与预测肝移植术后排斥反应相关的蛋白标志物及其用途的制作方法

本发明涉及医学分子生物学领域，具体地涉及预测肝移植术后排斥反应的蛋白标志物及其用途，更具体地涉及预测肝移植术后排斥反应的hmgb1蛋白标志物及其用途。

背景技术：

自starzl1963年完成全球第一例人体原位肝移植手术以来，通过40多年的发展，肝脏移植被医学界公认为是治疗晚期肝脏疾病的首选治疗方案。随着肝移植的快速发展，一些问题日益显著。首先，日渐增多的等待移植病人与由于供肝来源限制导致的供肝减少已成为目前主要的矛盾，如何有效地解决供肝匮乏，扩大供肝来源，合理有效地分配供肝，对提高肝移植患者术后整体生存率非常关键。其次，自从他克莫司等免疫抑制剂的研发和广泛使用，急性排斥反应已显著降低至25％～60％，但药物的肾脏毒性、神经毒性以及它引起的感染、骨髓抑制等并发症时常发生，其中败血症和感染等常导致原发性移植肝失功，进而导致移植后死亡。根据相关文献报道原发性移植肝失功是肝移植术后早期死亡的首要原因，缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury,iri)是原发性移植肝早期失功的主要因素，而移植排斥反应为晚期失功的主要因素。

肝脏具有双重的血液供应系统，且肝窦内皮细胞的间隙大，肝脏kupffer细胞还可以吞噬抗原抗体复合物，因此，在移植器官当中，其具有一定程度的天然免疫耐受性，故尚无明确的针对急性排斥反应早期检测的方法。目前寻找早期检测指标、明确其机制作用，并进行早期诊断和干预已成为该领域研究的焦点。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，发明人意外地发现血清hmgb1蛋白水平能够作为预测肝移植术后排斥反应的标志物。为此，

本发明的第一方面提供了hmgb1蛋白作为预测肝移植术后排斥反应的标志物的用途。

具体地，来自对象样本中所述hmgb1蛋白水平升高，表示具有肝移植术后排斥反应或有具有发生肝移植术后排斥反应的风险。

在本发明的实施方案中，所述对象为哺乳动物。在本发明一些实施方案中，所述哺乳动物为人。

在本发明的实施方案中，所述样本为血清样本。

本发明的第二方面提供hmgb1蛋白的鉴定试剂在制备用于预测对象肝移植术后排斥反应的试剂盒中的用途。

在本发明的实施方案中，所述hmgb1蛋白的鉴定试剂为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。

在本发明的具体实施方案中，所述抗体为兔抗鼠hmgb1抗体。

本发明的第三方面提供一种预测对象肝移植术后排斥反应的试剂盒，包括hmgb1蛋白的鉴定试剂。

在本发明的实施方案中，所述hmgb1蛋白的鉴定试剂为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。

在本发明的具体实施方案中，所述抗体为兔抗鼠hmgb1抗体。

本发明的第四方面提供hmgb1蛋白作为预测肝移植术后肝细胞损伤的标志物的用途。

具体地，来自对象样本中所述hmgb1蛋白水平升高，表示具有肝细胞损伤或有具有发生肝细胞损伤的风险。

在本发明的实施方案中，所述对象为哺乳动物，在本发明一些实施方案中，所述哺乳动物为人。

在本发明的实施方案中，所述样本为血清样本。

本发明的有益效果

利用本发明的标志物能够预警肝移植术后急性排斥反应的发生，对临床早期诊断和治疗急性排斥反应具有较好的指导意义。

附图说明

图1示出了管阻断钳(a)、自制套管(b)、供体暴露(c)、左膈静脉结扎(d)、第一肝门的处理(e)、肝下下腔静脉的处理(f)、肝素化(g)及穿刺腹主动脉穿刺、灌注后的供肝(h)、修整后的供肝(i)。

图2示出了受体移植过程，a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k分别表示结扎食管静脉丛、暴露及分离右肝韧带、结扎肾上腺静脉丛、门静脉输入2ml生理盐水、移除受体肝脏、缝合肝上下腔静脉左右角、缝合前壁、套管后的血流再通、关腹前肝脏、术后复温、术后第一天。

图3示出了异基因组、同基因组、假手术组三组大鼠肝移植术后第10天取材情况。异基因急性排斥组开腹可见肝脏肿胀，切面粗糙；而假手术组与同基因组开腹可见肝脏外观无肿大，切面光滑细腻。

