一种新型的病理组织透明脱蜡液及其制备方法与流程

本发明涉及病理学组织切片技术领域，尤其涉及一种新型的病理组织透明脱蜡液及其制备方法。

背景技术：

石蜡切片是在观察组织形态和免疫组化等定性分析中最常用的一种切片技术，被广泛的应用于临床病理诊断和实验研究中。在病理组织处理过程中，组织经固定、脱水后，需要经过一种既能与乙醇相混合，又能溶解石蜡的溶剂处理，以便通过其媒介作用，使石蜡浸入组织块。在此过程中组织中的水分被溶剂取代，使得其折射指数接近组织蛋白的折射指数，以得到透明组织块。组织经石蜡包埋后制成蜡块，用切片机制成切片后，需要将切片中的蜡脱去才能进行染色。

目前最常用的组织透明脱蜡液主要是二甲苯，二甲苯在病理科手工制片、自动脱水机及自动染色机上均大量使用。虽然二甲苯具有良好的脱蜡和透明效果，但是却存在以下缺陷：(1)二甲苯属于具有强烈刺激性气味的神经毒素，麻痹中枢神经和植物神经，并刺激粘膜，对长期接触的人员生理系统具有选择性的特殊伤害；(2)长期使用还可引起免疫功能低下、贫血、皮炎、湿疹和皮肤干燥等症状，对病理工作人员的身体健康产生严重危害，也对环境造成一定的污染。(3)在病理组织处理过程中，使用二甲苯容易使得病理组织收缩、硬化。

为此，寻找二甲苯的替代品已经成为当前亟待解决的问题，目前已有部分二甲苯的替代品用于人体及动植物组织标本的透明和石蜡包埋的实验研究，例如专利(cn91108571.8；cn200910050030.2和cn201110023746.0)配方中皆使用松节油作为组织染色后透明，这些透明剂只有透明作用，无脱蜡作用。专利(usp7,070,951)配方中采用醇类与柠檬烯的混合物，辅以表面活性剂脱蜡；醇类本身脱蜡效果很差，会造成组织过度脱水，使标本发收缩、硬化、脆裂。此外，亦有用短链烷烃或支链烷烃做脱蜡剂，短链烷烃的缺点是气味强烈，沸点低，在环境中迅速弥散，对水质污染严重，因此对人体和环境均可能造成危害，因此不是理想的二甲苯替代品。

在cn106053187a生物组织样本切片染色套液，本发明公开了一种生物组织样本切片染色套液，包括：切片脱蜡液包括：d柠烯、甲基环己烷和表面活性剂；苏木素助染液包括：表面活性剂和饱和柠檬酸溶液；苏木素染色液包括：苏木素、无水乙醇、纯化水、高碘酸、丙三醇、柠檬酸和硫酸铝钾；分化液包括：无水乙醇、纯化水和盐酸；蓝化液包括：纯化水和氢氧化钾水溶液；伊红染色液包括：水溶性伊红、纯化水、无水氯化钙和盐酸水溶液；切片透明液包括：d柠烯、异丙醇和表面活性剂。发明设计的染色套液不仅可以满足各级医院病理科及科研院所对组织样本处理中对环保型病理学组织学试剂的要求，而且可满足常规病理诊断、免疫组织化学诊断技术、分子生物学诊断技术的要求，处理组织的效果优于传统技术。但是本申请采用的组份过多，在操作复杂的同时，还可能会造成组织损坏。

技术实现要素：

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种成分简单、效果良好、毒性低、能够生物降解的新型的病理组织透明脱蜡液，主要用于病理组织处理过程中脱水后的透明或病理切片染色封片前的脱蜡透明，解决了现有技术中存在的问题。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：

