本发明属于荧光传感器领域，具体涉及了一种基于竞争性识别的荧光传感器的构建方法及其在胰岛素检测中的应用。
背景技术：
胰岛素，由胰岛β细胞分泌的一种重要的蛋白激素，对代谢及其他身体机能有着广泛影响。它不仅能使肝脏、肌肉和其他脂肪组织中的细胞从血液中吸收葡萄糖，转化为糖原作为能量来源或转化为其他储存在细胞内的营养物质，还能促进葡萄糖的氧化分解释放能量来维持生命活动。胰岛素是由51个氨基酸组成的多肽，由21个残基的a链和30个残基的b链通过两个二硫键连接而成。胰岛素可以作为胰岛素瘤和外伤性糖尿病的预测指标。据报道，一旦禁食条件下血液中胰岛素浓度低于0.86ng/ml，人们会因葡萄糖代谢不良而出现一些严重的疾病和功能障碍。近年来，全世界糖尿病的发病率正在上升，糖尿病会导致失明，肾功能衰竭，心脏疾病和中风，在临床研究中，已明确证实胰岛素缺乏可诱发糖尿病。与此同时，胰岛素作为控制血糖最主要的药物，且胰岛素的作用不依赖于胰岛功能而存在。胰岛素也属于内源性肽类激素兴奋剂，对于人体能起到兴奋作用。因此，灵敏的检测胰岛素对于疾病的早期诊断和治疗具有重要的意义，这将会改善疾病层理和治疗疗效，促进疾病研究的发展。
近十年来，各种各样的检测方法，包括基于放射免疫测定、质谱、表面等离子体共振、高效液相色谱、毛细管电泳和电化学方法已被用于胰岛素的测定。这些技术为实现胰岛素检测奠定了良好的基础。然而，这些方法都有着自己的优势与不足，如设备昂贵，操作繁琐，检出限不高等，因此设计一种快速、简洁、高灵敏度检测胰岛素的方法是非常重要的。
技术实现要素：
本发明旨在解决现有胰岛素检测方法过于复杂、检测速度慢及对胰岛素识别性较低的问题，而提供一种基于竞争性识别的荧光传感器的构建方法。
本发明基于竞争性识别的荧光传感器的构建方法采用温和的水热反应制备荧光传感器--阳离子柱[6]芳烃/还原氧化石墨烯复合材料cp6@rgo；检测时，以cp6@rgo为主体，罗丹明b（rhb）为荧光指示剂，构建rhb-cp6@rgo，根据其荧光“开-关-开”原理来定量检测胰岛素；cp6和rgo之间通过π-π堆积和静电相互作用形成受体，荧光染料分子rhb首先结合受体材料发生荧光共振能量转移致荧光猝灭，然后当竞争分析物胰岛素加入其中时，荧光染料分子将会被分析物所替代，使rhb的荧光强度恢复，因此利用胰岛素使rhb荧光强度恢复这样的荧光变化信号来定量检测胰岛素；本发明克服了现有技术的胰岛素检测方法过于复杂、检测速度慢及对胰岛素识别性较低的缺陷；本发明方法简单、方便、快速、可控性高、高效，适于工业化生产及具有广阔的市场应用前景。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
本发明荧光传感器的制备方法如下：
（1）将氢醌二（2-羟基乙基）醚、三苯基膦、无水乙腈依次放入烧瓶中，用冰水浴冷却，搅拌混匀后，加入四溴化碳，室温下搅拌反应，待反应完全后向混合物中加入冷水淬灭反应，得到白色沉淀，过滤收集沉淀物，用甲醇水溶液洗涤3~4次，用甲醇重结晶，干燥后制得化合物1，其中氢醌二（2-羟基乙基）醚与三苯基膦的质量比为0.1~1:1，氢醌二（2-羟基乙基）醚与四溴化碳的质量比为0.1~0.5:1；
所述甲醇水溶液是甲醇和水按体积比3:2混合制得；
（2）将化合物1、多聚甲醛加入到烧瓶中，用氯仿作为溶剂，然后向其中加入三氟化硼乙醚，氮气条件下室温搅拌反应，反应完全后加水淬灭，萃取并收集有机相，无水硫酸钠干燥有机相后，减压浓缩除去溶剂得到粗产品；粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到白色固体2；其中化合物1与多聚甲醛的质量比为10~50:1，化合物1与三氟化硼乙醚的质量比为0.5~2:1；
