消咳喘糖浆近红外定量校正模型的构建方法及消咳喘糖浆的检测方法与流程

本发明涉及近红外检测领域，特别涉及消咳喘糖浆近红外定量校正模型的构建方法及消咳喘糖浆的检测方法。

背景技术

寒痰，以痰质清稀色白的痰为特征。如由外感风寒而致病的，必伴有恶寒、发热、头痛、喉痒、咳嗽等症状。由脾肾虚寒引起的，则出现恶寒肢冷，神倦纳呆，脉沉缓等症状。

咳嗽(cough)是呼吸道疾病中最常见症状之一。这是人体的一种保护性措施，借以排除自外界侵入呼吸道的异物及呼吸道中的分泌物，消除呼吸道刺激因子，在防御呼吸道感染方面具有重要意义。另一方面，咳嗽也是有害的。它可使呼吸道内的感染扩散；使胸内压增高，加重心脏负担，对心力衰竭患者不利。剧烈的咳嗽可能使已受损的呼吸道出血；也可使胸膜下气肿泡破裂，发生自发性气胸。长期咳嗽是促进肺气肿形成的一个因素；频繁的咳嗽也可引起呕吐，影响睡眠，消耗体力。从流行病学看，咳嗽可使含有致病原的分泌物播散。引起疾病传播。

慢性支气管炎是气管、支气管黏膜及周围组织的慢性非特异性炎症。临床以咳嗽、咳痰为主要症状，每年发病持续3个月，连续2年或2年以上。需要进一步排除具有咳嗽、咳痰、喘息症状的其他疾病(如肺结核、尘肺、肺脓肿、心脏病、心功能不全、支气管扩张、支气管哮喘、慢性鼻咽炎、食管反流综合征等疾患)。缓慢起病，病程长，反复急性发作而病情加重。主要症状为咳嗽、咳痰，或伴有喘息。急性加重系指咳嗽、咳痰、喘息等症状突然加重。急性加重的主要原因是呼吸道感染，病原体可以是病毒、细菌、支原体和衣原体等。

消咳喘糖浆，功能止咳、祛痰、平喘。可用于寒痰咳嗽、慢性支气管炎。

消咳喘糖浆中总黄酮的测定采用紫外-可见分光光度计法；杜鹃素的含量采用高效液相色谱法。现有的紫外-可见分光光度计法及高效液相色谱法测定消咳喘糖浆含量指标耗时耗力、样品处理复杂、成本高。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一种消咳喘糖浆近红外定量校正模型的构建方法及消咳喘糖浆的检测方法。本发明提供的检测方法分析快速、样品处理简单、无需消耗试剂、绿色环保。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种消咳喘糖浆近红外定量校正模型的构建方法，取消咳喘糖浆，以总黄酮和杜鹃素作为关键质控指标，分别经高效液相色谱检测、紫外-可见光分光光度计法检测和近红外光谱检测，获得相应的高效液相色谱检测结果、紫外-可见光分光光度计法检测结果和近红外光谱结果，经偏最小二乘法、交叉-验证法获得消咳喘糖浆近红外定量校正模型。

在本发明的一些具体实施方案中，杜鹃素采用高效液相色谱法测定，所述高效液相色谱的条件为：

色谱柱为ace-c18(250mm×4.6mm，5μm)；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水(60:40)为流动相；检测波长为250～300nm；流速0.5～1.5ml/min；柱温25～35℃；优选的，检测波长为295nm；流速1ml/min；柱温30℃；理论塔板数按杜鹃素峰计算应不低于3000。

在本发明的一些具体实施方案中，总黄酮采用紫外-可见光分光光度计法检测，具体为：取总黄酮对照品溶液梯度稀释，与三氯化铝溶液、醋酸钾溶液、60％乙醇混合；以不加三氯化铝溶液、醋酸钾溶液的相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法，于420nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

量取消咳喘糖浆，按标准曲线制备方法，制成供试品溶液。另取消咳喘糖浆，加60％乙醇，作空白，按照紫外-可见分光光度法，于420nm波长处测定吸光度，根据所述标准曲线，获得总黄酮的含量。

在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱检测中杜鹃素对照品溶液的制备方法为：取杜鹃素对照品，加甲醇制成每lml含10μg杜鹃素的溶液；

所述紫外-可见光分光光度计法检测中总黄酮对照品溶液的制备方法为：取芦丁对照品，加60％乙醇制成每1ml含芦丁60μg的溶液。

在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱检测中杜鹃素供试品溶液的制备方法为：量取消咳喘糖浆，加甲醇，摇匀，滤过，取续滤液，制成杜鹃素供试品溶液；

