一种羟基自由基的比色检测方法及其应用与流程

本发明属于检测技术领域，尤其涉及一种羟基自由基的比色检测方法及其应用。

背景技术

活性氧(ros)由氧气还原形成，其分为自由基氧和非自由氧两大类。ros在环境和生物过程中起重要作用，其中，羟基自由基(·oh)具有最强的反应活性，因此也常被认为是对生物体最具危害性的活性氧。·oh自由基可导致细胞中脂质、蛋白质、核酸和其他生物分子的氧化损伤。过量接触·oh自由基会导致细胞死亡，这一过程通常与多种疾病的发生与发展有关¹。但是，·oh自由基并不总是有害的，利用·oh促进物质的氧化降解是消除环境污染的重要方法，如通过光电反应产生的·oh自由基可用于水体中有机污染物的降解。此外，·oh自由基是癌症放射治疗(例如x-ray)过程中的主要活性氧成分之一，其起到杀死肿瘤细胞的作用^2-3。因此，·oh自由基的检测至关重要。

由于羟基自由基寿命极短且反应过程不易控制，这给·oh的检测带来困难⁴。目前国内外已经建立了若干种·oh自由基的检测方法，其包括电化学法^5-6、电子自旋共振法(epr)^7-8、化学发光法^9-11、紫外-可见光谱法和荧光光谱法^12-16以及基于纳米颗粒的荧光探针法^17-21。基于电化学和电子自旋共振的检测方法，因其选择性差以及操作过程复杂等原因，其在实际检测中并不常用。近年来发展起来的基于荧光的检测方法，虽然具有可在细胞内进行检测的优点，但是大多数荧光体系的建立依赖于复杂的有机合成过程，且检测高度依赖于仪器的辅助。

紫外-可见光谱法是一种可视化比色检测法，其已被用于各类检测物的分析，其中包括活性氧物质。前人研究发现亚甲基蓝可被fenton反应产生的自由基氧化降解形成无色产物，为可视化检测提供了可能¹⁵。金属染料复合物固蓝bb盐(fbbs)亦可通过与fenton产生的·oh自由基反应生产无色产物进而实现·oh自由基的检测¹⁴。但是由于反应的复杂性和褪色型方法的固有缺点，这两种方法的检测灵敏度非常有限，仅适用于几十微摩尔每升浓度范围内的检测。因此，仍然需要更灵敏和更可靠的比色检测法来实现·oh自由基浓度的测定。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种羟基自由基的比色检测方法及其应用，该检测方法更灵敏和更可靠。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种羟基自由基的比色检测法，其包括以下步骤：

s1)配置羟基自由基标准液；

s2)向羟基自由基标准液和样品中分别加入硝基咪唑溶液，反应生成亚硝酸根离子；

s3)再将步骤s2反应生成的亚硝酸根离子加入对氨基苯磺酰胺磷酸溶液和n-1-萘基乙二胺水溶液的混合溶液中，室温避光条件下反应后测定吸光值；

s4)绘制羟基自由基标准液的标准曲线，并计算样品中羟基自由基的浓度。

本发明比色检测方法是在传统griess方法的基础上建立了一种简单且灵敏的·oh自由基检测方法nim-griess法，检测过程中使用三种试剂：与羟基自由基反应生产亚硝酸根的硝基咪唑、与亚硝酸根离子反应生成活性重氮盐的对氨基苯磺酰胺以及与重氮盐反应形成红色产物的n-1-萘基乙二胺。在nim-griess比色检测中，羟基自由基与硝基咪唑的硝基取代碳原子发生加成反应，进而导致亚硝酸根释放，亚硝酸根可通过griess试剂进行定量。

无色griess试剂与亚硝酸根离子反应形成红色的偶氮化合物，且变色的程度与亚硝酸根的浓度呈正相关，因此通过可视化比色法可以间接的反映羟基自由基的浓度。本发明研究发现，nim-griess法可以用于比色法分析fenton反应和x射线辐射产生的羟基自由基。更重要的是，该方法亦被成功的应用于检测经典抗疟药物青蒿素在活化过程中生成的低浓度羟基自由基。

