本发明属于细胞生物学领域，具体是一种以凡士林柱为支撑的胚胎立体结构的荧光成像方法。
背景技术：
随着人类对未知科学更深入地探索，与之相应的生物学技术和仪器也不断地发展，从而变得更加精密化、专业化和先进化。在细胞显微成像发明中，由于普通光学显微镜的限制，从而激发人们对新的成像手段地积极探索和开发。激光共聚焦扫描技术是在20世纪80年代中期发展起来并得到广泛推广和应用的新技术。激光共聚焦扫描显微镜在传统光学显微镜基础上，利用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出。
间接免疫荧光染色技术与激光共聚焦扫描技术相结合可实现猪植入前胚胎中不同蛋白定位与表达的发明。通过对胚胎进行断层扫描，即所谓的“ct扫描”，每扫描一层得到一张影像，将多层影像叠加得到三维立体结构，从而可分别检测到整个胚胎内各种完整的荧光信号，直接了解胚胎内各个蛋白的定位以及表达情况。目前，应用激光共聚焦扫描技术对胚胎三维立体成像时很大程度上依赖于商业化耗材(显微载玻片、垫片)的支持，即在显微载玻片上粘贴垫片，再向垫片的孔中加入20uldpbs+0.3wt％pvp，将已经荧光标记的胚胎放入孔中，盖上盖玻片进行激光共聚焦扫描，就能利用不同波长分别检测同一胚胎的不同荧光信号。现已有商品化的显微载玻片和垫片价格比较昂贵。然而，间接免疫荧光联合激光共聚焦扫描在生物学实验中已经成为常用的高清成像技术，因此，这势必使实验的成本增加及预算增高。
一般商业化的显微载玻片和安全垫片经济成本比较高，不能在实验中普遍使用；同时货期比较长且存在购买困难的情况，会影响实验进度；此外，垫片保存时间过长会导致黏性下降或者垫片之间有互相粘黏不易分开，从而会影响荧光成像效果。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种简单经济的维持胚胎立体结构的荧光成像技术，用以解决目前间接免疫荧光染色技术联合激光共聚焦扫描技术应用于猪植入前胚胎成像中商品化试剂的成本高、购买货期长、垫片保存时间长易导致黏性下降以及长期保存使垫片之间不易分开等问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种以凡士林柱为支撑的胚胎立体结构的荧光成像方法，包括如下步骤：
(1)胚胎准备；
(2)dapi染核；
(3)制备凡士林柱支撑柱及添加抗淬灭剂：首先，用凡士林在载玻片一侧方形区域的四角点四个柱，且四个凡士林柱所围成的面积要小于盖玻片的面积，所点的凡士林柱的高度为2㎜；然后，在四个凡士林柱围成区域内的正中央滴加15μl抗淬灭剂；
(4)压片、封片；
(5)激光共聚焦显微镜扫描成像；将制备凡士林柱为支撑的载玻片分别在激光共聚焦显微镜的普通光和紫外光激发下观察猪第七天囊胚的立体结构。
优选地，步骤(1)中，胚胎准备具体步骤如下：
①收集胚胎：本发明以猪第七天囊胚为实验对象，将第七天囊胚放入dpbs+0.3wt％pvp液滴快洗三遍；
②再将第七天囊胚移入4％pfa液滴中室温条件下固定15-20分钟；
③四孔板的孔中加入dpbs+0.3wt％pvp液体，每孔加400μl；
④固定好后的第七天囊胚移入四孔板中，将四孔板放在摇床上摇晃进行清洗三次，每次5分钟。
优选地，步骤(2)中，dapi染核具体步骤如下：
从离心管中取出浓度为1μg/ml的dapi50μl，再取1μldapi，吹打混匀，滴加在皿盖上；将第七天囊胚移入dapi液滴中室温孵育10分钟，避光；孵育结束后，往四孔板的孔中加入400μldpbs+0.3wt％pvp清洗三次，每次5分钟。
优选地，步骤(4)中，压片、封片具体步骤如下：
将第七天囊胚移入抗淬灭剂中进行压片，保证盖玻片与抗淬灭剂接触后使抗淬灭剂向四周扩散即可，随后用指甲油进行封片。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的以凡士林柱为支撑保持胚胎立体结构的荧光成像技术，通过降低胚胎立体荧光成像时耗材使用的成本而代替商业化耗材依赖的成像技术，使胚胎立体成像技术的应用更加广泛。
