本发明涉及生物技术诊断技术领域，具体为一种基于mix抗原包被的hcvns3抗体检测方法。
背景技术：
目前普遍使用酶免疫法(eia)检测抗-hcv作为丙型肝炎(hc)诊断指标，国内目前在对献血员抗-hcv进行常规筛选，使得输血后hc的发生率大为减少，但仍有部分受血者发生输血后hc，这一结果证实目前国内的hcv检测试剂还不够完善；hcv易发生变异，其基因序列具有高度异质性。目前hcv被划分为6个基因型，20多个基因亚型，不同基因型的hcv广泛分布于世界不同地区，在亚洲，hcv有1、2、6型分布，在中国以1b型为主，但混合感染明显高于其他国家和地区，hcv基因组序列的变异和基因组编码蛋白抗原性、生物学性质的变异相关，这对于hcv的血清学抗体检测结果有重要影响。
hcv抗体试剂盒的核心是抗原成分，非结构区3(ns3)抗原是目前抗-hcveia检测试剂中的核心成分之一。ns3蛋白具有很强的抗原性，但该区基因序列在hcv不同基因型和亚型中的变异性较大，因此以特定基因型(亚型)的hcv抗原检测其它型(亚型)hcv感染标本时，抗原性会受到这种差异性的制约而影响检出率。然而，目前市场上所提供的检测试剂盒中所用ns3抗原均来自hcv基因型1型，1型抗原试剂对于非1型的hcv的抗体检测必然会受到基因序列的异质性的影响。
不同基因型hcvns3蛋白抗原性存在明显差异，所以在发展hcv血清学诊断试剂应该考虑到不同基因型ns3抗原性差异对抗体检测的影响。中国本土主要以基因型1型为主，但是仍存在有其它基因型的混合感染，因此以特定基因型为1型的ns3抗原不能同样有效地检测其它基因型的抗体。基于以上并结合中国本土基因型分布的特点，在比较了1型和6型两种不同基因型ns3抗原性的差异基础上，将1型和6型ns3重组抗原按比例混合(mix抗原)作为包被抗原应用到抗体检测中，将其应用到hcv的抗体检测，使得比单纯应用1型ns3抗原检测的效率得到提高。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种基于mix抗原包被的hcvns3抗体eia检测方法，基于目前国内hcv抗体检测试剂仍不够完善的现状，结合中国本土hcv基因型分布的特点，建立一种以mix抗原包被的hcvns3抗体eia检测方法，以提高hcv抗体的检出率，从而减少hcv感染者的漏检，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提出：一种基于mix抗原包被的hcvns3抗体eia检测方法，
(1)包被:分别将hcvns3(1型和6型)mix抗原用0.01mol/lpbs(ph7.2)稀释后包被微孔板，100μl/孔，放置4℃冰箱过夜，次日用1×pbst液洗涤3次，扣干密封，4℃储存备用；
(2)加样：将稀释的酶标二抗(羊抗人-igg)加入酶标孔，100μl/孔，再依次加入1μl血清标本，分为空白对照组、阴性对照组和阳性对照组、待测血清，轻拍混匀；
(3)温育：置37℃温育1小时；
(4)洗涤：弃去孔内液体，pbst液洗涤4遍，扣干；
(5)显色：分别向空白对照组、阴性对照组和阳性对照组、待测血清的每孔加底物a液、底物b液各50μl，轻拍混匀，置37℃温育10分钟；
(6)加入终止液50μl，轻拍混匀；
(7)测定：酶标仪以空白对照孔调零，在波长450nm处测定各孔od450值，打印测定结果；
作为本发明的一种优选技术方案：包被稀释液由pbs、nacl、kcl、na2hpo4·12h2o、kh2po4双蒸水组成，0.01mol/lpbs，nacl8.0g、kcl0.2g、na2hpo4·12h2o3.58g，kh2po40.2g，加双蒸水至1l，调ph至7.2。