所述紫外-可见光分光光度计法检测中总黄酮供试品溶液的制备方法为：量取消咳喘糖浆，加60％乙醇，与三氯化铝溶液、醋酸钾溶液混合，制成总黄酮供试品溶液。

在本发明的一些具体实施方案中，所述近红外光谱检测包括光谱采集、光谱预处理的步骤；

所述光谱采集为：取消咳喘糖浆，在25℃±5℃条件下，采用漫反射内置光源采集近红外光谱，以空气为参比背景，扫描次数为200～400，扫描光谱范围为1100～2300nm，扫描间隔为1～3nm。

在本发明的一些具体实施方案中，所述光谱预处理为：将所述光谱采集的原始光谱，通过反射比到吸光度的格式转化，再进行一阶微分9点平滑法处理。

在本发明的一些具体实施方案中，所述获得消咳喘糖浆近红外定量校正模型具体为：用unscrambler定量分析软件，采用偏最小二乘法、交叉-验证法，将预处理后光谱数据与样品标准方法测定的含量数据关联，建立各指标的校正模型。

在本发明的一些具体实施方案中，消咳喘糖浆中总黄酮含量模型为：内部验证直线方法为y＝0.9840x+0.037，外部验证直线方程为y＝0.9591x+0.096，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9920，外部验证决定系数r²＝0.9738，rmsep＝0.0210。

在本发明的一些具体实施方案中，消咳喘糖浆中杜鹃素含量模型为：内部验证直线方法为y＝0.9964x+0.00，外部验证直线方程为y＝0.9804x+0.00，内部验证决定系数r²＝0.9982，外部验证决定系数r²＝0.9920，rmsep＝0.0029。

本发明还提供了一种消咳喘糖浆的检测方法，按照本发明所述的构建方法获得消咳喘糖浆近红外定量校正模型，将消咳喘糖浆待测样品的近红外光谱数据导入所述消咳喘糖浆近红外定量校正模型，获得所述待测样品中杜鹃素和总黄酮的含量。

本发明提供的消咳喘糖浆近红外定量校正模型的构建方法为：取消咳喘糖浆，以总黄酮和杜鹃素作为关键质控指标，分别经高效液相色谱检测、紫外-可见光分光光度计法检测和近红外光谱检测，获得相应的高效液相色谱检测结果、紫外-可见光分光光度计法检测结果和近红外光谱结果，经偏最小二乘法、交叉-验证法获得消咳喘糖浆近红外定量校正模型。本发明建立的模型预测精度高，准确度高，满足实际生产中定量分析的要求；该方法与传统药典方法相比，在保证准确度的基础上，大大提高了分析效率，可以快速、高效地对产品质量进行控制，从而有利于保证产品质量的安全性、稳定性和有效性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例所述消咳喘糖浆近红外原始吸收光谱图；

图2示实施例所述消咳喘糖浆总黄酮的建模结果图；

图3示实施例所述消咳喘糖浆杜鹃素建模结果图。

具体实施方式

本发明公开了一种消咳喘糖浆近红外定量校正模型的构建方法及消咳喘糖浆的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种快速测定消咳喘糖浆中总黄酮及杜鹃素含量的近红外快速测定方法，采用如下步骤：

(1)高效液相色谱法测定消咳喘糖浆总杜鹃的含量：精密量取消咳喘糖浆2～10(优选3)ml，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。用hplc测定消咳喘糖浆中杜鹃素含量，得到样品杜鹃素含量的化学值。

(2)紫外-可见分光光度计方测定消咳喘糖浆中总黄酮的含量：精密量取消咳喘糖浆1～10(优选2)ml，置50ml量瓶中，加60％乙醇至刻线，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加0.1mol/l三氯化铝溶液2ml、1mol/l醋酸钾溶液3ml，加60％乙醇至刻度，摇匀，放置30min，制成供试品溶液。另精密量取消咳喘糖浆2ml，置50ml量瓶中，加60％乙醇稀释至刻度，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加60％乙醇至刻度，摇匀，作空白，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，即得。

(3)采集消咳喘近红外光谱：取消咳喘糖浆约6ml，于15ml离心管中，将近红外探头深入液面以下，并保证糖浆完全包裹探头，以空气为参比，扣除背景后采集近红外光谱，得到样品近红外光谱图。