图4示出了各组生存期观察情况，异基因急性排斥组与同基因组生存期有明显的统计学差异(p<0.01)；同基因组和假手术组生存期无统计学差异。

图5示出了各组大鼠术后3d、7d、10d肝脏组织he染色(100×)，异基因急性组3d见少量汇管区炎症细胞浸润，属于交界性改变到轻度排斥反应之间，7d见大多数汇管区都有炎症细胞，属于中度排斥反应，10d见几乎所有汇管区都有炎症细胞，并累积肝实质，属于重度排斥反应；同基因组与假手术组各时间点均未见明显排斥反应。

图6示出了各组大鼠术后3d、7d、10d肝脏组织cd3的表达(200×)，异基因急性排斥组中可见围绕着血管及胆管有大量cd3t淋巴细胞浸润；同基因组和假手术组未见明显cd3t淋巴细胞浸润。

图7示出了各组大鼠术后3d、7d、10d血清中il-2的表达水平，*指与同基因组比较，p<0.05；#指与异基因急性排斥组3d比较，p<0.05，异基因急性排斥组7d和10d显著高于同基因组及假手术组；同基因组和假手术组il-2各组间表达无统计学差异。

图8示出了各组大鼠术后3d、7d、10d血清中il-6的表达水平，各组无统计学差异，p>0.5。

图9示出了异基因急性排斥组、同基因组、假处理组各时间点肝脏细胞凋亡的情况(200×)，a、b、c分别为移植术后3d、7d、10d，异基因急性移植组各时间点细胞凋亡较对照组同基因组和假手术组明显增多，同基因组和假手术组肝细胞凋亡数量无明显差异。

图10示出了三组各时间点肝组织hmgb1蛋白表达水平(200×)，可见异基因急性排斥组第七天及第十天可见大量肝细胞内hmgb1在胞浆表达。

图11示出了三组各时间点肝组织hmgb1mrna表达水平，三组各时间点无统计学差异(p>0.05)。

图12示出了异基因急性排斥组和同基因组术后3d、7d、10d肝组织hmgb1蛋白表达水平，a.westernblot检测异基因组肝脏移植物中hmgb1蛋白表达水平；b为灰度扫描定量分析hmgb1蛋白水平。actin蛋白为标准化内参。异基因急性排斥组和同基因组术后各时间点肝组织hmgb1蛋白表达无统计学差异(p>0.05)。

图13示出了异基因移植组在大鼠术后2h、6h、12h、24h、3d、7d、10d各时间点血清alt、ast、hmgb1的表达水平，hmgb1的血清水平变化与转氨酶的变化趋势大致一致。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

实施例

1.材料，方法

1.1实验动物

健康雄性清洁级sd大鼠(吴氏动物实验中心)体重200～250g，供、受体体重差≤10％，受体略大于供体。健康纯系雄性清洁级lewis和bn大鼠(北京维通利华实验动物有限公司提供)，体重200～250g，供、受体体重差≤10％，受体略大于供体。

1.2手术仪器和器械

手术显微镜(江苏镇江中天光学仪器有限责任公司)、输液泵(浙江史密斯医学仪器有限公司)、d734普通四孔手术无影灯(上海医疗器械五厂)。

弯头显微镊2把、直头显微镊2把、弯头显微持针器1把、弯头微血管钳1把、直头显微剪1把、弯头显微剪1把、无损伤止血钳2把、显微血管夹4个。以上器械均购自上海医疗器械股份有限公司。

蚊式钳3把、中弯止血钳3把、组织剪2把、持针器1把、三角针若干。以上器械均购自上海医疗器械股份有限公司。

1-0丝线、5-0丝线、8-0医用绵纶双针无损伤缝合线，购自宁波灵桥医用缝针有限公司。lml注射器、5ml注射器、20ml注射器、医用刀片、医用棉球、纱布若干。自制腹腔小拉钩若干，自制小型腰垫、麻醉器1个，鼠板、保温灯各1个。自制袖套(用止血钳钳夹管壁一圈形成刻痕)，及内支撑管：门静脉袖套采用6f动脉导管外鞘，外径2.2mm，内径2.0mm，管长2mm、柄长1.0mm；肝下下腔静脉袖套为外径2.8mm、内径2.6mm的聚乙烯管，管长2mm、柄长1.0mm；胆总管内支撑管采用硬膜外麻醉导管，外径0.96mm、长4mm。