作为本发明的一种优选技术方案：碳酸盐缓冲液由na2co3、nahco3、na2n3、双蒸水组成，na2co31.5g、nahco32.9g、na2n30.2g加双蒸水至1000ml调至ph9.6。
作为本发明的一种优选技术方案：酶标二抗稀释液ⅰ由20％甘油、30％小牛血清、50％0.01mol/lpbst组成。
作为本发明的一种优选技术方案：酶标二抗稀释液ⅱ由nacl、硫柳汞、tween-20、二甲基亚砜、小牛血清、磷酸盐缓冲液组成，1.31gnacl、0.005g硫柳汞、45μltween-20、135μl二甲基亚砜、5ml小牛血清、45ml0.01mol/lph7.4磷酸盐缓冲液(pb)混合。
作为本发明的一种优选技术方案：洗涤液由nacl、kcl、na2hpo4·12h2o、kh2po4、tween-20、双蒸水组成，nacl8.0g，kcl0.2g，na2hpo4·12h2o3.58g，kh2po40.2g，tween-200.5ml，加双蒸水至1l，调ph至7.2。
作为本发明的一种优选技术方案：底物液a由四甲基联苯胺、无水乙醇、双蒸水组成，四甲基联苯胺200mg和无水乙醇100ml、加双蒸水至1l。
作为本发明的一种优选技术方案：底物液a由四甲基联苯胺、dmso组成，四甲基联苯胺200mg和dmso100ml、加双蒸水至1l。
作为本发明的一种优选技术方案：底物液b由na2hpo4、柠檬酸、0.75％过氧化氢尿素、双蒸水组成，na2hpo414.6g、柠檬酸9.33g、0.75％过氧化氢尿素6.4ml加双蒸水至1l，调ph至7.2。
作为本发明的一种优选技术方案：终止液为2mol/l的h2so4溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：基于目前国内hcv抗体检测试剂仍不够完善的现状，结合中国本土hcv基因型分布的特点，建立一种以mix抗原包被的hcvns3抗体eia检测方法，以提高hcv抗体的检出率，从而减少hcv感染者的漏检。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供以下技术方案：
一种基于mix抗原包被的hcvns3抗体eia检测方法，
(1)包被:分别将hcvns3(1型和6型)mix抗原用0.01mol/lpbs(ph7.2)稀释后包被微孔板，100μl/孔，放置4℃冰箱过夜，次日用1×pbst液洗涤3次，扣干密封，4℃储存备用；
(2)加样：将稀释的酶标二抗(羊抗人-igg)加入酶标孔，100μl/孔，再依次加入1μl血清标本，分为空白对照组、阴性对照组和阳性对照组、待测血清，轻拍混匀；
(3)温育：置37℃温育1小时；
(4)洗涤：弃去孔内液体，pbst液洗涤4遍，扣干；
(5)显色：分别向空白对照组、阴性对照组和阳性对照组、待测血清的每孔加底物a液、底物b液各50μl，轻拍混匀，置37℃温育10分钟；
(6)加入终止液50μl，轻拍混匀；
(7)测定：酶标仪以空白对照孔调零，在波长450nm处测定各孔od450值，打印测定结果；
作为本发明的一种优选技术方案：包被稀释液由pbs、nacl、kcl、na2hpo4·12h2o、kh2po4双蒸水组成，0.01mol/lpbs，nacl8.0g、kcl0.2g、na2hpo4·12h2o3.58g，kh2po40.2g，加双蒸水至1l，调ph至7.2。
作为本发明的一种优选技术方案：碳酸盐缓冲液由na2co3、nahco3、na2n3、双蒸水组成，na2co31.5g、nahco32.9g、na2n30.2g加双蒸水至1000ml调至ph9.6。
作为本发明的一种优选技术方案：酶标二抗稀释液ⅰ由20％甘油、30％小牛血清、50％0.01mol/lpbst组成。