作为上述技术方案的改进，所述羟基自由基标准液的浓度为0～25μm。

作为上述技术方案的改进，所述硝基咪唑为5-硝基咪唑或2-硝基咪唑，硝基咪唑溶液的溶剂为纯水或磷酸缓冲液。

作为上述技术方案的改进，在步骤s3)中，反应的温度为25℃，反应的时间为10min，测定吸光值采用的波长为540nm。

另外，本发明还提供所述的比色检测方法用于检测fenton反应、x射线照射或青蒿素生成的羟基自由基。

另外，本发明还提供一种用于检测羟基自由基的试剂盒，其包括羟基自由基标准品溶液、硝基咪唑溶液、对氨基苯磺酰胺磷酸溶液和n-1-萘基乙二胺水溶液，所述对氨基苯磺酰胺磷酸溶液呈酸性。

作为上述技术方案的改进，所述羟基自由基标准液的浓度为0～25μm。

作为上述技术方案的改进，所述硝基咪唑为5-硝基咪唑或2-硝基咪唑，硝基咪唑溶液的溶剂为纯水或磷酸缓冲液。

本发明的有益效果在于：本发明提供一种羟基自由基的比色检测法及其应用，检测试剂中的硝基咪唑与·oh自由基反应释放亚硝酸根(亚硝酸根储存较稳定，代替寿命较短的·oh自由基)，然后进行标准的griess亚硝酸根定量，最终的偶氮产物呈现红色，且在540nm处具有最大吸光值；该方法不仅可以通过uv-vis，还可以通过简单的肉眼识别来检测·oh自由基；另外，本发明提供了一种简单、直观且易于商品化的试剂盒。

附图说明

图1显示羟基自由基的检测示意图；

图2显示giress反应的检测标准曲线，其中检测反应的温度为25℃；

图3显示羟基自由基反应生成亚硝酸根离子的机理；

图4显示fenton反应中羟基自由基的检测结果；其中，图4a显示5-nim(250μm)和2-nim(250μm)与fenton反应产生的·oh自由基反应生成亚硝酸根离子，图4b显示eppendorf管中griess试剂与亚硝酸根反应时的颜色变化(管1至管5分别对应0、5、10、25、50μmfenton反应产物)，图4c显示540nm处的吸光值与·oh自由基浓度(0～25μm)呈正相关(5-nim的工作浓度为250μm)，图4d显示当·oh自由基为0～25μm时，540nm处的吸光值(对应于亚硝酸根的释放)与·oh的浓度呈较好的线性关系(r²＝0.998)，检测反应温度为25℃；

图5显示x射线和硝基咪唑对羟基自由生成的影响；其中，图5a显示水辐射分解过程中产生·oh自由基的机理，图5b显示在x射线(25gy)照射下不同浓度5-nim(0、2、5、20、50、200、500μm)亚硝酸根的生成量，图5c显示50μm5-nim溶液中亚硝酸根的生成量与x射线剂量(0～50gy)呈正相关，测试反应温度为25℃；

图6显示硝基咪唑与·oh自由基生成亚硝酸根具有高度的选择性和特异性；其中，图6a显示dmso可以终止nim-griess对羟基自由基的特异性响应，图6b显示nim-griess可以选择性的响应羟基自由基(fenton反应)，而不响应于其他种类的ros：双氧水(h2o2)、过氧叔丁醇(tbhp)、单线态氧(¹o2)、超氧阴离子(o2^-)和次氯酸(hocl)；反应液中5-nim浓度250μm，羟基自由基的理论浓度25μm，h2o2、tbhp、hocl的浓度均为100μm，¹o2和o2^-参照文献报道的步骤得到¹⁶，检测反应的温度为25℃；

图7显示羟基自由生成亚硝酸根的稳定性，其中，5-nim(50μm)在50gyx-ray照射之后，不同时间段用griess试剂进行亚硝酸根测定，辐照后的5-nim溶液储存在4℃下，检测反应的温度为25℃；

图8显示氯化血红素催化活化青蒿素释放·oh自由基；其中，图8a显示青蒿素释放羟基自由基的机理，图8b显示青蒿素(500μg/ml)、氯化血红素(100μm)体系释放的·oh自由基与5-nim(250μm)反应释放亚硝酸根，图8c显示5-nim/dha/hemin体系中亚硝酸根的释放与dha的浓度呈正相关。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

