研究离体百合植株同化物运输方向和路径的荧光示踪方法与流程

本发明涉及植物细胞生理学研究技术，尤其涉及一种基于离体模式体系的百合小鳞茎发育过程中同化物运输方向和路径的荧光示踪方法。

背景技术：

百合被誉为“球根花卉之王”，是百合科(liliaceae)百合属(lilium)所有种、亚种、变种、变型及品种的统称。百合以观花为主，是世界五大鲜切花之一。百合不仅可以观花，其鳞茎含丰富的淀粉，部分品种可供食用或药用，也可提取香料，应用价值广泛。球根花卉种球自然繁殖率较低，童期长，因此新品种育种周期较长，例如，百合约12～15年，郁金香约20～30年。球根类植物的健壮生长与地下储藏器官的大小直接相关，百合的地下部分--鳞茎有着极大的研究及开发价值。

“源”通常指植物体内能产生碳水化合物的光合组织，如叶片，茎等；“库”主要为碳水化合物的积累和使用组织，碳水化合物用于生长、贮藏和呼吸作用等包括快速生长的组织、地下贮藏器官、根、遮阴状态下或老的叶片等。离体体系下，碳水化合物的“源”包括来自叶的光合产物及培养基中的蔗糖成分，经韧皮部运输进入鳞茎贮藏或进一步利用，不仅成为百合鳞茎品质和其他营养成分合成的基础原料，而且可作为重要的信号分子参与鳞茎发育过程相关基因的表达、鳞茎“源-库”角色的转换以及整个植物源-库活性的调节。高等植物中，物质运输主要在维管束中进行，韧皮部则是负责同化物在体内运输的主要组织。百合鳞茎“源-库”角色转化过程中，韧皮部同化物运输途径主要有共质体途径(symplastic)和质外体途径(apoplastic)。共质体途径是通过胞间连丝进行的，质外体途径则是跨膜运动，需要特定的载体和以及能量的驱动。百合鳞茎与以往所研究的单独作为“源”，如成熟叶片，和单独作为“库”如发育的果实不同，前者只存在同化物的装载和运出过程，后者则只存在同化物的卸载、积累和再利用等过程。百合鳞茎作为多年生的“源-库”复合体，在其生长发育过程中会经历多次“源-库”角色的转换，转换过程中碳水化合物的代谢对于植物的生长及开花的品质具有重要的作用，因此探明百合鳞茎源库转化过程中同化物运输方向及路径对于促进鳞茎内糖的积累和转化，对于优质百合鳞茎和切花都具有重要的理论意义和实践价值。

百合鳞片由表皮、薄壁组织、维管束和初生分生组织构成，在薄壁组织内分布着的维管束与表皮平行排列成1排，并且鳞片中部维管束大且分布稀疏，至两边维管束变小且分布密集，这些维管束源源不断地为百合鳞茎的生长发育提供必需的物质。羧基荧光素(carboxyfluoreseein)，简称cf，是5-和6-羧基代替的荧光素混合物，通常以酯类或以弱酸的形式进行装载；例如5(6)羧基荧光素酯，5(6)-carboxyfluoreseindiacetate(缩写cfda，市售商品)。当不具有荧光的膜透过性cfda进入细胞后，便分解成膜不透过性荧光染料5(6)-cf，因而只能通过胞间连丝等共质体途径在细胞和组织间进行转运，因此被广泛用作共质体转运标记的探针，主要用于标记细胞间转运，细胞融合，及茎和叶中共质体的连续性等方面的研究。5(6)-cf已被广泛用来作为研究植物体内韧皮部共质体卸载和韧皮部转运的荧光指示剂，目前己在核桃、葡萄，苹果，梨、等果实中研究了果实发育过程中同化物由源-叶，运输到库-果实中的路径和卸载，同时还用cf研究了大麦和烟草库叶中韧皮部共质体卸载路径，微繁组培作为多种植物尤其是百合，生产和常用体系，但离体百合鳞茎cfda荧光染色还未有报道。通过在荧光显微镜下观察cf在植株内的分布情况，就可以了解植物体内同化物运输路径，比传统的显微放射自显影技术更安全、更简单。

但是，申请人在以离体百合小鳞茎为研究材料时发现，由于离体百合小鳞茎对于无菌环境的要求较高，而且在cfda标记过程中，若通过其他作物上采用的电流注射法、压力注射法和显微注射法则需要专门的设备且技术要求高，而eppendorf管棉线渐渗法和叶片涂抹法虽然不需要专门的设备，但操作过程繁琐、容易伤及植株内部结构，且荧光染料溶液蒸发，都达不到理想的标记效果。为此，申请人通过实验建立了一种更为有效的、可快速示踪离体百合小鳞茎内同化物运输方向和路径的荧光标记方法，获得了理想的结果，具有实践应用价值。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种研究离体百合植株同化物运输方向和路径的荧光示踪方法。该方法可快速了解百合鳞茎发育过程中同化物的运输方向和路径，具有操作简单、方便实用及结果理想等优点。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种研究离体百合植株同化物运输方向和路径的荧光示踪方法，包括以下步骤：

(1)准备植株和染料

(1.1)以生长于培养基中的离体百合鳞茎作为待处理植株；

(1.2)配制质量浓度为1～2mg/ml的cfda荧光染料溶液；取120μlcfda溶液，将医用药棉浸润至饱和；

(2)将染料引入植株

(2.1)选择离体百合鳞茎的外层鳞片或叶片作为引入部位，用双面刀在鳞片中部横切0.3mm宽的楔形切口，深度以贯穿维管束为准；或者，选择百合离体植株的叶片作为引入部位，用耐水细砂纸将叶背末端轻轻摩擦至磨破维管束；