(4)在1100～2300nm扫描，扫描间隔为1.0～3.0nm，扫描平均次数为200～400次。每个样品测定3次，得到消咳喘糖浆光谱图。利用snap软件中的光谱处理程序，采用一阶导数9点平滑法(savitzky-golay)对原始光谱进行预处理，消除颜色差别等因素引起的光谱基线偏移和漂移。用unscrambler定量分析软件，采用偏最小二乘法、交叉-验证法，将预处理后光谱数据与样品标准方法测定含量数据关联，建立各指标的校正模型。

采用光谱影响值leverage和化学值误差residual等统计量检验，剔除nir光谱与测定结果的异常值，并根据模型主要参数进行筛选选优化，确定nir检测模型。

(5)按照步骤(4)所述的方法对未知的消咳喘糖浆进行近红外光谱扫描，并将得到的特征光谱信息导入建立的定量校正模型获得所述未知消咳喘糖浆样品的总黄酮及杜鹃素的含量。

作为优选，步骤(3)所述主要参数是指：内外部验证决定系数(r²)、预测标准偏差(rmsep)。

作为优选，所述样品集中的样品不少于50个。

本发明提供的消咳喘糖浆样品的总黄酮及杜鹃素的含量的近红外快速测定方法，具体为：

(1)精密量取消咳喘糖浆2～10(优选3)ml，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。用hplc测定消咳喘糖浆中杜鹃素含量，得到样品杜鹃素含量的化学值。

所述的高效液相色谱条件为：色谱柱为ace-c18(250mm×4.6mm，5μm)；甲醇-水(60:40)为流动相；检测波长为250～300nm；流速0.5～1.5ml/min；柱温25～35℃；优选的，检测波长为295nm；流速1ml/min；柱温30℃。理论板数按杜鹃素峰计算应不低于3000。

(2)紫外-可见分光光度计方测定消咳喘糖浆中总黄酮的含量：精密量取消咳喘糖浆1～10(优选2)ml，置50ml量瓶中，加60％乙醇至刻线，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加0.1mol/l三氯化铝溶液2ml、1mol/l醋酸钾溶液3ml，加60％乙醇至刻度，摇匀，放置30min，制成供试品溶液。另精密量取消咳喘糖浆2ml，置50ml量瓶中，加60％乙醇稀释至刻度，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加60％乙醇至刻度，摇匀，作空白，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，即得。

所述的标准曲线绘制方法为：精密量取对照品溶液(取芦丁对照品适量，精密称定，加60％乙醇制成每1ml含芦丁60μg的溶液，即得。)0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml与5ml，分别置10ml量瓶中，各加0.1mol/l三氯化铝溶液2ml、1mol/l醋酸钾溶液3ml，加60％乙醇至刻度，摇匀，放置30min；以相应试剂为空白。照紫外-可见分光光度法，在420nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

(3)采集消咳喘近红外光谱：取消咳喘糖浆约6ml，于15ml离心管中，将近红外探头深入液面以下，并保证糖浆完全包裹探头，以空气为参比，扣除背景后采集近红外光谱，得到样品近红外光谱图。

(4)在1100～2300nm扫描，扫描间隔为1～3nm，扫描平均次数为200～400次。每个样品测定3次，得到消咳喘糖浆样品光谱图。利用snap软件中的光谱处理程序，采用一阶导数9点平滑法(savitzky-golay)对原始光谱进行预处理，消除颜色差别等因素引起的光谱基线偏移和漂移。用unscrambler定量分析软件，采用偏最小二乘法、交叉-验证法，将预处理后光谱数据与样品标准方法测定含量数据关联，建立各指标的校正模型。

采用光谱影响值leverage和化学值误差residual等统计量检验，剔除nir光谱与测定结果的异常值，并根据模型主要参数进行筛选优化，确定nir检测模型。

(5)对未知的消咳喘糖浆进行近红外光谱扫描，并将得到的特征光谱信息导入建立的定量校正模型获得所述未知消咳喘糖浆中杜鹃素及总黄酮含量。

所述的外部验证，具体方法是利用校正模型对验证集光谱进行预测，即将验证集样品的近红外光谱值代入步骤(4)得到的最终的近红外定量校正模型中，获得预测化学值，将预测化学值与步骤(1)及(2)对应的验证集样品的化学值进行统计分析，通过分析结果判定模型的预测准确度。

本发明提供的消咳喘糖浆近红外定量校正模型的构建方法及消咳喘糖浆的检测方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