一种羟基自由基的比色检测法，其包括以下步骤：

s1)配置羟基自由基标准液；

s2)向羟基自由基标准液和样品中分别加入硝基咪唑溶液，反应生成亚硝酸根离子；

s3)再将步骤s2反应生成的亚硝酸根离子加入对氨基苯磺酰胺磷酸溶液和n-1-萘基乙二胺水溶液的混合溶液中，室温避光条件下反应后测定吸光值；

s4)绘制羟基自由基标准液的标准曲线，并计算样品中羟基自由基的浓度。

如图1所示，本发明比色检测方法是在传统griess方法的基础上建立了一种简单且灵敏的·oh自由基检测方法-nim-griess法，检测过程中使用三种试剂：与羟基自由基反应生产亚硝酸根的硝基咪唑(r1)、与亚硝酸根离子反应生成活性重氮盐的对氨基苯磺酰胺(r2)以及与重氮盐反应形成红色产物(azo)的n-1-萘基乙二胺(r3)。

1.实验材料与仪器

四水合氯化亚铁购自alfaaesar(chinalimited，shanghai)，griess试剂r3：n-1-萘基乙二胺水溶液购自cayman(michigan，usa)，青蒿素、对氨基苯磺酰胺、过氧化氢(30％)和其他化学品购自adamas(中国上海)，96孔板购自thermofisher，所有试剂无需进一步纯化直接使用；在整个实验中使用来自milli-qplus系统的蒸馏去离子水配制溶液，96孔板比色法的数据收集在多功能酶标仪-victortmx3(thermofisher)上进行。

2.1griess反应和标准曲线的建立

nim-griess包含新引入的·oh自由基反应分子5-硝基咪唑(r1)和经典griess试剂：对氨基苯磺酰胺磷酸溶液(1％)r2和n-1-萘基乙二胺水溶液r3(0.1％)。r3购自cayman并直接用于测试。按照标准程序，将500mg对氨基苯磺酰胺溶解在50ml磷酸溶液(5％)配制成r2。在测试之前将r2和r3按1：1的比例混合，96孔板中每孔添加100μlr2和r3混合物，然后添加50μl含亚硝酸根的样品进行检测。在酸性条件下，亚硝酸根离子将与r2反应形成活性重氮盐，进一步与r3反应形成红色偶氮产物，该产物在540nm处具有最大吸收。将96孔板在室温且遮光条件下放置10分钟，然后通过酶标仪记录540nm处的吸光值。为了建立亚硝酸根检测的标准曲线，新鲜制备一系列浓度的亚硝酸钠溶液，然后各取50μl加入到griess试剂中用于比色定量。每次测试设定三次重复，每孔在540nm处的吸收值减去试剂对照组的吸收值，然后以该吸收值和相对应的亚硝酸根浓度分别为y轴和x轴作图。

如图2所示，540nm处的吸收值和亚硝酸根浓度(0～100μm)呈极好的线性关系(y＝0.000302+0.00467x，r²＝0.999)。

2.2fenton反应中羟基自由基的检测

硝基咪唑及其衍生物作为放射增敏剂已经有数十年的历史，但其敏化机制尚未完全清楚。以往有研究发现硝基咪唑水溶液在离子辐照过程中可以释放亚硝酸根离子，推测其机理与羟基自由基的加成反应有关²²。如图3所示，硝基取代的咪唑环5位上的碳原子具有极强的亲电性，其首先与羟基自由基反应形成加成中间体。中间体结构不稳定进而释放亚硝酸根，同时羟基取代的咪唑环在溶液中的氧气或者活性氧作用下变成如图所示的内酰胺自由基化合物。

将硝基咪唑(500μm2-nim或5-nim)和fecl2(400μm)溶液混合，向该混合物中加入不同浓度的过氧化氢(h2o2)，然后加入纯水定容，使硝基咪唑和fecl2的最终浓度分别为250μm和200μm，室温下静置5分钟。取100μl新鲜制备的griess试剂于96孔板中，加入50μl上述fenton反应液，于室温25℃下放置10分钟。通过酶标仪记录540nm处的吸光值。每组测试进行三次重复。如无特殊说明，实验所涉及的griess测试均在上述反应条件下进行。