作为本发明的一种优选技术方案：酶标二抗稀释液ⅱ由nacl、硫柳汞、tween-20、二甲基亚砜、小牛血清、磷酸盐缓冲液组成，1.31gnacl、0.005g硫柳汞、45μltween-20、135μl二甲基亚砜、5ml小牛血清、45ml0.01mol/lph7.4磷酸盐缓冲液(pb)混合。
作为本发明的一种优选技术方案：洗涤液由nacl、kcl、na2hpo4·12h2o、kh2po4、tween-20、双蒸水组成，nacl8.0g，kcl0.2g，na2hpo4·12h2o3.58g，kh2po40.2g，tween-200.5ml，加双蒸水至1l，调ph至7.2。
作为本发明的一种优选技术方案：底物液a由四甲基联苯胺、无水乙醇、双蒸水组成，四甲基联苯胺200mg和无水乙醇100ml、加双蒸水至1l。
作为本发明的一种优选技术方案：底物液a由四甲基联苯胺、dmso组成，四甲基联苯胺200mg和dmso100ml、加双蒸水至1l。
作为本发明的一种优选技术方案：底物液b由na2hpo4、柠檬酸、0.75％过氧化氢尿素、双蒸水组成，na2hpo414.6g、柠檬酸9.33g、0.75％过氧化氢尿素6.4ml加双蒸水至1l，调ph至7.2。
作为本发明的一种优选技术方案：终止液为2mol/l的h2so4溶液。
实施例一：
hcvns3抗体检测程序优化
一、ns3mix包被抗原最佳稀释度和酶标抗体最佳稀释度的选择
1.方法：用方阵滴定的方法，将已纯化的含有hcvns3(1型)、ns3(6型)的mix抗原作倍比稀释包被酶标板，同时对hrp标记的羊抗人igg作倍比稀释，两者的稀释度均从1：200到1：3200，分别检测2份阴性标本和2份阳性标本，加样量均为1μl，设立空白对照孔，具体操作步骤如下述，最后选择阳性血清od450值与阴性血清od450值之比最高的稀释度为最佳稀释度。
2.具体步骤：将ns3mix抗原用0.01mol/lpbs(ph7.2)稀释后包被微孔板，100μl/孔，放置4℃冰箱过夜；次日用1×pbst液洗涤3次，扣干，密封，4℃储存备用。
(1)加样：将稀释的酶标二抗(hrp标记的羊抗人-igg)加入酶标孔，100μl/孔，再依次加入1μl血清标本(设立空白对照、阴性对照和阳性对照)，轻拍混匀；
(2)温育：置37℃温育1小时；
(3)洗涤：弃去孔内液体，pbst液洗涤4遍，扣干；
(4)显色：包括空白对照孔，每孔加底物a液、b液各50μl，轻拍混匀，置37℃温育10分钟。
(5)加入终止液50μl，轻拍混匀；
(6)测定：酶标仪以空白对照孔调零，在波长450nm处测定各孔od450值，打印测定结果；
(7)结果判定标准：采用比率表示法：用测定标本孔的od450与阴性标本测定孔od450(当阴性标本测定孔od450<0.06时以0.06计)的比值(p/n)表示，当p/n>2.1时判为阳性，否则为阴性。
3.结果:用方阵滴定的方法确定包被抗原和酶标抗体，倍比稀释度分别从1：200到1：3200，结果显示，在抗原(抗体)一个浓度固定时，随抗体(抗原)稀释度的增加，阴阳性标本的od值呈下降趋势。当抗原包被浓度在1：1600，酶标抗体浓度在1：3200时，两份阳性和阴性标本od值之比达到最高分别为59.8和67.9(如下表所示)，所以确定上述两个稀释度分别为抗原包被和酶标抗体稀释的浓度。
表1方阵滴定结果(p/n比值)
二、ns3mix抗原包被液的选择
1.方法：分别用ph7.2的pbs和ph9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液包被mix抗原，检测5份阴性和5份阳性血清标本(设复孔)，比较两种包被稀释液检测标本od450值有无统计学差异。
2.具体步骤：详细操作步骤与方法与一、2项相同。