1.3主要试剂与配制

(1)苯巴比妥钠：深圳晶美生物工程有限公司，加蒸馏水配制成10％溶液；

(2)乙醚溶液：分析醇、含量≥99.5％，上海国药集团化学试剂有限公司；

(3)硫酸阿托品注射液：上海禾丰制药有限公司；

(4)复方乳酸林格氏液、5％葡萄糖液及0.9％生理盐水，福州海王福药制药有限公司；

(5)肝素钠注射液，12500单位/支，成都市海通药业有限公司；

(6)注射用青霉素粉剂，山东鲁抗医药股份有限公司；

(7)聚维酮碘消毒液及75％酒精消毒液，山东利尔康医疗科技股份有限公司。

(8)器官保存液液及灌注液：500ml复方乳酸钠注射液含肝素钠12500单位，放置4℃低温保存。

1.4供体手术

(1)供体采用戊巴比妥钠l00mg/kg腹腔注射麻醉；

(2)备皮消毒，十字切口进腹，大鼠腰下放置腰垫，充分暴露上腹部；

(3)离断镰状韧带，近肝侧缝扎左膈下静脉；

(4)将肝脏向上轻轻推开，并用生理盐水纱布保护覆盖，靠近肝脏结扎肝食管血管交通支；

(5)将肠管翻向左外侧并用生理盐水纱布保护覆盖，暴露第一肝门，游离幽门静脉，8-0丝线结扎，骨骼化门静脉至脾静脉以下。游离肝固有动脉，并预留一根5-0丝线暂不结扎，肝门分叉约0.5cm处胆管前壁剪一斜口，插入内支撑管，5-0丝线结扎固定并预留一根结扎丝线不剪断；

(6)靠近肝脏尾状叶根部，游离腹腔干，并在腹腔干上方带线暂不结扎；

(7)将肝脏尾状叶向上翻起，并覆以生理盐水纱布保护固定，充分游离肝下下腔静脉至左右髂总静脉分叉处，分离出右肾静脉，靠近下腔静脉处结扎右肾静脉；

(8)游离髂总静脉分叉处的腹主动脉，从髂总静脉分叉处注入含肝素100u的生理盐水1ml，穿刺腹主动脉并固定，此时结扎腹腔干上方的预留丝线，经输液泵注入4℃灌注液20ml，速度180ml/h；

(9)同时剪开剑突旁的膈肌进入胸腔，阻断胸主动脉，剪开胸侧下腔静脉，在左右髂总静脉分叉处切断下腔静脉，待大鼠暂停呼吸后，将输液泵速度调为80ml/h，不时地在肝脏表面撒一些预冷的生理盐水；

(10)此时靠近膈肌剪开肝上下腔静脉，尽量保持切口平整，离断左膈静脉、胃幽门静脉、右肾静脉；

(11)肝脏灌注完毕后，此时肝脏呈土黄色，离断右肝周韧带、食管静脉丛、左肝周韧带、右肾上腺静脉丛和腰静脉，游离出肝盘状乳突叶，结扎并离断右侧肾上腺静脉丛和腰静脉，离断结扎肝固有动脉，在脾静脉以下切断门静脉，取出肝脏置于4℃保存液保存。

(12)在4℃保存液中用血管夹固定门静脉袖套柄，注意套管柄的朝向，将套管套入门静脉，门静脉远端翻转覆盖袖套，用5-0丝线结扎固定。同法处理肝下下腔静脉。移植肝置于4℃冰箱内等待移植。

1.5受体手术

(1)受体术前30min肌肉注射阿托品0.1mg/kg，术中扣戴自制面罩乙醚吸入麻醉；

(2)备皮消毒，正中切口进腹，大鼠腰下放置腰垫，自制小拉钩向两侧牵引肋弓，止血钳固定剑突并向头侧牵引，充分暴露手术野；

(3)远离肝脏结扎左膈下静脉，将肝脏向左轻轻推开，离断右肝周韧带；

(4)游离盘状乳头状突肝叶，结扎肝食管血管交通支；

(5)将肠管翻向左外侧腹部并用生理盐水纱布保护覆盖，翻开肝尾状叶，游离肝下下腔静脉至右肾静脉并保留右肾动静脉；

(6)用生理盐水纱布保护覆盖右侧肝脏，并向左侧外翻，充分暴露右肝周韧带，小心地离断右肝周韧带，远离肝脏结扎右侧肾上腺静脉丛和腰静脉；

(7)游离肝固有动脉，并将肝静脉游离至幽门静脉，将肝固有动脉及胆管两侧结扎，并剪断；

(8)将肝脏摆放回原位，用弯镊小心穿过肝上下腔静脉后壁，并尽量游离周围组织；

(9)撤离乙醚麻醉，用血管夹阻断门静脉及肝下下腔静脉，经门静脉左右

分叉处注入2ml生理盐水以驱赶肝内血液，此时大部分肝呈土黄色；

(10)用血管阻断钳钳连同部分膈肌一起钳夹，阻断肝上下腔静脉，并靠近肝脏尽量平整地剪开肝上下腔静脉，紧贴肝脏剪断门静脉，保留部分尾状叶切断肝下下腔静脉，取出供肝。

