一种检测真菌的荧光染色液的制作方法

本发明属于检测领域，具体涉及一种检测真菌的荧光染色液的配置方法。

背景技术：

真菌属于真核生物，没有质体，营养方式为吸收，无吞噬作用。细胞壁含有甲壳质和β-葡聚糖。可引起人类，动物的疾病，称为真菌病，还可引起植物的疾病、人类过敏性疾病和真菌毒素中毒症。真菌侵犯人体常继发于其他疾患，如恶性肿瘤、糖尿病等慢性消耗性疾病；大剤量x线照射；免疫抑制剂等导致免疫功能和抵抗力低下；大量应用肾上腺皮质激素的病人，其炎症反应多受抑制，也容易感染真菌；另外器官移植、导管插管、放疗等应用引起局部组织损伤，为真菌的入侵提供了条件。近年来由于免疫缺陷病毒感染者的不断出现，使原来不致病的真菌转为致病真菌。因此，真菌感染已经成为一个日益严峻的问题。

真菌分为浅部真菌和深部真菌。浅部真菌:主要侵犯机体皮肤，寄生和腐生于表皮，毛发和甲板的角质组织中，引起浅部真菌病，简称癣病。临床最多见的浅部真菌病有:体癣、股癣、手癣和足癣。

真菌感染在常用的检测方法包括：直接镜检法(如koh涂片或乳酸酚棉蓝涂片)及染色镜检法。其中，直接镜检法缺点在于阳性率较低，阴性结果也不能排除诊断，背景杂乱，灵敏度低，漏检率高，对操作人员专业识别能力要求高。一般的染色镜检法包括：革兰染色、吉姆萨染色、pas法、六胺银法(gms)、银氨液浸染法(g-s)、gridley染色法、粘蛋白卡红(mayer’smucicarminstain)染色法、巴氏染色法等。这几种特殊染色法优点在于：在控制好染色细节的前提下，可染出漂亮的真菌形态，容易辨识。缺点在于：1.对操作人员专业技能要求比较高。2.操作繁琐，用时长(1小时左右)3.配套所需试剂多，贮存管理麻烦。

技术实现要素：

真菌为真核生物，细胞壁中含较多的几丁质及纤维素等β-多糖类物质。而荧光增白剂可与人体各类组织或样本(包括皮屑、甲屑、毛发、尿液、体液以及阴道分泌物等)中可能存在的细胞壁β-多糖类物质特异性的结合，从而标记荧光进行检测。各种丝状真菌及酵母菌均可以被荧光染色，包括念珠菌属、毛癣菌属、表皮癣菌属、小孢子菌属、组织胞浆菌属、曲霉属等。真菌菌丝的不同发育阶段均可被荧光染色，有助于病理诊断。荧光染色法亲和力高，反应时间只需数十秒钟即可完，大大提高临床真菌检测灵敏度和效率。在荧光显微镜特定的激发光波段下(340～400nm)，菌丝或孢子发出明亮的蓝绿色荧光，真菌轮廓和黑暗背景可形成强烈对比反差，真菌形态结构较koh湿片法更为清晰，非常便于找寻和识别。而且真菌荧光染色液也含10％koh，溶解角质，使组织透化。值得注意的是，荧光染色法也能标记植物纤维素，空气和玻片上存在的少量纤维，在荧光显微镜下发荧光。但纤维形态一般不规则，大小、粗细、亮度等都与真菌有很大差异，没有典型的真菌横隔和出芽结构，凭经验一般可以避免假阳性情况的发生。本产品为单剂型染色液，不仅在操作上与koh法步骤一致，只需数十秒即可镜下观测(甲屑需延长1～2min)。而且标本中菌丝、孢子荧光标记后结构清晰，显著提高了菌体辨识度。

一种检测真菌的荧光染色液，荧光染色液由以下配方按照重量百分比混合而成：荧光增白剂280.001-0.003％、氢氧化钾5-15％、二甲基亚砜3-6％、氯化钠2-5％、甘油5-15％、伊文思蓝0.01-0.03％，余量为纯化水。

一种检测真菌的荧光染色液，荧光染色液由以下配方按照重量百分比混合而成：荧光增白剂280.001％、氢氧化钾10％、二甲基亚砜4％、甘油10％、伊文思蓝0.01％，余量为纯化水。

所述荧光染色液配置方法为：

(1)称取相应重量的氢氧化钾加入部分水进行充分搅拌溶解散热，待冷却至室温后，加入二甲基亚砜、氯化钠和甘油，搅拌均匀至无分层现象，此时会放热，冷却至室温备用，得到透明无色清澈液体，命名为甲液；