3.结果:分别用pbs和碳酸盐缓冲液包被mix抗原，检测5份阳性血清标本和5份阴性血清标本(下表所示)，用配对设计t检验进行统计学分析两种稀释液od值差异，p＞0.05，没有统计学意义，本方法选用常规使用的pbs缓冲液作为包被液。
两种包被液包被微孔板检测结果比较
三、酶标抗体稀释液的选择
1.方法：用含0.5mol/lnacl、1‰tween-20、0.1g/l硫柳汞、0.3％二甲基亚砜的0.01mol/lph7.4磷酸盐缓冲液(含稳定液)配制含10％小牛血清作酶标抗体稀释液ⅰ，再配制含30％小牛血清、20％甘油的pbst作标本稀释液ⅱ，检测5份阳性和5份阴性血清标本(设复孔)，比较用两种酶标抗原稀释液检测的od450值有无统计学差异。
2.具体步骤：详细操作步骤与方法与一、2项相同。
3.结果:分别用两种酶标抗体稀释液(ⅰ和ⅱ)稀释酶标二抗，分别检测5份阳性和5份阴性血清标本，分别计算复孔标本的od值均值和阴性(阳性)组标本od值的均值(如下表所示)；用配对t检验进行统计学分析，p＞0.05，无统计学差异，由于酶标抗体稀释液ⅰ在4℃稳定性较好，所以本方法选用其为酶标抗体的稀释液。
两种酶标抗体稀释液检测结果(od值)比较
四、血清样本稀释度选择
1.方法：根据上面优化的实验条件，分别检测10份阳性和10份阴性血清标本(设复孔)，每一标本分别设1：200(0.5μl血清/孔)、1：100(1μl血清/孔)、1：50(2μl血清/孔)、1：20(5μl血清/孔)样品稀释度检测，比较每一稀释度检出率以及od450值的比值，选择检出率高且阳性血清与阴性血清od450值的比值比较高以及操作便利的稀释度为最佳样本稀释度。
2.具体步骤：详细操作步骤与方法与一、2项相同。
3.结果:分别取抗-hcv抗体阳性和阴性标本各10份，按1：200、1：100、1：50、1：20的稀释度稀释后检测，最后的结果显示，不同的样本稀释度的样本阳(阴)性检出率一致；当样本的稀释比为1：100时，阳性血清与阴性血清od450值的比值比较高，随着样本稀释度的降低，比值的升高趋势已经不是很明显(如下表所示)；所以本方法选择1：100为血清样本稀释度，即每孔加血清1μl。
不同样本稀释度检测结果(od值比值)比较
实施例二：
hcvns3抗体检测的重复性和稳定性试验
一、重复性试验
1.方法:取3份阳性标本，同时测定10次，计算批内变异系数(cv)，同样3份标本每天测定一次连续测5天，计算批间变异系数。
2.具体步骤：详细操作步骤与方法与实施例1中一、2项相同。
3.结果：将3份阳性血清标本在同一时间段测定10次，计算批内变异系数；将同样的3份阳性血清连续测定5次，每天一次，计算批间变异系数；结果变异系数均小于10％，显示本方法的重复性较好(所下表所示)。
重复性试验结果(cv)
二、稳定性试验
1.方法：将同一批试剂(预包被酶标板、已稀释的酶标二抗、显色液a和b、终止液)分别放在4℃冰箱和37℃温箱，不同时间检测4份包括hcv强阳性、中阳性、弱阳性和阴性血清标本，比较存于4℃和37℃时试剂盒检测结果(od值)有无统计学差异。
2.具体步骤：详细操作步骤与方法与实施例1中一、2项相同。
3.结果：将试剂盒(包括预包被酶标板、酶标二抗稀释液、酶结合物底物液a和b、终止液)于37℃温箱放置4天，与放置在4℃冰箱的试剂盒平行检测3份阳性和1份阴性血清标本，进行热稳定性试验(如下表所示)。经配对t检验分析，p值＝0.12，显示两种状态下od值的差异不具有统计学意义。按37℃放置1天相当于4℃放置1.6个月计算，该试剂至少可以稳定6个月。
37℃和4℃放置结果比较(od值)
实施例三：
hcvns3抗体检测的敏感性和特异性试验
1.方法与步骤
(1)检测90份抗-hcv抗体阳性血清。