(2.2)将浸润了cfda溶液的医用药棉塞进鳞片切口，或平铺在叶片维管束横断面处；用石蜡封口膜包裹鳞片或叶片后，先以丙酮浸润的医用药棉封塞再用石蜡封口膜包裹(防止溶液外渗)；最后用锡箔纸覆盖鳞片或叶片的切口部位，防止cfda见光分解；

(2.3)将处理后的离体百合鳞茎置于原培养基中，并以原培养条件继续培养72h；

(3)采样和制备切片

将百合离体植株从培养基中取出，洗净并擦干后，在拟观察部位取样；

用双面剃须刀片对取样进行徒手切片操作，切片立即置于滴有80％甘油液滴的载玻片(防止cfda卸出丢失)；使切片平铺在载玻片的中央，盖上盖玻片；

(4)观察与拍照

用荧光显微镜观察羧基荧光素(cf)在切片内的分布图像，根据观察对象调整目镜和物镜倍数，对观察到的样本进行拍照(观察拍照的操作应动作连贯迅速，防止荧光淬灭)。

本发明中，所述cfda荧光染料溶液中，溶质为5(6)羧基荧光素酯，溶剂为丙酮，或者溶剂为dmso与纯水1∶1体积比的混合液。

本发明中，所用医用药棉需经过121℃高温灭菌。

本发明中，步骤(3)中在取样时，拟观察部位是植株的鳞片、鱗茎盘、根或叶片。

本发明中，步骤(3)中在取样时，直接对植株的拟观察部位徒手横切或纵切，制备徒手切片；取样的切片大小为0.2cm×1cm×2cm。

本发明中，步骤(4)中在观察时，采用488nm激光激发，并以蓝色滤光片检测图像。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、该方法采用的荧光染料cfda对细胞无毒、化学惰性，且量子产率比较高，在尽量不损害卸载机制的情况下，可从活细胞水平适时追踪不同发育时期百合鳞茎内同化物的运输方向和路径，比传统的显微放射自显影技术更安全、更简单。

2、该方法具有现有技术不具有的优点：如荧光示踪剂的引入不需要专门的设备和装置、操作简单、不易伤及植株体、荧光溶液不易蒸发等优点，在荧光观察过程中也不需样品的特殊处理、成本低廉，可快速、有效地获得理想的标记结果，已在离体体系下对多种百合进行研究，包括野百合、巨球百合以及商品种“索邦”均适用。

3、应用该方法示踪百合鳞茎发过程中同化物的运输方向，有助于认识百合鳞茎形成中同化物在库源中的转运与积累机制，为百合鳞茎的优质健壮提供理论依据。

附图说明

图1为荧光显微镜观察的离体百合鳞茎内cf分布图像。

其中，a根横切片结果；b根纵切片结果；c外层鳞片切片结果；d中层鳞片横切切片结果；e中层鳞片纵切切片结果；f叶片切片结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例子对本发明的实现过程进行描述：

一、准备植株和染料

1、选择生长于培养基中的离体百合鳞茎作为待处理植株，处于任意生长阶段的健康无菌的离体百合植株均可用于本发明的操作；

2、用丙酮或体积比为1∶1的dmso与纯水混合液去溶解荧光染料cfda，配成1～2mg/ml的cfda溶液，避光备用。荧光染料cfda不溶于水，可根据用量分装后置于-20℃冰箱避光保存，最好是即用即配。

二、将染料引入植株

1、选择离体百合鳞茎的鳞片作为引入部位，用双面刀在鳞片中部横切0.3mm宽的楔形切口，深度以贯穿维管束为准；或者，选择离体百合鳞茎的叶片作为引入部位，用耐水细砂纸将叶背末端轻轻摩擦至磨破维管束；

2、取120μlcfda溶液，将医用药棉浸润至饱和，塞进鳞片切口，或平铺在叶片维管束横断面处；用石蜡封口膜包裹鳞片或叶片后，先以丙酮浸润的医用药棉封塞再用石蜡封口膜包裹；最后用锡箔纸覆盖鳞片或叶片的切口部位，防止cfda见光分解；所用医用药棉需经过121℃高温灭菌。

3、将处理后的离体百合鳞茎置于原培养基中，并以原培养条件继续培养72h；

三、采样和制备切片

将离体百合鳞茎从培养基中取出，洗净并擦干后，迅速放入冰盒，在拟观察部位(中层鳞片、外层鳞片、鱗茎盘、根、叶片等部位)取样；取样时，直接对植株的拟观察部位进行徒手横切或纵切，制备徒手切片；取样的切片大小为0.2cm×1cm×2cm。

用双面剃须刀片对取样进行徒手切片操作，切片立即置于滴有80％甘油液滴的载玻片；使切片平铺在载玻片的中央，盖上盖玻片；

四、观察与拍照

制备好切片后，立即用目镜10×，物镜20×的荧光显微镜观察cf在植株各部分内的分布图像，并对观察到的样本进行拍照防止荧光淬灭。在观察时，可采用488nm激光激发，并以蓝色滤光片检测图像。

荧光显微镜观察的离体百合鳞茎内cf分布图像见图1。观察结果显示：荧光示踪剂cf已经被运输到植株的根部外层、中层鳞片、及叶片，且荧光示踪剂有较聚集地区，亦有较分散地区，说明同化物在离体百合鳞茎内的运输路径主要为质外体途径。