一种基于代谢组学的辣木籽抗糖尿病的血清潜在标志物代谢通路及研究方法与流程

本发明属医药领域。具体是一种基于代谢组学的辣木籽抗糖尿病的血清潜在标志物代谢通路及研究方法。

背景技术：

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，已成为严重危害人类健康的第三大慢性病，由此引发的心血管和微血管并发症成为致死、致残的主要原因，而临床上至今未有根治方法。我国2型糖尿病患病率及其并发症的致残、致死率居世界首位，庞大的患病人群给家庭和社会造成巨大的经济负担。因此，寻找能够预防和干预2型糖尿病发病过程的药物并阐明其作用机制，对于提高我国人民健康水平具有非常重要的意义和紧迫性。

长久以来，医药研究者一直致力于2型糖尿病发病机制及治疗药物的研究。糖尿病发病机制复杂，包括胰岛细胞凋亡、胰岛素抵抗、炎症、肠道菌群及环境等。显然，糖尿病的发生发展是一个涉及多环节、多因素、多网络的动态过程。而当下的口服化学降糖药物多针对糖尿病发病机制中某个单一环节和靶点，在治疗上存在较大的局限性，不仅降糖效果欠佳，而且还存在低血糖、心血管事件、肝损伤、体重增加等副作用。天然药物经过几千年的实践，在防治糖尿病方面积累了大量的宝贵经验，而且药物疗效确切，副作用较小。许多发现有改善糖尿病症状的天然植物药其降糖作用是明确的。

辣木(moringaoleifera)属于辣木科(moringaceae)、辣木属(moringaadans.)，主要分布于亚洲、非洲和中美洲的热带、亚热带国家或地区,目前在我国的种植范围已发展至长江以南各省区。辣木的叶、花、荚、根及种子均具有食用和药用功能，故被称之为“神奇之树”。目前辣木已广泛应用于食品、医药、饲料、工业原料及净水等领域，具有较大的商业和工业开发潜力。近年来，鉴于辣木独特的食用功能和药用价值，其作为新型非传统食品来源的研究已在国内外引起诸多关注。辣木籽呈球形，直径约1cm，质量约为0.3g，富含蛋白质、油脂、维生素、矿质元素等营养成分，具有抗氧化、抗菌、抗癌、降血糖血脂多种生物活性。目前许多实验及临床研究证明了辣木籽具有降血糖作用,但其相关的作用机制尚不明确，且单一的药理学方法并不能完全阐释辣木籽降糖的作用机制，在糖尿病动态进程和降糖起效的过程中，辣木籽对哪些异常的代谢网络进行了调节，其完整的机制目前尚有待深入阐明。

代谢组学(metabonomics)是关于生物体系受刺激或扰动后其代谢产物(内源代谢物质)种类、数量及其变化规律的科学。代谢组学的全局、动态观念与植物药多成分作用于多靶点的整体观研究思路不谋而合，它基于系统和整体对植物药的作用机制来进行研究将有助于客观科学的反映在药物作用过程中对系统的动态调控及影响。代谢组学研究流程通常包括生物样本采集、预处理、样品分析、数据处理、标志物的鉴定及生物学意义阐释等过程。其技术主要包括核磁共振(nmr)、气相色谱-质谱(gs/ms)联用技术、液相色谱-质谱(lc/ms)联用技术等。通过多变量统计手段进行数据处理和模式识别，以此获得生物样品中全部小分子化合物的定量化学信息，然后采用化学计量学/生物信息学方法从海量的数据中总结规律，识别起效生物标志物，阐明起效所调控的代谢网络与靶点群。