利用亚铁离子催化的fenton反应产生·oh自由基是最广泛使用的模型反应，常用于·oh自由基探针的研发中。一般认为，h2o2在亚铁离子催化下，几乎可以定量的转化为·oh自由基。本发明研究发现2-nim(2-硝基咪唑)和5-nim(2-硝基咪唑)溶液都可以与fenton产生的·oh自由基发生反应，进而释放亚硝酸根。如图4所示，当·oh自由基的浓度低于10μm时，相同浓度的2-nim和5-nim溶液释放亚硝酸根的能力接近；当·oh自由基从10μm增加到100μm时，5-nim溶液比2-nim溶液释放出更多的亚硝酸根；当·oh自由基浓度超过50μm时，2-nim和5-nim释放曲线逐渐均趋于平缓，这可能因为在高浓度的羟基自由基存在下，溶液中一些非特异性反应的发生概率增大。当·oh自由基浓度为0～25μm时，540nm处的吸收值(对应亚硝酸根离子与griess试剂反应生成的红色偶氮产物)与·oh自由基浓度呈良好的线性关系，r²＝0.998。

另外，检测限cmin＝3σ/b，其中，σ是在没有任何分析物存在的情况下的三次单独测量(在540nm处的吸光值)获得的标准偏差，b是线性拟合所得直线的斜率，据线性拟合方程计算其检测限cmin为0.398μm，这与大多数新近报道的荧光探针的检测限接近^16-17。此外，在检测过程中观察到明显的颜色变化，进而可用于裸眼可视化检测。这种可视化比色检测比绝大多数已经报道的方法在技术层面上更容易实现。

2.3x-ray辐射水分解过程中羟基自由基的检测

1)将5-nim溶解在磷酸缓冲液pbs(ph＝7.4)中制备系列不同浓度的溶液，检测x射线照射下水辐射分解过程中产生的·oh自由基。同时为了验证亚硝酸根释放是否依赖于x射线剂量，将5-nim的浓度固定为50μm。将溶液配制在1.5ml塑料离心管中，用于x-光照射实验。x射线剂量设定为0、5、25、50gy，其中1gy定义为每千克物质吸收一焦耳辐射能量。肿瘤放疗过程中所采用的单次治疗剂量通常为0至20gy，本发明辐照实验采用临床上常用的光子束能量为6mev的x射线源。

硝基咪唑通过释放亚硝酸根并形成咪唑自由基被认为是其起到放疗增敏作用的机理之一。·oh自由基是水辐射分解过程中的主要自由基，可以直接从水分子的辐射分解产生，也可以间接由水合电子和水分子之间的后续反应产生。如图5所示，在25gy的固定辐射剂量下，从5-nim溶液中释放的亚硝酸根离子随5-nim浓度增加而增加；当浓度超过200μm时，亚硝酸根离子释放量趋于一致，主要是因为200μm的5-nim对于在25gy照射下释放的·oh自由基来说已经过饱和；将5-nim的浓度固定为50μm研究亚硝酸根离子释放与x射线剂量的关系，随着x射线剂量增加，亚硝酸根离子释放也随之增加，亚硝酸根离子的释放与x射线剂量呈良好的线性关系(r²＝0.988)。研究证实，本发明改进的nim-griess方法可以通过测量辐射产物·oh自由基测定x射线的能量递送。

2)dmso可以选择性地淬灭·oh自由基，被广泛用于·oh自由基的研究；检测dmso对nim-griess羟基自由基的特异性响应，以及nim-griess反应是否可以选择性与其他种类ros进行响应。

如图6所示，同样条件下往反应液中加入4％dmso，则几乎检测不到亚硝酸根释放；实验证明dmso通过中和·oh自由基，阻碍了·oh与硝基咪唑的反应，从而抑制亚硝酸根的释放；另外，过氧化氢(h2o2)、过氧叔丁醇(tbhp)、单线态氧(¹o2)、超氧阴离子(o2^-)和次氯酸(hocl)等氧化剂均不能导致亚硝酸根的释放。因此，实验证实硝基咪唑响应·oh自由基进而释放亚硝酸根具有高度的选择性和特异性。