(2)hcv抗原中和试验：取10份抗-hcv抗体阳性血清分别加入hcv的重组mix抗原，37℃温育1小时；对照组取同样的10份阳性血清，但未加入mix抗原，同样37℃温育1小时；然后分别用所建立的检测方法检测样本。
(3)分别检测6份抗-hav抗体阳性、9份抗-hbv抗体阳性、20份抗-hev抗体阳性血清标本。
(4)分别检测200份健康体检血清标本和20份临检中心的阴性质控血清。
2.结果
(1)用检测90份抗-hcv抗体阳性的血清标本，结果有65份被hcvns3抗体检测为阳性，阳性率为72.2％。
(2)10份抗-hcv抗体阳性的血清标本分别加入hcv重组的mix抗原，37℃温育1小时后用本方法检测，结果全部呈阴性反应，即中和试验为阳性；而对照组此10份血清未加入mix抗原，检测结果全部呈阳性反应。
(3)用本方法分别检测6份抗-hav抗体阳性、9份抗-hbv抗体阳性、20份抗-hev抗体阳性血清标本，结果全部呈阴性反应，说明本方法与甲型、已型和戊型肝炎病人血清无交叉反应，具有较好的特异性。
(4)200份健康人群体检血清标本和20份临检中心的阴性质控血清用本方法经检测结果全部为阴性。
实施例4：hcvns3抗体检测的hcvrt-nested-pcrrna验证
1.方法与步骤
(1)引物设计：依据hcv5’端非编码区设计用于hcv检测的通用引物：
hc15’-gccatggcgttagtaygagt-3’(-260～-241)；
hc25’-tttcgcracccaacrctact-3’(-66～-85)；
hc35’-agtgtcrtrcagcctccagg-3’(-243～-224)；
hc45’-acccaacrctactmggctag-3’(-73～-92)；
(y＝c或t，r＝g或a)外引物hc1和hc2扩增片段为195bp，内引物hc3和hc4扩增片段为171bp，由上海生物工程公司合成。
(2)rna的提取：取血清100μl加trizol250μl，混匀，置室温5分钟；加入氯仿80μl，剧烈振动20秒钟，静置冰浴5分钟；4℃14000转/分钟，15分钟；转移上清至经depc处理过的eppendorf管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀，冰浴15分钟；4℃13000转/分钟，10分钟；弃上清，加75％冰乙醇300μl，漂洗后离心；弃上清，倒置于室温干燥15分钟；加depc处理水12μl充分溶解(含6urnasin)；rna95℃变性5分钟，立即冰浴10分钟，进行逆转录。
(3)逆转录
体系如下：
42℃水浴60分钟，95℃5分钟，立即冰浴10分钟，-20℃保存。
(4)第一次pcr反应
体系如下：
94℃预变性2分钟；94℃1分钟，52℃1分钟，72℃1分钟，35个循环；最后一个循环结束后72℃延伸8分钟。
(5)第二次pcr反应
取第一次pcr产物5μl，加入内引物hc3和hc4及pcr反应混合物，反应条件同第一次；pcr扩增设阴性和阳性对照；取最后的产物5μl用2.5％琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带。
2.结果：总共检测了30份抗-hcv抗体阳性的血清标本，结果有16份经pcr扩增为阳性，这16份抗-hcv抗体和rna均阳性的血清标本经hcvns3抗体检测也全部为阳性。
本发明好处：基于目前国内hcv抗体检测试剂仍不够完善的现状，结合中国本土hcv基因型分布的特点，建立一种以mix抗原包被的hcvns3抗体检测方法，以提高hcv抗体的检出率，从而减少hcv感染者的漏检。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。