在代谢组学的各种分析手段中，核磁共振技术作为一种先进的分离分析技术，基于其灵敏性、无损性以及能够根据特征峰定性的探测代谢物成分等优点，已被广泛应用于代谢组学领域的研究当中。核磁共振测定的样品为尿液、血液等容易获得的样品，且检测需要样本量较少，就可以获得提取物的结构信息，具有较好的重现性。目前运用代谢组学手段研究天然药物作用机制是基于其“多成分－多靶点”作用模式下较为科学的方法之一，有利于用现代语言表述这种整体调节的系统起效模式。目前已有报道利用代谢组学技术研究天然植物药的作用机制。zhaox等运用超高液相色谱-质谱联用技术研究了苗药灯盏细辛治疗血瘀证的作用机制，发现胆酸、苯基丙氨酸、犬尿喹啉酸在治疗后的代谢网络调控中起了重大的作用。哈木拉提·吾甫尔应用代谢组学技术发现异常黑胆质成熟剂通过调节异常黑胆质型肝癌模型的氨基酸代谢、糖代谢等能量代谢紊乱和异常黑胆质型支气管哮喘大鼠体内氨基酸代谢与能量代谢途径发挥预防和治疗的作用。天然植物药辣木籽抗糖尿病作用机制的代谢组学研究未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有药理学方法不能完整全面的阐释辣木籽发挥抗糖尿病作用机制的难点，提供一种基于代谢组学的辣木籽抗糖尿病的血清潜在标志物代谢通路及研究方法，为辣木籽进一步开发利用提供依据。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种基于代谢组学的辣木籽抗糖尿病的血清潜在标志物代谢通路及研究方法，采用核磁共振技术检测分析高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠及辣木籽干预后的血清代谢产物，获得代谢指纹图谱，利用多元变量统计分析筛选出十四个辣木籽潜在抗糖尿病相关血清标志物并进行鉴定；利用metaboanalyst在线分析软件筛选出辣木籽抗糖尿病的五个代谢通路网络并进行分析。

获得辣木籽降糖的血清潜在标志物代谢通路的具体操作步骤如下：

1.辣木籽混悬液的制备：

将剥好壳的辣木籽捣碎，研磨成100目的粉末,以适量质量浓度为1％羧甲基纤维素钠制成混悬液，其浓度为1g生药/ml，放入-20℃冰箱冻存。

2.高脂高糖饲料重量配方：基础饲料66.5％，蔗糖20％，猪油10％，胆固醇2.5％，胆酸钠1％，加水做成条状并干燥；

3.动物模型的制备：

造模大鼠选取200±20g重量的雄性sd大鼠36只，在室温为19～23℃，相对湿度为45～65％人工模拟自然环境条件下昼夜饲养，动物自由摄食饮水，适应1周后开始实验；随机取九只sd大鼠为空白组，空白组以普通饲料喂养，其余大鼠造模，4周后，造模大鼠禁食不禁水12h，以30mg·kg^-1单次小剂量腹腔注射1％stz，30min内注射完毕，之后继续以高糖高脂饲料喂养直至实验结束；空白组注射等剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作为对照；造模大鼠stz注射72h后，7天后、11天后、18天后进行尾静脉采血检测血糖。以空腹血糖大于11.1mmol/l确定为糖尿病成模大鼠。造模成功的糖尿病大鼠按随机原则分为模型组和辣木籽治疗组，每组九只大鼠，辣木籽治疗组按0.2g生药/kg/d灌胃给药，空白对照组和模型组灌胃给予相同体积质量浓度为0.9％的氯化钠溶液，连续四周；

4.大鼠血清的保存和前处理：

第四周末次给药后大鼠禁食不禁水12小时，用质量浓度为20％乌拉坦麻醉后，腹主动脉取血。血液收集后在转速3000rpm条件下离心10min，取上层血清样本保存于2ml的离心管中，每管1.5ml，冷藏于－80℃超低温冰箱。测定前从超低温冰箱取出血清样本并在冰上解冻，于4℃，12000rpm条件下离心10min以除沉淀。取0.4ml上清液移入5mm核磁样品管中，加入含四甲基硅烷0.2mg/ml的0.05ml重水中，充分混匀得到血清标本；

5.核磁共振检测：

在室温25℃条件下，用varianinova600mhznmr核磁共振仪检测步骤4的血清样本，采用(carr-purcell-merboom-gill)cpmg脉冲序列进行检测，脉冲序列可以压制水峰和大分子的信号，从而检测血清中小分子代谢物。具体参数设置如下：谱宽8000hz，采样点64k，弛豫时间为6s；采集时间为1.5s；自旋回波时间320ms，核磁共振具体参数如下：谱宽8000hz，采样点64k，采样时间4s，弛豫延迟0s，均在弛豫延迟期间采用预饱和照射水峰。

6.核磁共振¹h-nmr图谱数据预处理：

采用mestrenova核磁图谱专业处理软件对所有核磁共振¹h-nmr图谱进行相位、基线调整；在核磁共振nmr图谱中,以四甲基硅烷的化学位移δ0ppm为标准进行化学位移校正；以每段0.04ppm为单位，对δ0.01～6.00区域的谱图进行等宽度分割，去除δ4.60～5.60区域水峰，对图谱进行分段积分，将积分数据归一化处理，以txt文本格式保存。