(11)取供肝摆放于受体中，缝合受体肝上下腔静脉左右角，左右侧腔外打结，从左侧开始缝线，连续缝合后壁和前壁，在缝合前壁暂不收紧，用生理盐水冲洗血管腔排出气泡后，收紧缝线，在腔外与左角线尾打结。

(12)松开受体门静脉处的动脉夹，放出少许高凝血，生理盐水冲洗管腔内残，用显微动脉钳夹住受体门静脉袖套，向供体门静脉靠近，将供肝套管插入受体门静脉腔内，5-0丝线结扎固定。

(13)开放门静脉血流，此时可见肝下下腔静脉有血液流出，2min后，去除血管阻断钳钳，结束无肝期。

(14)松开受体肝下下腔静脉动脉夹，放出少许高凝血，生理盐水冲洗肝上下腔静脉管腔内残血并排出气泡，将供肝下腔静脉套管插入受体下腔静脉腔内，5-0丝线结扎固定，开放下腔静脉血流。

(15)靠近结扎处纵形剪开受体胆管，显露管腔，将供肝胆管内支撑管插入受体管腔内，5-0丝线结扎固定，并将该结扎线与供肝胆管处预留的一根结扎线拉紧打结。

(16)检查腹腔有无出血，各管路是否通畅，生理盐水冲洗腹腔，关腹，肌注4万单位青霉素。

1.6肝脏组织病理学观察

1.6.1组织固定：取移植后2h、6h、12h、24h肝脏组织，浸泡于4％多聚甲醛固定，组织脱水、透明、浸蜡及包埋；组织固定后，按如下步骤进行梯度脱水、组织透明和浸蜡及包埋处理:

(11)浸蜡3(熔点60-62℃)

(12)包埋(67℃)

1.6.2石蜡切片制作

(1)将切片刀正确安装在刀座的持刀夹上，调整好切片刀的倾斜度；

(2)调整微动装置的刻度指针至要求切片厚度的读数，紧指针螺丝；

(3)将冷冻好的组织蜡块置于持蜡台上，使蜡块接近刀刃，与刀刃形成直角，修整蜡块切面；

(4)切片厚度4μm，连续切片或间断连续切片；

(5)用毛笔在刀刃下方托住并取下组织块，滑面向下，入温水中伸展贴附，切片与玻片间无气泡或多余水分；

(6)捞片后置烤箱中，0-65℃烘烤20min。

1.6.3he染色

(l)切片在二甲苯中脱蜡5-10min；

(2)二甲苯和纯酒精混合液中约5min；

(3)100％、95％、85％、70％酒精各2-5min最后经蒸馏水转入染液；

(4)木精染液染色5-15min；

(5)去玻片上多余染液，0.5％-l％盐酸酒精(70％酒精配制)分化片刻，镜检观察至细胞核及核内染色质清晰为止，数10s；

(6)水冲洗15-30min；

(7)0.5％伊红染液染色1-5min；

(8)次经70％、85％、95％、100％酒精脱水各2-3min；

(9)甲苯透明(二次)，10min；

(l0)封片：去除多余二甲苯，滴加适量中性树胶，加盖玻片；

1.6.4评估缺血再灌注中的肝损伤程度

依据肝淤血、肝脂肪变性及水变性、肝细胞坏死情况计算出肝iri的suzuki’s病理学总评分。

表1肝iri的suzuki’s病理学评分标准^[11]

1.6.5移植肝病理学评分

供肝组织排斥反应病理学评分标准选用banff97方案排斥活动指数(rai)总积分为9分，0～2分定为无排斥，3分为交界性改变，4～5分为轻度排斥，6～7分为中度排斥，8～12分为重度排斥。

表2移植肝组织排斥反应banff97病理学评分^[12]

1.7肝功能检测

1.7.1谷丙转氨酶(alt)检测

1.7.1.1测定原理：谷丙转氨酶在37℃及ph7.4条件下，作用于丙氨酸及α-酮戊二酸组成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸。反应30min后加入2，4-二硝基苯肼溶液，与酮酸中羰基加成，生成丙酮酸苯腙，同时终止反应，溶液呈红棕色，于505nm比读吸光度并计算酶活力。

1.7.1.2操作过程：

(1)在样品孔及对照孔内加入20ul谷丙转氨酶基质液；

(2)样品孔加入5ul样品，反复吸打混匀，对照孔不加；

(3)37℃水浴30min；

(4)每个孔内加入20ul2，4-二硝基苯肼液；

(5)对照孔加入5ul样品，反复吸打混匀，样品孔不加；

(6)37℃水浴20min；

(7)每孔加入200ul0.4mol/lnaoh，轻摇96孔板；

(8)室温15min，510nm测od值。

1.7.2谷草转氨酶(ast)检测

1.7.2.1测定原理：谷草转氨酶能使α-酮戊二酸和天门冬氨酸移换氨基和酮基，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反应过程中可自行脱羧成丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成2，4-二硝基苯腙，在碱性溶液中显红棕色。于505nm比读吸光度并计算酶活力，查标准曲线，可求得酶的活力单位。