本发明利用以凡士林柱为支撑的胚胎立体结构成像技术具有实际意义和利用价值：一方面，从经济成本来看，商品化的显微载玻片和垫片均是进口产品，货期长价格贵；而本发明采用凡士林柱支撑盖玻片的立体成像技术，所用到的凡士林和载玻片价格低并容易购买。相比而言，以凡士林为支撑点的胚胎立体结构保持技术不仅可以很好地满足各个实验室的试验需求，并且可以极大地降低了科学发明的经济成本，保证实验有序高效地进行。另一方面，从实验操作来看，以商品化垫片为支撑点的胚胎立体成像技术中使用的显微载玻片极薄，很容易碎裂或划伤实验人员。同时垫片不能保证可以很好地撕开纸层进而造成一定试验浪费。此外，商业化垫片粘性也是有一定期限的，不易长期保存。这样，使用商业化耗材保持胚胎立体结构的技术大大增加了实验操作的难度，并且给科学发明带来不必要的损失。然而，以凡士林柱为支撑的手工保持胚胎立体结构技术使用过程中，凡士林本身不带有任何伤害性物质，而操作更是简单易学。同时，载玻片质地较好、无毒无害、方面实验操作人员的使用。综上所述，以凡士林柱为支撑点保持胚胎立体结构的成像技术要优于商品化垫片为基础的方法，可以在胚胎工程实验室的科学发明广泛使用，从而促进胚胎生物技术在畜牧业和人类生殖医学中的应用。
附图说明
图1为体视显微镜下观察两种方法压片的囊胚立体结构。
图2为商业化垫片支撑盖玻片和凡士林柱支撑盖玻片的普通光下囊胚成像图。
图3为商业化垫片支撑盖玻片和凡士林柱支撑盖玻片的紫外光激发下囊胚成像图。
具体实施方式
以下实施例所使用的材料、试剂及其来源
材料
国产蓝枪头、白枪头，移液枪2.5μl(eppendorfresearchplus)，200μl(dragonlab，20-200μl)，离心管(200μl，axygen)，四孔板(thermo，176740)，35㎜×10㎜皿(falcon，351008)，盖玻片(fisherfinest，12-544-10)，载玻片(帆船，7105)，microcoverglass(vwr，48404-454)，secure-sealtmspacer(lifetechnologies，s24737)摇床，记号笔，木盒，直尺，指甲油，计时器。
试剂
4％pfa(solarbio，p1110)，dpbs(dulbecco，sphosphatebuffered，gibco，21600-044)，pvp(polyvinylpyrrolidone，sigma，p0930)，dapi，抗淬灭剂(碧云天，p0126)，医用白凡士林(南京金陵石油化工公司化工一厂)。
实施例1：
一种以凡士林柱为支撑的胚胎立体结构的荧光成像方法，包括如下步骤：
1.1胚胎准备
①收集胚胎：本发明以猪第七天囊胚为实验对象，将第七天囊胚放入dpbs+0.3wt％pvp液滴快洗三遍；
②再将第七天囊胚移入4％pfa液滴中室温条件下固定15-20分钟；
③四孔板的孔中加入dpbs+0.3wt％pvp液体，每孔加400μl；
④固定好后的第七天囊胚移入四孔板中，将四孔板放在摇床上摇晃进行清洗三次，每次5分钟。
1.2dapi染核
①准备好200μl离心管，2.5μl、200μl移液枪，国产黄枪头、白枪头，dpbs+0.3wt％pvp液体，dapi。
②从离心管中取出浓度为1μg/ml的dapi50μl，再取1μldapi，吹打混匀，滴加在皿盖上。
③将第七天囊胚移入dapi液滴中，室温孵育10分钟，避光。
④孵育结束后，往四孔板的孔中加入400μldpbs+0.3wt％pvp清洗三次，每次5分钟。
1.3.制备凡士林柱支撑柱及添加抗淬灭剂
首先，用凡士林在载玻片一侧方形区域的四角点四个柱，且四个凡士林柱所围成的面积要小于盖玻片的面积(图1,a)，所点的凡士林柱的高度为2㎜；然后，在四个凡士林柱围成区域内的正中央滴加15μl抗淬灭剂。
1.4.压片、封片