7.利用多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物：

在获得核磁共振数据后，采用simca-p12.0软件对导入的对照组、糖尿病大鼠模型组、辣木籽治疗组三组血清样本数据进行主成分分析和偏最小方差判别分析；在三组血清样本的主成分分析pca图中，糖尿病大鼠模型组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠，说明两组代谢模式存在明显的差异，提示stz致胰岛β细胞损伤可以引起明显的生理变化；辣木籽治疗组介于空白组和糖尿病大鼠模型组之间，与空白组有部分重叠，提示辣木籽治疗后糖尿病大鼠血清代谢模式出现改变，表明辣木籽对链脲佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠的代谢紊乱有一定的干预作用；进一步采用有监督式方法进行建模分析，空白对照组、糖尿病大鼠模型组和辣木籽治疗组的偏最小方差分析pls-da图中，辣木籽治疗组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠；辣木籽治疗组介于与空白组和糖尿病模型组之间，更靠近空白组，提示辣木籽治疗后糖尿病大鼠血清代谢模式出现改变，更趋向正常，表明辣木籽有一定的抗糖尿病作用；对三组血清样本核磁共振数据进行偏最小方差分析pls-da，得到空白对照组和糖尿病大鼠模型组的偏最小方差分析pls-da载荷图，图中“s”曲线中每一个点代表1个变量，变量对分类的重要程度由相关系数的大小来衡量，变量越远离原点，相关系数值越大，对代谢物发生变化的贡献也越大，为了找到使其存在差异的潜在的生物标记物，选取s-plot上“-0.1～0.1”以外的变量作为有差异的潜在生物标记物，能够突显出空白组和糖尿病模型组差异的最大化合物，可被认为是与糖尿病代谢相关的潜在标志物，潜在生物标记物的化学位移为：0.88、0.96、0.96、1.32、1.48、2.04、2.16、3.24、3.40、3.48、3.88、3.40、3.42、3.44、3.52、3.56、3.72、3.76、3.84、3.92。

8.潜在生物标记物的鉴定及其含量变化：

查阅已有的归属文献，同时搜索http://hmdb.ca/数据库，对找到的潜在生物标记物的化学位移进行鉴定，用spss软件对这些代谢物的峰面积进行独立样本t检验，得到与对照组比较具有显著差异(p<0.05)的十四个潜在生物标志物：牛磺酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、乳酸、谷氨酰胺、缬氨酸、脂质、n-乙酰糖蛋白、亮氨酸、β-葡萄糖、甘油、肌酸和α-葡萄糖，其中脂质、亮氨酸、缬氨酸、乳酸、丙氨酸、n-乙酰糖蛋白、谷氨酰胺这七个潜在标志物含量在糖尿病大鼠模型组中均降低，经辣木籽治疗后含量升高；牛磺酸、脯氨酸、甘氨酸、甘油、肌酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖这七个潜在标志物在糖尿病大鼠模型组中均升高，经辣木籽治疗后含量降低。在metaboanalyst上对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路在线查询，有五个相关代谢通路参与了辣木籽抗高血糖的代谢过程，分别为丙氨酸-天门冬氨酸-谷氨酰胺代谢、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸合成代谢、甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢、牛磺酸-亚牛磺酸盐代谢和甘油脂代谢。

9.潜在生物标记物的分析：

进一步利用metaboanalyst对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路重要性分析，通过代谢通路分析后所得影响值大小，依据代谢通路的p值和通路重要值，缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸合成代谢、牛磺酸-亚牛磺酸盐代谢、甘油脂代谢、甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢和丙氨酸-天门冬氨酸-谷氨酰胺代谢这五个代谢通路为辣木籽抗糖尿病的重要代谢通路，参与了辣木籽抗糖尿病的主要代谢过程，形成相互交错的代谢网络，完整的阐释了辣木籽抗糖尿病的作用机制。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

(1)本发明利用核磁共振技术结合多元统计分析对糖尿病大鼠血清代谢产物进行分析，发现辣木籽抗糖尿病的相关血清潜在标志物。

(2)进一步通过该技术分析辣木籽抗糖尿病的相关血清潜在标志物的含量变化，对潜在标志物进行代谢通路分析，得到辣木籽抗糖尿病的代谢通路。

(3)从整体水平全面、快速、高效综合评价辣木籽抗糖尿病的作用机制，为天然植物药代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。