1.7.2.2操作过程：

(1)在样品孔及对照孔内加入20ul谷草转氨酶基质液；

(2)样品孔加入5ul样品，反复吸打混匀，对照孔不加；

(3)37℃水浴30min；

(4)每个孔内加入20ul2，4-二硝基苯肼液；

(5)对照孔加入5ul样品，反复吸打混匀，样品孔不加；

(6)37℃水浴20min；

(7)每孔加入200ul0.4mol/lnaoh，轻摇96孔板；

(8)室温15min，505nm测od值。

1.8elisa检测血清hmgb1表达情况

(1)准备待测血清以及所需试剂及工作浓度标准品；

(2)每孔加300ul洗液静置浸泡30s清洗板条，弃掉洗液后在吸水纸上将板条拍干，洗板完成后立即使用；

(3)将标准品孔每孔加入100ul标准品溶液；

(4)样本孔内每孔加入50ul检测缓冲液和50ul检测样品；

(5)加样完成后将每孔内加入50ul检测抗体后用封板膜封板，以100转/分钟的速度室温孵育2h；

(6)弃掉废液，并于每孔中加入300ul的洗液清洗板条，共洗涤6次，每次洗板后在吸水纸上将板条拍干；

(7)最后一次清洗板条完成后尽可能出去残留液体并于每孔内加入100ul辣根过氧化物酶标记的链霉素亲和素，使用的新的封板膜封板后以100转/分钟的速度室温孵育45min；

(8)弃掉废液，并于每孔中加入300ul的洗液清洗板条，共洗涤6次，每次洗板后在吸水纸上将板条拍干；

(9)每孔加入100ul显色底物tmb，避光室温孵育30min后每孔加入100ul终止液；

(10)酶标仪检测450nm波长的od值，绘制标准曲线，计算样本浓度。

1.9qpcr检测移植肝组织中hmgb1、il-6、tnfαmrna水平

1.9.1引物设计：进入ncbi官网，进行引物设计，经primerblast选择最佳引物，合成好的引物4℃度保存。

表3引物设计

1.9.2总rna的提取(使用的物品均提前用0.1％depc处理)：

(1)在标记好的ep管中加入1mltrizol和两粒磁珠，加入50mg肝组织液；

(2)在全自动样品快速研磨仪研磨6min，室温静置5min；

(3)加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，室温孵育3min；

(4)放入提前预冷的4℃离心机12000rpm，15min；

(5)将水相转移至另一ep管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温孵育10min；

(6)放入4℃离心机12000rpm，10min；

(7)小心丢弃上清，可以看到管内rna沉淀呈白膜样，加入1ml75％无rna酶酒精，剧烈涡旋；

(8)放入4℃离心机12000rpm，5min；

(9)尽可能吸走上清，置于通风橱使酒精挥发，100μldepc水溶解；

(10)用紫外分光光度计测定a260值及a260/a280比值，以检测总rna的浓度和纯度(d260/280在1.8-2.0实为纯度很高)；

(11)总rna置于-80℃保存。

1.9.3逆转录合成cdna

(1)取1ug合成的mrna，加入1ul锚定引物，再加入无rna酶的水补足到13ul；

(2)混合后，将其放入pcr仪中，反应条件设置为65℃，10min→4℃，∞；

(3)取出反应液，在里面加入4ul逆转入酶buffer，0.5ulrnase抑制剂，2ul脱氧核苷酸混合物，0.5ul逆转入酶；

(4)混合后，将其放入pcr仪中，反应条件设置为95℃，2min→(95℃变性10sec→60℃退火30sec→72℃延伸30sec，共40个循环)→(95℃，15sec→60℃，1min→95℃，15sec)。

(5)采用2^-△△ct法进行数据的相对定量分析。

1.10western-blot检测hmgb1蛋白水平

1.10.1全细胞蛋白样品的制备

(1)标记好的ep管中加入300ul细胞裂解液ripa以及6ul50×蛋白酶抑制剂cocktail(稀释至1×)，加入两粒磁珠，加入约30mg肝组织；

(2)放入全自动匀浆仪，6min；

(3)4℃预冷离心机后以1300g/min，15min后吸取上清液体即为提取的总蛋白溶液；

(5)取少量的上清液用bca法检测蛋白含量，其余上清加入6xsdsloadingbuffer(稀释至1×)后100℃变性10min，冷却后-20℃保存备用。

1.10.2bca法检测蛋白浓度

(1)稀释牛血清白蛋白标准品：取牛血清白蛋白标准品(2mg/ml)按照说明书操作要求用pbs稀释至500ug/ml；

(2)96孔板内依次加入0、1、2、4、8、12、16、20ul稀释后的牛血清白蛋白，每孔用pbs补足至20ul，每个浓度设置3个复孔，此时浓度梯度为：0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000ug/ul；