一方面，一种新型的病理组织透明脱蜡液，包括如下质量份数的组份：中长链饱和脂肪酸酯：85-100份，丙二醇类醚：0-25份。

优选的，中长链饱和脂肪酸酯：92份，丙二醇类醚：12.5份。

优选的，还包括如下质量份数的植物精油：0-1份。用于调节脱蜡液的气味。

优选的，所述中长链饱和脂肪酸酯由c原子数不小于8的中长链酸与直链醇酯化所得。

优选的，所述直链醇的碳原子数为2-8个。

优选的，所述中长链饱和脂肪酸酯为癸酸乙酯、癸酸丁酯、辛酸丁酯、十二烷酸乙酯中的一种或多种。

优选的，所述丙二醇类醚为丙二醇醚或丙二醇醚酯。

优选的，所述丙二醇类醚为丙二醇单甲醚、丙二醇正丙醚、丙二醇正丁醚、二丙二醇正丁醚、丙二醇甲醚醋酸酯中的一种或多种。

优选的，所述植物精油为橄榄油、雪松油、玫瑰油、无味松节油中的一种或多种。

另一方面，一种新型的病理组织透明脱蜡液的制备方法，包括如下步骤：

a、称取上述重量份的中长链饱和脂肪酸酯、丙二醇类醚和植物精油。

b、将a中称取的各组分倒入混合容器中，其中植物精油最后加入，室温下搅拌20-30min，以使加入的各组分混合均匀。

本发明采用上述方案，所具有的优点是：

(1)中长链饱和脂肪酸酯和丙二醇类醚均可与乙醇等脱水剂、石蜡等填充剂混溶，得到的病理组织透明脱蜡液既能用于透明、又能用于脱蜡，采用其制备的病理切片染色后在显微镜下能够观察到结构清晰的细胞结构，与二甲苯处理得到的结果基本一样，因此，可代替二甲苯使用。

(2)制备好的组织透明脱蜡液毒性低、物理性质和化学性质都较为稳定，即使加热也不会产生有害气体，符合gb18583-2008环保标准。

(3)该透明脱蜡液的组分中长链饱和脂肪酸酯因挥发性底，含有淡淡酯香，不易对人体造成危害，且可生物降解；组分中丙二醇类醚相较于二醇醚等其他醚类试剂来说，其毒性小、挥发性低，且无遗传、发育、生殖危害，对人体和环境影响也较小。

(4)微量植物精油的加入不仅不会破坏组织，还可以调节透明脱蜡液的的香气，使之更易于组织处理人员接受。

该新型的病理组织透明脱蜡液的各组分，因其分子量较大，组织处理过程较温和、缓慢，不仅不易引起组织变形、硬化，且有利于得到透明、脱蜡效果较好的组织切片染色样本，还不会对组织细胞结构和组织细胞内其他成分以及组织抗原造成破坏，符合临床病理诊断和研究所要求优质染色片的要求，同时也符合实验室环保的要求，相较二甲苯更具使用优势。