本发明使用的主要设备如下：

近红外光谱仪型号：aotf便携式luminar-5030型近红外光谱分析仪(美国brimrose公司)，样品检测皿，snap光谱分析软件，camo化学计量学软件；戴安u3000高效液相色谱仪(美国thermo公司)，紫外检测器，chromeleon7色谱工作站；ultra-6100型紫外-可见分光光度计(普源精电科技有限公司)。

本实施例在样品集的样品中选择校正集样品50个，验证集样品10个。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1总黄酮的含量测定

对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，精密称定，加60％乙醇制成每1ml含芦丁60μg的溶液，即得。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml与5ml，分别置10ml量瓶中，各加0.1mol/l三氯化铝溶液2ml、1mol/l醋酸钾溶液3ml，加60％乙醇至刻度，摇匀，放置30min；以相应试剂为空白。照紫外-可见分光光度法，在420nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

测定法：精密量取本品2ml，置50ml量瓶中，加60％乙醇至刻线，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，制成供试品溶液。另精密量取本品2ml，置50ml量瓶中，加60％乙醇稀释至刻度，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加60％乙醇至刻度，摇匀，作空白，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，即得。

实施例2杜鹃素的含量测定

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(60:40)为流动相；检测波长为295nm。理论板数按杜鹃素峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：取杜鹃素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含10μg的溶液即得。

供试品溶液的制备：精密量取本品3ml，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注人液相色谱仪，测定，即得。

实施例3光谱预处理

在建立模型前，需要消除噪音和基线漂移等因素对光谱采集的影响。利用snap软件中的光谱处理程序，采用一阶导数9点平滑法(savitzky-golay)对原始光谱进行预处理，消除颜色差别等因素引起的光谱基线偏移和漂移。

实施例4模型建立及验证

将各指标测定结果与经过预处理光谱进行关联，采用unscrambler定量分析软件，以偏最小二乘法(pls)和交叉-验证法(cross-validation)建立各指标校正模型。采用光谱影响值leverage和化学值误差residual等统计量检验，剔除nir光谱与标测定结果的异常值，并根据模型主要参数：内外部验证决定系数(r²)、预测标准偏差(rmsep)等，进行筛选优化，确定nir检测模型。

nir光谱模型结果显示，消咳喘中总黄酮含量模型，内部验证直线方法为y＝0.9840x+0.037，外部验证直线方程为y＝0.9591x+0.096，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9920，外部验证决定系数r²＝0.9738，rmsep＝0.0210；杜鹃素含量模型，内部验证直线方法为y＝0.9964x+0.00，外部验证直线方程为y＝0.9804x+0.00，内部验证决定系数r²＝0.9982，外部验证决定系数r²＝0.9920，rmsep＝0.0029。表明参与建模的总黄酮含量及杜鹃素含量与其nir光谱相关性较好，所建立的nir检测模型性能良好。

利用已建立的指标模型，随机抽取未参与建模的样品进行分析，验证样品与建模样品光谱采集参数设置的一致性，获得各指标的预测结果，计算预测值与实测值偏差，验证模型准确性。

利用nir检测模型，对未参与建模的10批次样品进行分析，各指标的预测结果见表1、表2。

表1用于模型精确度检验的消咳喘糖浆中总黄酮含量的测定值和对应的近红

外模型测定值(％)

表2用于模型精确度检验的消咳喘糖浆中杜鹃素含量的测定值和对应的近红

外模型测定值(％)

通过结果可知，10批次验证样品中总黄酮含量预测值与hplc实测值偏差平均值为0.68％，杜鹃素含量预测值与hplc实测值偏差平均值为4.27％，均小于5％，由此可见，消咳喘糖浆总黄酮及杜鹃素含量nir检测模型预侧值与常规检测方法测定值之间相关性良好，测定准确性较高，可以采用nir光谱模型快速检测分析消咳喘糖浆总黄酮及杜鹃素含量。

对已建立的消咳喘糖浆总黄酮及杜鹃素定量模型，分别采用10批未参与建模的样品进行外部验证，结果证明nir技术预测结果与紫外-可见分光光度计法及高效液相色谱法测定结果基本一致，无明显偏差。nir快速检测准确度较高，可替代液相及紫外分光光度计分析。

实施例5与原有检测技术对比评价

在应用及相关耗材方面也进行了对比，具体见表3.

表3检测技术对比

注：*示与传统方法相比，具有显著差异(p＜0.05)；^#示与传统方法相比，具有极显著差异(p＜0.01)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。