(3)用pbs将样品分别稀释10倍、20倍、50倍，取20ul加入96板的样品孔中；

(4)配置工作液：根据标准品以及样品数量，将试剂a与试剂按照50：1的比例配置适量的bca工作液，充分混匀后，每孔加入200ul，混匀后于37℃孵育30min-90min；

(5)检测562nm处吸光度值，根据标准曲线计算蛋白浓度。

1.10.3western-blot

(1)制胶：清洗玻璃板并晾干，按照配方配制12％sds-page分离胶，一旦加入temed，马上开始聚合，立即快速旋动混合物，迅速灌分离胶溶液，并立即水封，静置10min，待界限清楚后，倾出覆盖液体，吸干凝胶上的液体；配制5％sds-page浓缩胶，灌注积层胶，立即插入梳子，将凝胶垂直放置于室温静置30-40min，积层胶聚合完全后，小心移出梳子，用双蒸水洗涤加样槽；

表4制胶

(2)上样：将上述提取的样本以30μg样本与6×sds-page加样缓冲液以体积比5:1混合，置于沸水中5min，然后迅速拿回冰上，用微量进样器将样品小心地加入样品孔内，预留一孔加5μl预染蛋白marker；

(3)电泳：接通电源，恒压电泳，样品在浓缩胶内电泳的电压设置80v，待样品进入分离胶，电压设为120v，当溴酚兰刚跑至胶的底部时即可关闭电源终止电泳，进行转膜；

(4)电转膜：电泳结束后取出凝胶，切去浓缩胶，再依据目的蛋白分子量的大小对分离胶进行适当的剪切后和滤纸以及海面一起浸泡在1x的转膜液中，裁剪一块与凝胶大小相仿的nc膜，按照转膜夹黑面-海绵垫-三层滤纸-胶块-nc膜-三层滤纸-海绵垫-转膜夹白面的顺序装配好转膜夹(注意赶尽气泡)，将夹子放入转膜槽内(黑面对负极，白面对正极)，冰浴中恒流电转(100v，50min)；

(5)封闭：转膜结束后将nc膜置于1xtbst中清洗5分钟，再放入5％的封闭液中，置于摇床上封闭2h；

(6)孵育一抗：nc膜浸入稀释后的兔抗小鼠hmgb1抗体以及内参蛋白抗体β-actin，4℃摇床轻摇过夜，然后用1xtbst清洗3次，每次10min；

(7)孵育一抗：将nc膜浸入稀释后的二抗中，室温摇床轻摇1h，然后用1xtbst清洗3次，每次10min；

(8)蛋白检测显影：将a和b两种试剂在1.5mlep管中等体积混合；将上述抗体孵育后的nc膜蛋白面朝上放在保鲜膜上，滴加适量混合液，室温孵育反应1-2min。沥干nc膜上多余的ecl试剂，然后将nc膜置于保鲜膜上，膜的蛋白印迹面向上放入暗盒，于暗室压x底片曝光。将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统(bio-radquantityone软件)分析条带净光密度值。

2结果

2.1原位肝移植大鼠模型构建情况

在第ⅰ阶段中发明人通过近8个月的练习，完成90对sd→sd构建，提高了显微缝合技术；在第ⅱ阶段进行10对lewis→bn和bn→bn的预实验和80对bn→bn和lewis→bn正式实验，共完成90次rolt模型的建立。在本实施例中，移植成功的标准是大鼠术后清醒，精神状态良好，自主饮水，对刺激有反应，存活一天以上。经统计学分析，两阶段组大鼠移植手术时间无明显的统计学差异(p>0.05)；在手术成功率方面，第ⅱ阶段较第ⅰ阶段有明显的统计学差异(p<0.05)。总结第ⅱ阶段死亡大鼠尸检发现死亡原因为：上下腔静脉吻合口漏血2例、肠梗阻1例、麻醉过深1例，气胸1例、门静脉血栓1例、空气体栓塞1例、胆漏1例。