附图说明

图1中1a、1b分别为本发明采用样品1处理的实验②与其对照组二甲苯处理制得的乳腺病理组织切片的he染色样本；

图2中2a、2b分别为本发明采用样品1处理的实验④与其对照组二甲苯处理制得的肺病理组织切片的he染色样本；

图3中3a、3b分别为本发明采用样品2处理的实验②与其对照组二甲苯处理制得的肝病理组织切片的he染色样本；

图4中4a、4b分别为本发明采用样品2处理的实验④与其对照组二甲苯处理制得的肾病理组织切片的he染色样本；

图5中5a、5b分别为本发明采用样品3处理的实验②与其对照组二甲苯处理制得的宫颈病理组织切片的he染色样本；

图6中6a、6b分别为本发明采用样品3处理的实验④与其对照组二甲苯处理制得的扁桃体病理组织切片的he染色样本；

图7中7a、7b分别为本发明采用样品4处理的实验②与其对照组二甲苯处理制得的胆囊病理组织切片的he染色样本；

图8中8a、8b分别为本发明采用样品4处理的实验④与其对照组二甲苯处理制得的阑尾病理组织切片的he染色样本；

图9中9a、9b分别为本发明采用样品5处理的实验②与其对照组二甲苯处理制得的甲状腺病理组织切片的he染色样本；

图10中10a、10b分别为本发明采用样品5处理的实验④与其对照组二甲苯处理制得的胎盘病理组织切片的he染色样本；

图11中11a、11b分别为本发明采用样品6处理的实验②与其对照组二甲苯处理制得的肠息肉病理组织切片的he染色样本；

图12中12a、12b分别为本发明采用样品6处理的实验④与其对照组二甲苯处理制得的肺癌病理组织切片的he染色样本；

图13中13a、13b分别为本发明采用样品1处理的实验⑤与其对照组二甲苯处理制得的肺病理组织切片的cd5/6免疫组化染色样本；

图14中14a、14b分别为本发明采用样品1处理的实验⑤与其对照组二甲苯处理制得的肺病理组织切片的ttf-1免疫组化染色样本；

图15中为15a、15b分别本发明采用样品2处理的实验⑤与其对照组二甲苯处理制得的肝病理组织切片特殊染色(胶原纤维染色)100×显微倍率染色样本；

图16中为15a、15b分别本发明采用样品2处理的实验⑤与其对照组二甲苯处理制得的肝病理组织切片特殊染色(胶原纤维染色)200×显微倍率染色样本。

具体实施方式：

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合其附图，对本发明进行详细阐述。以下实施例均以相同处理时间、温度的二甲苯操作为对照。

1、实验对象：病理组织(乳腺、肺、肝、肾、宫颈、扁桃体、胆囊、阑尾、甲状腺、胎盘、肠息肉、肺癌)，病理组织均取自人体离体病变组织。

2、实验试剂：组织透明脱蜡液/二甲苯。

3、实验过程：

(1)制备实验所需组织透明脱蜡液，制备方法如下：

a、称取上述重量份的中长链饱和脂肪酸酯、丙二醇类醚、植物精油。

b、将a中称取的各组分倒入混合容器中，其中植物精油最后加入，之后在室温下搅拌一定时间，以使加入的各组分混合均匀，搅拌时间为20-30min。

其中，还可以在上述成分中加入表面活性剂，表面活性剂的种类可以为阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂或双性离子表面活性剂。

采用上述制备方法制备组织透明脱蜡液的各组实验数据如表1：

表1组织透明脱蜡液的样品数据

(2)采用二甲苯(对照组)/上述1-8样品的透明脱蜡液(实验组)分别对选取的各种组织进行病理切片制备，制备方法如下：

a、取样：使用手术器材对病变区操作，取病变组织，大小1*1*0.2cm。

b、固定：将取材后的病变组织放入脱水机中，设定三缸固定液的固定时间共3h。

c、脱水：采用体积浓度由低到高的酒精溶液(采用75％、85％、95％的无水乙醇)依次对病变组织进行浸泡，使得乙醇将病变组织内的水分置换出来。

d、透明：采用本发明的透明脱蜡液/二甲苯对经过无水乙醇脱水后的病理组织浸泡120min，第二遍仍为120min，使得透明脱蜡液/二甲苯将病变组织内的乙醇置换出来。在加温、加压作用下，透明脱蜡液的透明时间可缩短。

e、浸蜡：将透明好的病理组织置于融化的石蜡中一定时长，使得石蜡浸入组织内。

f、包埋：将浸蜡后的病理组织置于充满蜡液的包埋器中，待蜡液凝固后，将包埋器冷却，然后取下蜡块。

g、切片：将蜡块修整后，切成3μm厚度的组织切片，捞至载玻片上，置于干燥箱中70℃下烤片30min。

h、脱蜡：将病理切片浸泡于盛放有透明脱蜡液/二甲苯的ⅰ缸、透明脱蜡液/二甲苯的ⅱ缸、透明脱蜡液/二甲苯的ⅲ缸中各4min进行脱蜡，透明脱蜡液的温度设定为35ˉ40℃。

i、染色：按实验室流程进行染色、再脱水处理，时间以具体操作为准。

j、再透明：采用透明脱蜡液/二甲苯的对病理切片浸泡透明3次，每次时长4min。

k、封片：向切片上滴加树胶，然后置于载玻片与盖玻片之间，完成封片作业即可。

(采用特殊染色或免疫组化染色的病理切片步骤不再作详细介绍)

4、实验结果：

将采用上述步骤制得的各组织病理切片的染色样本置于显微镜下观察，其中用0和1分别表示步骤c中经过酒精处理液脱水处理后组织完全脱水和非完全脱水两个状态，本实验室经验是常规处理1400个标本左右更换处理液，完全脱水是指前1400个标本，非完全脱水默认是达到处理量后再处理的标本(限制到200个标本)；将各实验结果进行评分，以在组织透明脱蜡液处理的情况下，样品2实验②的组织蜡块切片与显微镜下组织切片表现的和为基本标准100分值，以在二甲苯处理的情况下，样品2实验③的组织蜡块切片与显微镜下组织切片表现的和为基本标准90分值，则其他各实验观察结果如下表：