（3）将乙醇、化合物2、三甲胺加入到烧瓶中，80~100℃回流反应12~48h，反应结束后冷却至室温，减压浓缩除去溶剂，残留固体溶于水中，过滤除去不溶物质，所得滤液经减压浓缩得到白色固体阳离子柱[6]芳烃（cp6），其中化合物2与三甲胺的质量比为100~150:1；
（4）在水中加入氧化石墨烯、阳离子柱[6]芳烃，超声混匀后氢氧化钠调节混合溶液ph至12，然后将调好ph的溶液转移至圆底烧瓶中，70~90℃回流反应3~5小时，反应结束后冷却至室温，离心，沉淀用超纯水离心清洗3~4次，制得基于竞争性识别的荧光传感器；
所述氧化石墨烯在水中的终浓度为0.5~1mg/ml，阳离子柱[6]芳烃在水中的终浓度为0.5~1mg/ml。
本发明另一目的是将上述方法制得的基于竞争性识别的荧光传感器应用在胰岛素（ins）检测中，利用荧光“开-关-开”的方式来定量检测胰岛素，以cp6@rgo为主体，荧光指示剂为罗丹明b（rhb），利用cp6@rgo荧光传感器溶液猝灭rhb荧光，然后通过加入胰岛素使rhb荧光强度恢复，根据荧光强度变化与胰岛素加入浓度的线性关系来定量检测胰岛素。
本发明的胰岛素荧光传感器灵敏度高；利用cp6@rgo溶液猝灭rhb荧光，然后通过加入胰岛素使rhb荧光强度恢复，根据荧光强度变化与胰岛素加入浓度的线性关系来定量检测胰岛素；这种基于rhb@cp6@rgo的复合传感界面，比普通的复合传感界面，灵敏度更高、稳定性更好；本发明方法在常温常压下进行、简单、快速、可控性高，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为化合物1的1hnmr（a）和13cnmr（b）；
图2为化合物2的1hnmr（a）和13cnmr（b）；
图3为化合物cp6的1hnmr（a）和13cnmr（b）；
图4为基于rhb-cp6@rgo构建的荧光传感器检测胰岛素的示意图；
图5为rgo、cp6和cp6@rgo的红外光谱图；
图6为本发明实施例4cp6@rgo猝灭rhb的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；
图7为本发明实施例5胰岛素对rhb-cp6@rgo的荧光恢复光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；
图8为rhb-cp6@rgo体系荧光强度恢复的程度与胰岛素浓度的线性关系示意图；
图9为rhb与cp6的结合常数双倒数图，其中a图为荧光吸收曲线，b图为rhb与cp6之间的结合常数；
图10为ins与cp6的结合常数双倒数图，其中a图为荧光吸收曲线，b图为胰岛素与cp6之间的结合常数；
图11为rhb-cp6@rgo传感器对ins识别的抗干扰性能。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不限于所述内容，实施例中如无特殊说明，均为常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规试剂或按常规方法配制的试剂；实施例中所使用的化学试剂和溶剂均为分析纯；所述搅拌采用磁力搅拌器搅拌方式；所述的荧光光谱测定条件均为发射波长500-700nm，激发波长为250-550nm，狭缝宽度为10nm。
实施例1：本基于竞争性识别的荧光传感器的构建方法如下：
（1）将10g氢醌二（2-羟基乙基）醚、12.5g三苯基膦、150ml无水乙腈依次放入烧瓶中，用冰水浴冷却，搅拌混匀后，加入25g四溴化碳，室温下搅拌反应5小时，待反应完全后向混合物中加入冷水淬灭反应，得到白色沉淀，过滤收集沉淀物，用甲醇水溶液（体积比3:2）洗涤4次，用甲醇重结晶，干燥后制得化合物1；化合物1的核磁共振谱图1hnmr和13cnmr（图1）；