表5各阶段大鼠肝移植手术情况

^a表示：第ⅱ阶段与第ⅰ阶段相比较，p>0.05；

^b表示：第ⅱ阶段与第ⅰ阶段相比较，p<0.05。

2.2肝移植术后大鼠情况

一般术后1h内大鼠即能自主翻身，并将24h内精神状态萎靡、反应迟钝、有渗血者剔除。异基因急性排斥组术后第一天精神一般，第三天开始出现精神状态不佳，皮肤粘膜黄染，尿色稍黄，在术后第七天大鼠精神状态差，活动减少，伴有体重下降，黄疸加重，皮毛杂乱无光泽。同基因组和假手术组移植术后无明显差异，在术后第一天精神尚可，随后可见精神状态佳，活动自如，体重无明显变化，皮肤粘膜颜色正常，毛色有光泽，对刺激灵敏。

第十天取材如图3所示：异基因急性排斥组精神萎靡，皮肤黏膜黄疸严重，开腹可见淡红色腹水，肠管、肝脏及膈肌之间稍有粘连，肝脏肿胀，切面粗糙，可见明显的黄白色斑点；而假手术组与同基因组精神状态良好，无黄疸，开腹无腹水，腹腔稍有粘连，肝脏移植物外观无肿大，切面光滑细腻。

大鼠生存期观察如图4所示：异基因急性排斥组术后15天内死亡，统计分析中位生存时间为11天，异基因急性排斥组与同基因组生存期相比较有明显的统计学差异(p<0.01)；同基因组和假手术组生存期无统计学差异(p>0.05)，15天内生存率为100％。

表6异基因急性排斥组、同基因组、假手术组二周存活率情况

2.3急性排斥病理学评分(rai)结果

分别取异基因急性排斥组(allograft)、同基因组(syngraft)、假处理组(sham)3d、7d、10d的肝组织观察其形态学变化，如图5所示：异基因急性排斥组3d见少量血管炎症细胞浸润，伴部分胆管变性，rai评分约为3-4，属于交界性改变到轻度排斥反应之间，7d见大多数汇管区都有炎症细胞，大量胆管有炎细胞浸润，部分静脉内膜有淋巴细胞浸润，rai评分约为6-7，属于中度排斥反应，10d见所有汇管区都有炎症细胞，并累积肝实质，几乎所有胆管有炎细胞浸润，伴有局灶管腔破坏，胆管细胞变性坏死静脉内膜下淋巴细胞浸润伴肝实质破坏，rai评分约为10，属于重度排斥反应；同基因组3d可见汇管区炎症细胞，胆管细胞结构正常，静脉内膜下无淋巴单核细胞侵犯，同基因组7d及10d与假手术组各时间点相同，均见肝细胞、内皮细胞及肝小叶结构清晰，汇管区未见淋巴细胞侵犯，同基因组及假手术组rai评分<1.70，两组均无排斥反应。

表7移植肝组织排斥反应banff97病理学评分

^a表示：异基因组与同基因组相比较，p<0.05；

^b表示：同基因组与假手术组相比较，p>0.05。

2.4免疫组化检测移植后肝脏组织cd3表达情况

为了检测移植术后肝移植物排斥反应强度，分别取异基因急性排斥组(allograft)、同基因组(syngraft)、假处理组(sham)3d、7d、10d的肝组织观察cd3免疫组化表达情况，结果如图6所示：异基因急性排斥组中cd3表达时间逐渐在增高，围绕着血管及胆管有大量cd3⁺t淋巴细胞浸润；同基因组和假手术组未见明显cd3⁺t淋巴细胞浸润，二者表达无差异。

2.5elisa检测移植术后il-2、il-6血清表达水平

为了检测肝移植术后急性排斥时期血清中炎症因子的表达水平，分别取异基因急性排斥组(allograft)、同基因组(syngraft)、假处理组(sham)三组术后3d、7d、10d的血清中检测il-2、il-6表达水平。

三组各时间点血清il-2表达水平的表达如图7所示：异基因急性排斥组、同基因组、假手术组三组在3d无统计学差异(p>0.05)；异基因急性排斥组随时间各组有明显差异(p<0.05)，且7d和10d显著高于同基因组及假手术组(p<0.05)；同基因组和假手术组il-2各组间表达无统计学差异，且表达水平较低(p>0.05)。

三组各时间点血清il-6表达水平的表达如图8所示：异基因急性排斥组、同基因组、假手术组在各时间点血清il-6的表达无统计学差异(p>0.5)。

2.6各组肝功能(alt、ast)测定结果

为了检测肝移植免疫排斥时肝功能，分别取异基因急性排斥组、同基因组、假处理组3d、7d、10d检测血清中alt、ast的表达。如下表8所示：异基因急性排斥组各时间点血清alt、ast表达水平无差异(p>0.05)，但异基因急性排斥组各个时间点水平仍高于同基因移植组和假手术组(p<0.05)；同基因组随时间血清alt、ast水平逐渐降低，最后趋于正常水平；假手术组各时间点血清alt、ast表达水平无明显统计学差异(p>0.05)。