附图说明

图1是本发明的对照组、糖尿病大鼠模型组和辣木籽治疗组大鼠血清样本的核磁共振图谱。

图中，control为对照组，model为糖尿病大鼠模型组，mor为辣木籽治疗组。

图2是本发明的基于核磁共振技术的对照组、糖尿病大鼠模型组和辣木籽治疗组大鼠血清样本有监督的pls-da得分图。

图中，三角形代表对照组，圆形代表辣木籽治疗组，正方形代表糖尿病大鼠模型组。

图3是本发明的基于核磁共振技术的对照组、糖尿病大鼠模型组有监督的偏最小二乘法-判别分析载荷图。

图4是本发明使用metaboanalyst平台进行分析的代谢通路总结图。

具体实施方式：

下面结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明方法的具体实现过程如下：

一种基于代谢组学的辣木籽抗糖尿病的血清潜在标志物代谢通路及研究方法，采用核磁共振技术检测分析高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠及辣木籽干预后的血清代谢产物，获得代谢指纹图谱，利用多元变量统计分析筛选出十四个辣木籽潜在抗糖尿病相关血清标志物并进行鉴定；利用metaboanalyst在线分析软件筛选出辣木籽抗糖尿病的五个代谢通路网络并进行分析。

获得辣木籽降糖的血清潜在标志物代谢通路的具体操作步骤如下：

1.辣木籽混悬液的制备：

将剥好壳的辣木籽捣碎，研磨成100目的粉末,以适量质量浓度为1％羧甲基纤维素钠制成混悬液，其浓度为1g生药/ml，放入-20℃冰箱冻存。

2.高脂高糖饲料重量配方：基础饲料66.5％，蔗糖20％，猪油10％，胆固醇2.5％，胆酸钠1％，加水做成条状并干燥；

3.动物模型的制备：

造模大鼠选取200±20g重量的雄性sd大鼠36只，在室温为19～23℃，相对湿度为45～65％人工模拟自然环境条件下昼夜饲养，动物自由摄食饮水，适应1周后开始实验；随机取九只sd大鼠为空白组，空白组以普通饲料喂养，其余大鼠造模，4周后，造模大鼠禁食不禁水12h，以30mg·kg^-1单次小剂量腹腔注射1％stz，30min内注射完毕，之后继续以高糖高脂饲料喂养直至实验结束；空白组注射等剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作为对照。造模大鼠stz注射72h后，7天后、11天后、18天后进行尾静脉采血检测血糖了眚。以空腹血糖大于11.1mmol/l确定为糖尿病成模大鼠。造模成功的糖尿病大鼠按随机原则分为模型组和辣木籽治疗组，每组九只大鼠，辣木籽治疗组按0.2g生药/kg/d灌胃给药，空白对照组和模型组灌胃给予相同体积质量浓度为0.9％的氯化钠溶液，连续四周；

4.大鼠血清的保存和前处理：

第四周末次给药后大鼠禁食不禁水12小时，用质量浓度为20％乌拉坦麻醉后，腹主动脉取血。血液收集后在转速3000rpm条件下离心10min，取上层血清样本保存于2ml的离心管中，每管1.5ml，冷藏于－80℃超低温冰箱。测定前从超低温冰箱取出血清样本并在冰上解冻，于4℃，12000rpm条件下离心10min以除沉淀。取0.4ml上清液移入5mm核磁样品管中，加入含四甲基硅烷0.2mg/ml的0.05ml重水中，充分混匀得到血清标本；

5.核磁共振检测：

在室温25℃条件下，用varianinova600mhznmr核磁共振仪检测步骤4的血清样本，采用(carr-purcell-merboom-gill)cpmg脉冲序列进行检测，脉冲序列可以压制水峰和大分子的信号，从而检测血清中小分子代谢物。具体参数设置如下：谱宽8000hz，采样点64k，弛豫时间为6s；采集时间为1.5s；自旋回波时间320ms，核磁共振具体参数如下：谱宽8000hz，采样点64k，采样时间4s，弛豫延迟0s，均在弛豫延迟期间采用预饱和照射水峰。