表2采用组织透明脱蜡液/二甲苯处理完全脱水和

非完全脱水状态下各组织病理切片染色样本的观察结果

由上表2可知：

(1)将样品1-8的实验②、④的切片及镜下阅片结果与各自采用二甲苯对照组的结果相比，实验组和对照组处理结果较为一致；将样品1、2的实验⑤与其二甲苯对照组相比，其实验组和对照组处理效果较为一致，使用本发明透明脱蜡液制备的组织蜡块不影响后续的组织切片操作。由此可知，本发明的组织透明脱蜡液的透明、脱蜡效果与二甲苯的透明、脱蜡效果是基本相同的，从图1-16中可以看出，二者得到的各组织切片的细胞结构均较为清晰、背景对比度均较高。因此，本发明所制得的组织透明脱蜡液可作为二甲苯的替代品使用。

(2)将样品6的实验①和②或③和④的切片及镜下阅片结果对比可知，对肠息肉组织或肺癌组织进行组织切片染色样本制备过程中，完全脱水组织的处理结果比非完全脱水组织的处理结果好，与其各自二甲苯对照组对比可知，长链饱和脂肪酸酯具有透明、脱蜡效果，且处理效果与二甲苯一致。

(3)将样品6的实验①和③分别与样品7的实验①和③的切片及镜下阅片结果对比可知，针对非完全脱水组织，在中长链饱和脂肪酸酯中加入丙二醇类醚后其处理效果明显优于加入之前的处理效果，与二甲苯对照组结果相比，其得到的组织蜡块更易切片，镜下结果更清晰，由此可知，丙二醇类醚油水均可溶的性质使之在组织处理过程中可以起到一定的脱蜡和补充脱水效果。

(4)将样品1-5的实验组处理结果与样品6和样品7的实验切片及镜下阅片结果对比可知，配方中加入植物精油后不仅对组织出片无影响。且加入后在使得组织透明脱蜡液的气味更易于技术人员接受。

(5)从样品8的实验切片及镜下阅片结果可知，还可在组织透明脱蜡液中加入表面活性剂，处理结果与其二甲苯对照组相一致，可以得到透明、脱蜡处理效较好的组织切片染色样本。

综上可知，制备的组织透明脱蜡液，其丙二醇类醚在组织处理过程中具有一定的补充脱水作用；中长链饱和脂肪酸酯具有与二甲苯相一致的透明脱蜡效果作用；植物精油的加入不仅对组织出片无影响，且加入后使得组织透明脱蜡液的气味更易于技术人员接受。通过本发明的组织透明脱蜡液处理组织后，切片更容易，且可以得到与二甲苯处理效果较为一致的切片染色样本，镜下观察可知，其切片染色样本的组织细胞结构均较为清晰，背景对比度较高。由此可知，二者的透明、脱蜡效果基本相同。因此，可作为二甲苯的替代品使用。

此外，该新型的病理组织透明脱蜡液，毒性低、物理性质和化学性质都较为稳定，即使加热也不会产生有害气体，符合gb18583-2008环保标准；因其组分分子量较大，组织处理过程较温和、缓慢，不仅不易引起组织变形、硬化，且不会对组织细胞结构和组织细胞内其他成分以及组织抗原造成破坏，符合临床病理诊断和研究所要求优质染色片的要求，同时也符合实验室环保的要求；组分中长链饱和脂肪酸酯具有油性物质特性，不溶于水，其脱蜡效果较好，或在完全脱水后透明效果更好，且因挥发性底，含有淡淡酯香，不易对人体造成危害，并可生物降解；组分中丙二醇类醚不仅可以与水互溶也可以与油互溶，对于组织切片的透明效果较好，且相较于二醇醚等其他醚类试剂来说，其毒性小、挥发性低，且无遗传、发育、生殖危害，对人体和环境影响也较小；组分中微量植物精油的加入可以调节透明脱蜡液的的香气，更易于组织处理人员接受；

综上可知，本发明制备的组织透明脱蜡液，更具使用优势，可完全代替二甲苯使用。

上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本领域技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员公知技术。