表8三组大鼠移植术后各时间点血清alt、ast活性的变化

^a表示：与假手术组相比较，p<0.05。

2.7tunel检测各组肝组织细胞凋亡水平

为了进一步检测肝移植排斥时期肝细胞凋亡情况，分别取异基因急性排斥组、同基因组、假处理组3d、7d、10d采用tunel检测肝细胞凋亡水平。由4,6-二脒基-2-苯基吲(4,6-dimeryl-2-phenylhydrazine,dapi)染色的为正常细胞核，呈蓝色；tunel染色的为凋亡细胞核，呈绿色。异基因急性移植组各时间点细胞凋亡较对照组同基因组和假手术组明显增多，同基因组和假手术组肝细胞凋亡数量无明显差异。

2.8肝移植急性排斥时期hmgb1的表达水平

2.8.1elisa检测各组血清hmgb1表达水平

为了检测肝移植排斥时期hmgb1血清表达水平，分别取异基因急性排斥组、同基因组、假处理组3d、7d、10d血清检测hmgb1的含量。异基因组随时间血清hmgb1水平表达无差异，异基因急性排斥组各个时间点水平仍高于同基因组和假手术组(p<0.01)；同基因组随时间血清hmgb1水平逐渐降低，最后趋于正常水平；假手术组各时间点血清hmgb1表达水平无明显统计学差异。血清中hmgb1的表达水平与转氨酶变化趋势一致。

表9三组大鼠移植术后各时间点血清hmgb1的变化

^a表示：与假手术组相比较，p<0.05。

2.8.2免疫组化检测各组肝脏移植物中hmgb1蛋白表达水平

为了检测肝移植排斥时期肝组织的hmgb1mrna蛋白表达，分别取异基因急性排斥组(allograft)、同基因组(syngraft)、假处理组(sham)三组术后3d、7d、10d的肝组织检测hmgb1蛋白的表达。正常情况下，hmgb1蛋白在哺乳动物组织细胞的细胞核内表达，细胞坏死可主动释放hmgb1蛋白，另外，免疫细胞可主动分泌hmgb1蛋白。结果如图10所示：异基因急性排斥组在第七天及第十天可见大量肝细胞内hmgb1由核内迁移至胞浆甚至释放出胞外。异基因急性排斥组和同基因组术后第三天可见少量胞浆移位。假处理组各时间点的hmgb1主要在细胞核内的表达，无统计学差异。

2.8.3qpcr检测各组肝脏移植物中hmgb1mrna表达水平

为了检测肝移植排斥时期肝组织的hmgb1mrna表达水平，分别取异基因急性排斥组(allograft)、同基因组(syngraft)、假处理组(sham)三组术后3d、7d、10d的肝组织检测hmgb1mrna的变化。hmgb1mrna的表达结果如图11所示：异基因急性排斥组、同基因组、假处理组三组各时间点无统计学差异(p>0.05)，说明在肝移植排斥时期hmgb1基因转录水平未没有发生变化。

2.8.4western-blot检测异基因组和同基因组各时间点肝组织hmgb1的变化

鉴于上述结果，同基因组与假手术组两者组织学无明显差异，且转氨酶也无统计学差异，同时，血清hmgb1水平无差异，说明在同基因组与假手术组两者在移植后期无排斥反应，故检测hmgb1蛋白表达水平时，分别取异基因急性排斥组(allograft)和同基因组(syngraft)3d、7d、10d检测肝组织hmgb1蛋白表达水平。结果如图12所示：异基因急性排斥组和同基因组术后各时间点肝组织hmgb1蛋白表达无统计学差异(p>0.05)。

2.9异基因移植组术后血清转氨酶和hmgb1表达水平

在前文中发明人发现无论是在移植早期的缺血再灌注损伤还是在移植后的免疫排斥反应中，hmgb1的血清水平变化与转氨酶的变化趋势一致，因此发明人将异基因组2h、6h、12h、24h、3d、7d、10d血清alt、ast、hmgb1的表达水平放在一张图中，比较观察hmgb1与转氨酶的关系。

本实施例构建了稳定的大鼠原位肝移植模型，探讨了hmgb1在大鼠肝移植术后急性排斥阶段的表达及作用。发明人发现在肝移植急性排斥反应中，hmgb1表达水平的整体趋势与转氨酶水平的变化一致，说明hmgb1可作为肝细胞损伤的标志，并间接参与移植免疫排斥。而血清和供肝组织hmgb1早在肝移植后24h即发生改变，因此，肝移植后早期hmgb1的增高能够预警术后急性排斥反应的发生，对临床早期诊断和治疗急性排斥反应具有较好的指导意义。

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