6.核磁共振¹h-nmr图谱数据预处理：

采用mestrenova核磁图谱专业处理软件对所有核磁共振¹h-nmr图谱进行相位、基线调整；在核磁共振nmr图谱中,以四甲基硅烷的化学位移δ0ppm为标准进行化学位移校正；以每段0.04ppm为单位，对δ0.01～6.00区域的谱图进行等宽度分割，去除δ4.60～5.60区域水峰，对图谱进行分段积分，将积分数据归一化处理，以txt文本格式保存。

7.利用多元变量统计分析并筛选潜在生物标志物：

在获得核磁共振数据后，采用simca-p12.0软件对导入的对照组、糖尿病大鼠模型组、辣木籽治疗组三组血清样本数据进行主成分分析和偏最小方差判别分析；在三组血清样本的主成分分析pca图中，糖尿病大鼠模型组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠，说明两组代谢模式存在明显的差异，提示stz致胰岛β细胞损伤可以引起明显的生理变化；辣木籽治疗组介于空白组和糖尿病大鼠模型组之间，与空白组有部分重叠，提示辣木籽治疗后糖尿病大鼠血清代谢模式出现改变，表明辣木籽对链脲佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠的代谢紊乱有一定的干预作用；进一步采用有监督式方法进行建模分析，空白对照组、糖尿病大鼠模型组和辣木籽治疗组的偏最小方差分析pls-da图中，辣木籽治疗组与空白对照组分离良好，无交叉和重叠；辣木籽治疗组介于与空白组和糖尿病模型组之间，更靠近空白组，提示辣木籽治疗后糖尿病大鼠血清代谢模式出现改变，更趋向正常，表明辣木籽有一定的抗糖尿病作用；对三组血清样本核磁共振数据进行偏最小方差分析pls-da，得到空白对照组和糖尿病大鼠模型组的偏最小方差分析pls-da载荷图，图中“s”曲线中每一个点代表1个变量，变量对分类的重要程度由相关系数的大小来衡量，变量越远离原点，相关系数值越大，对代谢物发生变化的贡献也越大，为了找到使其存在差异的潜在的生物标记物，选取s-plot上“-0.1～0.1”以外的变量作为有差异的潜在生物标记物，能够突显出空白组和糖尿病模型组差异的最大化合物，可被认为是与糖尿病代谢相关的潜在标志物，潜在生物标记物的化学位移为：0.88、0.96、0.96、1.32、1.48、2.04、2.16、3.24、3.40、3.48、3.88、3.40、3.42、3.44、3.52、3.56、3.72、3.76、3.84、3.92。

8.潜在生物标记物的鉴定及其含量变化：

查阅已有的归属文献，同时搜索http://hmdb.ca/数据库，对找到的潜在生物标记物的化学位移进行鉴定，用spss软件对这些代谢物的峰面积进行独立样本t检验，得到与对照组比较具有显著差异(p<0.05)的十四个潜在生物标志物：牛磺酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、乳酸、谷氨酰胺、缬氨酸、脂质、n-乙酰糖蛋白、亮氨酸、β-葡萄糖、甘油、肌酸和α-葡萄糖，其中脂质、亮氨酸、缬氨酸、乳酸、丙氨酸、n-乙酰糖蛋白、谷氨酰胺这七个潜在标志物含量在糖尿病大鼠模型组中均降低，经辣木籽治疗后含量升高；牛磺酸、脯氨酸、甘氨酸、甘油、肌酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖这七个潜在标志物在糖尿病大鼠模型组中均升高，经辣木籽治疗后含量降低。在metaboanalyst上对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路在线查询，有五个相关代谢通路参与了辣木籽抗高血糖的代谢过程，分别为丙氨酸-天门冬氨酸-谷氨酰胺代谢、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸合成代谢、甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢、牛磺酸-亚牛磺酸盐代谢和甘油脂代谢。

9.潜在生物标记物的分析：

进一步利用metaboanalyst对鉴定的潜在生物标记物进行代谢通路重要性分析，通过代谢通路分析后所得影响值大小，依据代谢通路的p值和通路重要值，缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸合成代谢、牛磺酸-亚牛磺酸盐代谢、甘油脂代谢、甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢和丙氨酸-天门冬氨酸-谷氨酰胺代谢这五个代谢通路为辣木籽抗糖尿病的重要代谢通路，参与了辣木籽抗糖尿病的主要代谢过程，形成相互交错的代谢网络，完整的阐释了辣木籽抗糖尿病的作用机制。

本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。