将第七天囊胚移入抗淬灭剂中进行压片，压片时要小心地盖上盖玻片并轻轻挤压。同时还要注意不能让盖玻片下沉过多，保证盖玻片与抗淬灭剂接触后使抗淬灭剂向四周扩散即可，随后用指甲油进行封片。
1.5.激光共聚焦显微镜扫描成像
将制备凡士林柱为支撑的载玻片分别在激光共聚焦显微镜的普通光和紫外光激发下观察猪第七天囊胚的立体结构。
对比例
一种以商业化垫片支撑盖玻片的保持猪胚胎立体结构的荧光成像方法对比例与实施例1的区别在于，制备商业化垫片支撑盖玻片及添加抗淬灭剂：商业化所使用的是显微载玻片和安全垫片，先剪下安全垫片其中一个孔，再撕掉安全垫片纸层，直接将安全垫片粘贴到显微载玻片上，最后向安全垫片的孔中加入20μldpbs+0.3wt％pvp即可。
压片：而商业化的只需要盖上盖玻片即可，注意避免产生气泡，也不需要进行封片。
结果分析：
在体视显微镜下的观察(如：图1)可以发现两种方法都能很好地维持囊胚的立体结构，凡士林柱支撑盖玻片的方法也不会使囊胚的形态发生改变，如囊胚破裂，囊胚扁平等情况。在激光共聚焦普通光(如：图2)以及紫外光(如：图3)下的观察囊胚，都显示出良好的立体结构，并清晰地了解到蛋白的定位及表达情况。总之，凡士林柱支撑盖玻片和商业化垫片支撑盖玻片这两种方法是没有差异的。因此，凡士林柱支撑盖玻片的方法在一定程度可替代商业化垫片支撑盖玻片的方法。
图1为体视显微镜下观察两种方法压片的囊胚立体结构。
图2为商业化垫片支撑盖玻片和凡士林柱支撑盖玻片的普通光下囊胚成像图，其中，
a：商业化垫片普通光下囊胚顶部成像，b：凡士林柱普通光下囊胚顶部成像；
c：商业化垫片普通光下囊胚中部成像，d：凡士林柱普通光下囊胚中部成像；
e：商业化垫片普通光下囊胚底部成像，f：凡士林柱普通光下囊胚底部成像；
g：商业化垫片普通光下囊胚立体成像，h：凡士林柱普通光下囊胚立体成像；
图3为商业化垫片支撑盖玻片和凡士林柱支撑盖玻片的紫外光激发下囊胚成像图，其中，
a：商业化垫片紫外光激发下囊胚顶部成像b：凡士林柱压片紫外光激发下囊胚顶部成像；
c：商业化垫片紫外光激发下囊胚中部成像d：凡士林柱压片紫外光激发下囊胚中部成像；
e：商业化垫片紫外光激发下囊胚底部成像f：凡士林柱压片紫外光激发下囊胚底部成像；
g：商业化垫片紫外光激发下囊胚立体成像h：凡士林柱压片紫外光激发下囊胚立体成像。
本发明的以凡士林柱为支撑保持胚胎立体结构的荧光成像技术与商业化垫片为支撑保持胚胎立体结构的荧光成像技术最大的不同是，通过降低胚胎立体荧光成像时耗材使用的成本而代替商业化耗材依赖的成像技术，使胚胎立体成像技术的应用更加广泛。
本发明利用以凡士林柱为支撑的胚胎立体结构成像技术具有实际意义和利用价值：一方面，从经济成本来看，商品化的显微载玻片和垫片均是进口产品，货期长价格贵；而本发明采用凡士林柱支撑盖玻片的立体成像技术，所用到的凡士林和载玻片价格低并容易购买。相比而言，以凡士林为支撑点的胚胎立体结构保持技术不仅可以很好地满足各个实验室的试验需求，并且可以极大地降低了科学发明的经济成本，保证实验有序高效地进行。另一方面，从实验操作来看，以商品化垫片为支撑点的胚胎立体成像技术中使用的显微载玻片极薄，很容易碎裂或划伤实验人员。同时垫片不能保证可以很好地撕开纸层进而造成一定试验浪费。此外，商业化垫片粘性也是有一定期限的，不易长期保存。这样，使用商业化耗材保持胚胎立体结构的技术大大增加了实验操作的难度，并且给科学发明带来不必要的损失。然而，以凡士林柱为支撑的手工保持胚胎立体结构技术使用过程中，凡士林本身不带有任何伤害性物质，而操作更是简单易学。同时，载玻片质地较好、无毒无害、方面实验操作人员的使用。综上所述，以凡士林柱为支撑点保持胚胎立体结构的成像技术要优于商品化垫片为基础的方法，可以在胚胎工程实验室的科学发明广泛使用，从而促进胚胎生物技术在畜牧业和人类生殖医学中的应用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。