（s3）中的碱基序列为5’-aaaaaacctgacactac-3’；37℃涡旋混匀反应70min后，升高温度至65℃，保持5min后降至25℃；接着向每份溶液中加入70µl含有0.4mmtmb、0.4mmh2o2的ph=5.0柠檬酸盐缓冲溶液，该缓冲溶液中含有95.8mmna2hpo4、52.1mm柠檬酸钠和40mmkcl，显色反应5min之后，继续向其中加入30µl2mh2so4终止显色反应；利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，以建立吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系；（3）样品中卡那霉素（kana）含量的检测取适量的样品并进行前处理，取处理后的样品溶液50µl，向其中加入100µl适配体杂交双链复合物溶液、5µl2µm卡那霉素核酸适配体部分互补序列（s3）、5µl5u/µl核酸外切酶iii（exoiii）以及5µl1µm的氯化血红素（hemin），所述卡那霉素核酸适配体部分互补序列（s3）中的碱基序列为5’-aaaaaacctgacactac-3’；37℃涡旋混匀反应70min后，升高温度至65℃，保持5min后降至25℃；接着向样品溶液中加入70µl含有0.4mmtmb、0.4mmh2o2的ph=5.0柠檬酸盐缓溶液，该缓冲溶液中含有95.8mmna2hpo4、52.1mm柠檬酸钠和40mmkcl，显色反应5min之后，继续向其中加入30µl2mh2so4终止显色反应；利用紫外-可见分光光度计测定样品溶液的吸光度值，根据吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系计算卡那霉素（kana）的含量。本发明还提供了一种检测卡那霉素的均相生物传感方法在检测样品中卡那霉素含量中的应用。本发明的工作原理是：通过g-四链体dna链（s1）与卡那霉素（kana）核酸适配体（s2）之间的dna双链杂交反应可以很好抑制s1所含的g-四链体与氯化血红素（hemin）相结合形成dna酶，而作为卡那霉素核酸适配体的s2与卡那霉素（kana）分析物之间的特异性结合又可以释放对应数量的s1，从而通过s1与氯化血红素（hemin）结合形成dna酶的催化显色反应进行比色信号转导；此外，卡那霉素（kana）与其核酸适配体s2之间结合形成的类发夹结构可以在引入s2部分互补链s3进行杂交后，通过核酸外切酶iii（exoiii）的酶切反应释放出卡那霉素（kana）和s3进行目标分析物循环信号放大，进而有效提高分析方法的灵敏度；利用卡那霉素与其核酸适配体特异性识别，以及核酸外切酶iii酶促反应释放的游离dna酶的催化显色反应，即可构建显色产物吸光度与卡那霉素分析物浓度之间的定量关系。本发明采用的核酸适配体不仅较传统抗体具有稳定性更好、成本更为低廉等优点，而且核酸适配体与卡那霉素分析物之间更好的特异性识别作用可以很高保证该方法在复杂基质分析中的优良选择性；反应释放的dna酶的催化显色反应及核酸外切酶iii的酶促循环反应信号放大作用使得该方法拥有很高的分析灵敏度，避免了传统方法中复杂的纳米材料制备及其信号放大过程中可能引起的非特异性吸附影响；更重要的是，全部识别反应、循环信号放大及dna酶形成都在均相溶液中一步进行，不仅操作十分简单，而且很好保证了方法的重复性，因而较传统方法具有十分突出的优越性和实用价值。本发明构建的生物传感方法可以方便、简单地用于卡拉霉素含量的高选择性检测，具有灵敏度高、线性范围宽、检测时间较短、检测成本低廉等优良性能，可在0.1pg/ml-10ng/ml浓度范围内实现对卡拉霉素的定量响应和准确测定，很好克服了传统方法操作繁琐、成本较高、时间较长、重复性不好等等缺陷。附图说明图1是本发明的检测原理示意图。具体实施方式实施例1本实施例的一种检测卡那霉素的均相生物传感方法，包括以下步骤：（1）g-四链体特征序列与卡那霉素（kana）核酸适配体杂交双链制备向pv管中加入990µl浓度为10mmph=7.4三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液，所述缓冲溶液中含有200mmnacl、10mmkcl、质量分数为1%dmso和质量分数为0.05%tritonx-100，再向其中加入5µl10µmg-四链体dna链（s1）和5µl10µm卡那霉素（kana）核酸适配体（s2）溶液，所述g-四链体dna链（s1）中碱基序列为5’-gggtagggcgggttgggaacctcaagaccacttggacatttt-3’，所述卡那霉素核酸适配体（s2）中的碱基序列为5’-tgtccaagtggtcttgaggtttttt-3’，室温震荡反应45min后得到适配体杂交双链复合物溶液待用；（2）均相反应测定标准溶液中卡那霉素的含量取6份上述适配体杂交双链复合物溶液各100µl，向其中分别加入含有卡拉霉素（kana）的浓度梯度为0.0