3)对x-ray辐照产生的·oh自由基进行测量有两个主要的挑战：一是x-ray射线下的测量操作需要尽可能的简单以避免辐射对人体的伤害；二是·oh自由基衰减极快，检测需要形成相对稳定的可检测的中间体，以便后续分析。nim-griess正好可以同时满足这两点要求。测试时，只需要配制相应浓度的5-nim溶液，并将其暴露于x-ray辐照下。因为亚硝酸根在室温或者4℃储存条件下相对稳定，所产生的亚硝酸根可以在辐照过后的数小时内进行测定。如图7所示，对5-nim(50μm)pbs溶液进行50gy的x-ray照射，在随后的30分钟，6小时和24小时分别进行亚硝酸根的定量，亚硝酸根的浓度在数小时内均没有显著性差异。因此，通过将短寿命的·oh自由基转化为相对稳定的亚硝酸根，然后再进行可视化比色检测。

2.4青蒿素产生的·oh自由基的检测

用超纯水配制青蒿素(art)和双氢青蒿素(dha)溶液，氯化血红素hemin母液(1mm)用0.5mnaoh溶液制备(其在中性ph条件下溶解度较差)。为了进行检测，首先将art或dha与5-nim(250μm)混合，再加入氯化血红素溶液使之工作浓度为100μm。反应在在1.5ml离心管中于37℃下进行20分钟。反应完成后，采用上文提到的相同方法定量溶液中产生的亚硝酸根离子。100μm的血红素可以在540nm处产生少量背景吸收，计算时将从实验组数值中减去该背景吸收。

鉴于nim-griess法在fenton反应和x射线照射系统中检测·oh自由基的优异性能，我们进一步探索利用该方法来回答经典抗疟药青蒿素类药物作用机制研究中的问题。尽管青蒿素及其衍生物是最常用的一线抗疟疾药物，但它们的作用机制尚未完全明朗^23-24。普遍认为青蒿素类药物在血红蛋白或游离亚铁离子的催化活化过程中会产生ros和烷基自由基，这可能是青蒿素体现其生物活性的机制之一²⁵。但是，青蒿素活化过程到底释放出哪种类型的ros仍然未知。为此我们采用nim-griess测试青蒿素的活化能否释放出具有较高细胞毒性的·oh自由基。

如图8b所示，只有art和dha存在时，反应液才能释放亚硝酸根，说明在青蒿素活化过程中能产生·oh自由基；如图8a所示，推测该过程首先始于铁离子催化下，青蒿素分子中的过氧桥的断裂及过氧化物中间体的形成，该过氧化物中间体进行类似fenton反应的过程进而产生·oh自由基；如图8b所示，5-nim与500μg/mldha反应可以释放24.1μm亚硝酸根，而与art反应仅释放10.6μm亚硝酸根，结果表明art和dha生成·oh自由基的效率不一样，·oh自由基释放的差异可能是源于它们的过氧桥反应活性的不同；如图8c所示，从dha释放的·oh自由基的量随着dha浓度的增加而呈现增加趋势，表明本发明检测方法可用于青蒿素类反应生成的低浓度羟基自由基，在一定程度上也可以用于青蒿素类分子的检测。

本发明提供一种羟基自由基的可视化比色检测法-nim-griess，检测试剂中的硝基咪唑与·oh自由基反应释放亚硝酸根(亚硝酸根储存较稳定，代替寿命较短的·oh自由基)，然后进行标准的griess亚硝酸根定量，最终的偶氮产物呈现红色，且在540nm处具有最大吸光值。因此，该方法不仅可以通过uv-vis，还可以通过简单的肉眼识别来检测·oh自由基。nim-griess可以高灵敏度且高选择性地检测fenton反应中的·oh自由基，检测限低至纳摩尔水平；nim-griess还被成功的用于x-ray辐照过程中产生的·oh自由基的检测，进而可以监测电离辐射期间的能量递送；在氯化血红素催化下，经典药物青蒿素和双氢青蒿素均可以释放·oh自由基，首次阐明·oh自由基可能是青蒿素活化过程中重要的活性氧成分；art和dha生成·oh自由基的效率不同，可能暗示它们的过氧桥结构在反应活性上具有差异。总之，本发明提供了一种简单、直观且易于商品化的·oh自由基的检测方法和试剂盒。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

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