（2）将5g化合物1、0.92g多聚甲醛加入到烧瓶中，300ml氯仿为溶剂，再加入4.38g三氟化硼乙醚，氮气保护条件下室温反应3小时，反应完全后加水淬灭反应，萃取并收集有机相，无水硫酸钠干燥有机相后，减压浓缩除去溶剂得到粗产品；粗产品经硅胶柱层析，石油醚和二氯甲烷的混合液（石油醚:二氯甲烷体积比=1:1，洗脱液）洗脱，收集洗脱液干燥得到白色固体化合物2，化合物2的1hnmr和13cnmr（图2）；
（3）将50ml乙醇、1.0g化合物2、6.4ml（24mmol/l）三甲胺加入到烧瓶中，混合物90℃回流24小时，反应结束后冷却至室温，减压浓缩除去溶剂，残留固体溶于20ml水中，过滤除去不溶物质，所得滤液经减压浓缩得到白色固体cp6，化合物cp6的1hnmr和13cnmr（图3）；
（4）取氧化石墨烯（go）、阳离子柱[6]芳烃（cp6）各10mg，分散于20ml超纯水中，超声混合均匀，用1mol/l的naoh调节混合溶液ph至12，然后将调好ph的溶液转移至100ml圆底烧瓶中，于90℃条件下回流反应4小时，反应结束后冷却至室温，离心，沉淀用超纯水离心清洗3次，制得基于竞争性识别的荧光传感器；在不加cp6的条件下，采用相同的方法制备还原氧化石墨烯（rgo）（图4为cp6@rgo荧光传感器的制备及使用原理）；
图5为rgo、cp6、cp6@rgo的红外光谱图，其中rgo基本没有明显的红外吸收峰。cp6，cp6@rgo中出现了相同的吸收峰，3328.28cm-1为cp6中c-n键的伸缩振动峰，1613.92cm-1，1455.57cm-1，1401.17cm-1为苯环的骨架振动特征吸收峰；比较cp6、cp6@rgo，两者谱图的差异可能是由于石墨烯负载的影响，这些特征峰的存在可以基本判断cp6与rgo成功复合。
实施例2：本基于竞争性识别的荧光传感器的构建方法如下：
（1）将15g氢醌二（2-羟基乙基）醚、35g三苯基膦、300ml无水乙腈依次放入圆底烧瓶中，用冰水浴冷却，搅拌混匀后，加入75g四溴化碳，室温下搅拌反应4小时，待反应完全后向混合物中加入250ml冷水淬灭反应，得到白色沉淀，过滤收集沉淀物，用甲醇水溶液（体积比3:2）洗涤3次，用甲醇重结晶，干燥后白色晶体15.6g，化合物1的1hnmr和13cnmr（图1）；
（2）将4g化合物1、1g多聚甲醛加入到烧瓶中，350ml氯仿为溶剂，再加入5g三氟化硼乙醚，氮气保护条件下室温反应3小时，反应完全后加水淬灭反应，萃取并收集有机相，无水硫酸钠干燥有机相后，减压浓缩除去溶剂得到粗产品，粗产品经硅胶柱层析，石油醚和二氯甲烷的混合液（石油醚:二氯甲烷体积比=1:1，洗脱液）洗脱，收集洗脱液干燥得到白色固体化合物2，化合物2的1hnmr和13cnmr（图2）；
（3）将80ml乙醇、1.5g化合物2、8ml（24mmol/l）三甲胺加入到烧瓶中，混合物95℃回流15小时，反应结束后冷却至室温，减压浓缩除去溶剂，残留固体溶于25ml水中，过滤除去不溶物质，所得滤液经减压浓缩得到白色固体cp6；化合物cp6的1hnmr和13cnmr（图3）；
（4）取氧化石墨烯（go）、阳离子柱[6]芳烃（cp6）各15mg，分散于25ml超纯水中，超声混合均匀，用1mol/l的naoh调节混合溶液ph至12，然后将调好ph的溶液转移至100ml圆底烧瓶中，于85℃条件下回流反应4小时，反应结束后冷却至室温，离心，沉淀用超纯水离心清洗4次，制得基于竞争性识别的荧光传感器。
实施例3：罗丹明b与阳离子化柱[6]芳烃，胰岛素与阳离子化柱[6]芳烃的结合常数的实验