(2)称取相应重量的荧光增白剂28加入部分水中进行充分搅拌溶解，应为透明无色或淡黄色清澈液体，命名为乙液；

(3)称取相应重量的伊文思蓝加入部分水中进行充分搅拌溶解，得到蓝紫色无析出物颗粒清澈液体，命名为丙液；

(4)将乙液加入至甲液充分混匀，确保容器内无固体沉淀或絮状物，得到透明无色或淡黄色清澈液体，命名为丁液；

(5)最后将丙液与丁液混合，既得荧光染色液。

各配料的主要作用：

荧光增白剂：与真菌细胞壁β-多糖类物质特异性的结合，从而标记荧光进行检测，在荧光显微镜特定的激发光波段下(340～400nm)，菌丝或孢子发出明亮的蓝绿色荧光。

氢氧化钾：溶解角质，使组织透化

二甲基亚砜：促进荧光增白剂在氢氧化钾溶液中溶解，同时帮助荧光增白剂渗透进入样本中。

氯化钠：提高荧光增白剂28与真菌细胞壁结构的结合强度，在紫外荧光激发的情况下，可以让菌体结构突显的更加清晰可见、立体，更方便识别真菌。

甘油：保湿，保持滴了染色液的样本一定时间的湿度，便于镜下观察。

伊文思蓝：弱化杂乱背景，使背景与真菌对比明显，便于识别。

本发明的有益效果

1、操作简单便捷，只需数十秒，极大的降低了操作人员的工作强度，可实现大量样本的快速作业。

2、菌丝和孢子结构清晰可见，易于识别真菌，灵敏度高，提高了染色结果判读的准确率和效率。

3、检出率高，适用范围广。

4、创造性的加入了氯化钠可提高荧光增白剂28与真菌细胞壁结构的结合强度，在紫外荧光激发的情况下，可以让菌体结构突显的更加清晰可见、立体，更方便识别真菌。

说明书附图

图1.足部皮屑(×10)；

图2.手部皮屑(×10)；

图3.指甲屑(×40)；

图4.阴道分泌物(×40)；

图5.阴道分泌物(×10)；

图6.腹股沟皮屑(×10)；

图7.阴道分泌物(×10)；

图8.阴道分泌物(×10)；

图9.手部皮屑(×10)；

图10.甲屑(×10)。

具体实施方式

实施例1

荧光染色液由以下配方按照重量百分比混合而成：荧光增白剂280.001％、氢氧化钾10％、二甲基亚砜4％、氯化钠3.6％、甘油10％、伊文思蓝0.01％，余量为纯化水；所述荧光染色液配置方法为：

(1)称取相应重量的氢氧化钾加入部分水进行充分搅拌溶解散热，待冷却至室温后，加入二甲基亚砜、氯化钠和甘油，搅拌均匀至无分层现象，此时会放热，冷却至室温备用，得到透明无色清澈液体，命名为甲液；

(2)称取相应重量的荧光增白剂28加入部分水中进行充分搅拌溶解，应为透明无色或淡黄色清澈液体，命名为乙液；

(3)称取相应重量的伊文思蓝加入部分水中进行充分搅拌溶解，得到蓝紫色无析出物颗粒清澈液体，命名为丙液；

(4)将乙液加入至甲液充分混匀，确保容器内无固体沉淀或絮状物，得到透明无色或淡黄色清澈液体，命名为丁液；

(5)最后将丙液与丁液混合，既得荧光染色液。

对皮屑、甲屑、阴道分泌物进行检测，其检测效果见说明书附图1-5。从附图上可以看出菌丝和孢子结构清晰可见，易于识别真菌。

实施例2

未添加氯化钠的荧光染色液由以下配方按照重量百分比混合而成：荧光增白剂280.001％、氢氧化钾10％、二甲基亚砜4％、甘油10％、伊文思蓝0.01％，余量为纯化水；所述荧光染色液配置方法为：

(1)称取相应重量的氢氧化钾加入部分水进行充分搅拌溶解散热，待冷却至室温后，加入二甲基亚砜和甘油，搅拌均匀至无分层现象，此时会放热，冷却至室温备用，得到透明无色清澈液体，命名为甲液；

(2)称取相应重量的荧光增白剂28加入部分水中进行充分搅拌溶解，应为透明无色或淡黄色清澈液体，命名为乙液；

(3)称取相应重量的伊文思蓝加入部分水中进行充分搅拌溶解，得到蓝紫色无析出物颗粒清澈液体，命名为丙液；

(4)将乙液加入至甲液充分混匀，确保容器内无固体沉淀或絮状物，得到透明无色或淡黄色清澈液体，命名为丁液；

(5)最后将丙液与丁液混合，既得荧光染色液。

对皮屑、甲屑、阴道分泌物进行检测，其检测效果见说明书附图6-10。从附图上可以看出能够识别真菌，但菌丝和孢子结构清晰度较实施例1中要差，菌丝结构不清晰，荧光强度也较弱。

实施例3

从医院获取197例已经有koh湿片法镜检结果的阴道分泌物样本，同时进行“金标准”真菌培养法、真菌荧光染色镜检法和未添加氯化钠荧光染色液镜检法，具体操作步骤为：

一、真菌培养法

1.提前半小时打开超净工作台紫外灯消毒灭菌，操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

2.拿出配置好的培养基，与妇科样本相对应进行编号。

3.按照对应编号，打开平板先在其上滴一滴已灭菌的生理盐水，将采样拭子蘸上生理盐水后均匀涂布在平板上，盖上培养皿盖，将采样拭子放回原管中。

4.倒置培养皿于33℃生化培养箱中培养24～72h，期间观察培养皿内菌落生长情况。

二、真菌荧光染色镜检法

1.将样本转圈均匀涂至载玻片中间，

2.滴加真菌荧光染色液，盖上盖玻片，镜检。

三、未添加氯化钠的真菌荧光染色液镜检法

1.将样本转圈均匀涂至载玻片中间，

2.滴加未添加氯化钠的真菌荧光染色液，盖上盖玻片，镜检。结果如下：

表1

表2

以上数据表明真菌荧光染色镜检法灵敏度(70.18％)远高于koh湿片法(47.37％)，同时较未添加氯化钠的真菌荧光染色镜检法的灵敏度(61.4％)也高出近10％。

临床现用传统的方法(koh湿片法)的漏检率为17.75％，未添加氯化钠的真菌荧光染色液镜检法漏检率为(13.66％)，而真菌荧光染色镜检法将漏检率降至10.9％。准确度真菌荧光染色液镜检法最高(90.86％)。