001ng/ml、0.001ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml20mmph=7.4tris-hcl缓冲溶液50µl，该缓冲溶液中含有100mmnacl，2mmmgcl2和5mmkcl，再向每份溶液中加入5µl2µm卡那霉素核酸适配体部分互补序列（s3）、5µl5u/µl核酸外切酶iii（exoiii）以及5µl1µm的氯化血红素（hemin），所述卡那霉素核酸适配体部分互补序列（s3）中的碱基序列为5’-aaaaaacctgacactac-3’；37℃涡旋混匀反应70min后，升高温度至65℃，保持5min后降至25℃；接着向每份溶液中加入70µl含有0.4mmtmb、0.4mmh2o2的ph=5.0柠檬酸盐缓冲溶液，该缓冲溶液中含有95.8mmna2hpo4、52.1mm柠檬酸钠和40mmkcl，显色反应5min之后，继续向其中加入30µl2mh2so4终止显色反应；利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，以建立吸光度与卡那霉素（kana）浓度之间的定量关系，得到卡那霉素标准溶液的工作曲线，见下表1。表1卡那霉素标准溶液工作曲线检测物线性范围（ng/ml）线性相关系数检测限（pg/ml）卡那霉素0.0001-100.9980.045实施例2奶粉样品中卡那霉素含量的检测根据实施例1得到的工作曲线，检测奶粉样品中卡那霉素的含量。称取市售的奶粉1g溶解于5ml20mmph7.4tris-hcl缓冲溶液中，该缓冲溶液中含有100mmnacl，2mmmgcl2和5mmkcl，取溶解后的奶粉溶液100µl，向其中加入质量分数为20%的乙酸调节至ph=4.6，20min后离心除去样品中凝固的蛋白质和脂肪，再用0.22μm的滤膜过滤处理样品溶液，并将样品溶液重新调至ph=7.4；取处理后的样品溶液50µl，再向其中加入100µl适配体杂交双链复合物溶液、5µl2µm卡那霉素核酸适配体部分互补序列（s3）、5µl5u/µl核酸外切酶iii（exoiii）以及5µl1µm的氯化血红素（hemin），所述卡那霉素核酸适配体部分互补序列（s3）中的碱基序列为5’-aaaaaacctgacactac-3’；37℃涡旋混匀反应70min后，升高温度至65℃，保持5min后降至25℃；接着向样品溶液中加入70µl含有0.4mmtmb、0.4mmh2o2的ph=5.0柠檬酸盐缓冲溶液，该缓冲溶液中含有95.8mmna2hpo4、52.1mm柠檬酸钠和40mmkcl，显色反应5min之后，继续向其中加入30µl2mh2so4终止显色反应；利用紫外-可见分光光度计测定奶粉样品溶液的吸光度值，根据实施例1中的吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系计算卡那霉素（kana）的含量。检测结果表明，牛奶样品中无卡那霉素残留检出。继续向上述奶粉样品中加入不同浓度的卡那霉素标准溶液，进行加标回收实验，实验结果见下表2。表2奶粉样品溶液的加标回收实验结果序号加入量（μm）平均回收量（μm）rsd（%，n=5）平均回收率（%）111.052.8105.020.10.1072.5107.030.010.00963.396.0从上表2可以看出，本实施例2测试结果的相对标准偏差（rsd）为2.5-3.3%，加标回收率96.0-107.0%，说明本实施例的分析方法具有较高的准确度和精密度。实施例3蜂蜜样品中卡那霉素含量的检测根据实施例1得到的工作曲线，检测蜂蜜样品中卡那霉素的含量。称取市售的蜂蜜2g溶解于4ml20mmph=7.4tris-hcl缓冲溶液中，该缓冲溶液中含有100mmnacl、2mmmgcl2和5mmkcl；再用0.22μm的滤膜过滤处理样品溶液；取过滤后的样品溶液50µl，向其中加入100µl适配体杂交双链复合物溶液、5µl2µm卡那霉素核酸适配体部分互补序列（s3）、5µl5u/µl核酸外切酶iii（exoiii）以及5µl1µm的氯化血红素（hemin），所述卡那霉素核酸适配体部分互补序列（s3）中的碱基序列为5’-aaaaaacctgacactac-3’；37℃涡旋混匀反应70min后，升高温度至65℃，保持5min后降至25℃；接着向样品溶液中加入70µl含有0.4mmtmb、0.4mmh2o2的ph=5.0柠檬酸盐缓冲溶液，所述缓冲溶液含有95.8mmna2hpo4、52.1mm柠檬酸钠和40mmkcl，显色反应5min之后，继续向其中加入30µl2mh2so4终止显色反应；利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据实施例1中的吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系计算卡那霉素（kana）的含量。检测结果表明，蜂蜜样品中无卡那霉素残留检出。当前第1页12