向2ml10μmol/lrhb溶液中分次加入2μmol/l的cp6溶液，每次添加10μl，得到一组荧光吸收曲线，根据曲线作出相应的相关线性关系（图9a），从而计算出rhb与cp6之间的结合常数ka1（图9b），此过程激发波长为510nm。同样的方法向2ml10μmol/lcp6溶液中分次加入2μmol/l胰岛素溶液，每次添加10μl，得到一组荧光吸收曲线（图10a），同样根据曲线作出相应的线性关系，计算出cp6与ins之间的结合常数ka2（图10b）；cp6与ins之间的结合常数ka2大于rhb与cp6之间的结合常数ka1；以上主客体之间的不同竞争关系为ins将rhb从cp6的空腔中挤出来奠定了实验基础。
实施例4：cp6@rgo荧光传感器对rhb荧光的淬灭
用超纯水配制浓度为800μmol/lrhb作为储备液待用，在10ml的试管中，加入rhb储备液和超纯水混匀，配制得2ml10μmol/lrhb溶液，测定其荧光强度，然后在该rhb溶液中加入1mg/mlcp6@rgo液体4μl，测定其荧光强度，由于cp6@rgo溶液能猝灭物质的荧光，因此rhb溶液的荧光强度降低；继续加入cp6@rgo溶液并测定荧光强度，使cp6@rgo在rhb溶液中浓度逐渐增加，直至荧光强度猝灭达到饱和（图6）。
实施例5：胰岛素对rhb-cp6@rgo的荧光恢复
向实施例4溶液中逐渐添加胰岛素溶液，且使胰岛素在实施例4溶液中的终浓度逐渐增加，浓度范围为0-18μm，每次加入胰岛素溶液后静止3min使其与实施例4溶液中rhb-cp6@rgo充分反应，测定其荧光强度，随着胰岛素浓度的增加，实施例4溶液的荧光强度逐渐恢复（图7），并获得荧光强度与胰岛素浓度的线性关系（图8），用于后期测定样品中的胰岛素的含量；在本实施例中检测胰岛素的线性范围为0.01-0.5μm和0.5-16μm，检出限为0.003μm，线性回归方程为：f/f0=0.4098c(μm)+1.0358和f/f0=0.0258c(μm)+1.2736，相关系数为0.870，0.984。
实施例6：rhb-cp6@rgo传感器对胰岛素ins识别的抗干扰性能
选取血清中可能存在的一些胰岛素类似物及几种常规干扰物进行干扰测定，其中包括牛血清蛋白（bsa）、碳酸酐酶（cah）、溶菌酶（lys）、凝血酶（thr），浓度为2μmol/l；葡萄糖（glu）、nacl、mgcl2、柠檬酸（ca）等，浓度均为100μmol/l；分别把这些干扰物加到cp6@rgo溶液猝灭rhb荧光达到饱和的混合溶液（实施例4的荧光强度猝灭达到饱和的溶液）中，测定其荧光恢复程度，作出其相对应的荧光强度（f-f0）/f0的图像（图11），从图中可以看出rhb-cp6@rgo传感器对ins识别具有良好的抗干扰性能。
实施例7：cp6@rgo传感器的使用
以人工血清为实际样品，采用加标回收的方式进行实际样品中胰岛素含量的检测；取稀释50倍的血清样品500μl，在血清样品中分别各加入500μl，8μmol/l、4μmol/l、2μmol/l、1μmol/l的胰岛素溶液，配制得到加标量分别为4μmol/l，2μmol/l、1μmol/l、0.5μmol/l的待测样品，将待测样品中加入到2ml、50mg/mlrhb-cp6@rgo混合液中，测定每个样品的荧光吸收值，每个样品平行测定3次，将每个样品的荧光吸收值代入实施例5获得的荧光强度恢复与胰岛素浓度的线性关系中，计算出每个样品的实际测量浓度，并进一步计算回收率及标准偏差，如表1所示，回收率在89.7%-105.4%之间，相对标准偏差为4.0%-6.1%之间，说明本发明感器可用于检测实际血清样品中的胰岛素含量，在生物医学和临床检测中有着很大的应用潜力；
表1血清实际样品中胰岛素加标回收实验结果