一种水稻柱头长度的测量方法与流程

本发明属于水稻异交相关性状调查方法领域，具体涉及一种水稻柱头长度的测量方法。

背景技术：

水稻是我国最重要的粮食作物，也是世界上最重要的粮食作物之一，全国有65%以上的人口以稻米为主食。在人口持续增长而耕地却以数百万亩的速度逐年减少的情况下，要保障几十亿人口的粮食安全，大幅度的提高单位面积产量是必然选择。始于我国20世纪70年代的杂交水稻，较同熟期的常规稻单产增加15%左右，其商业化种植使水稻生产力有了大幅度提高。实践证明，利用水稻杂种优势提高水稻单产是最有效的途径之一。

杂交水稻需要年年生产一代杂种种子。我国是世界最大的杂交水稻种子生产和消费国，每年杂交水稻种植面积为1400万公顷，需杂交水稻种子约35万吨。研究表明限制杂交水稻制种产量的主要因素是不育系异交结实率低。水稻母本颖花柱头外露是影响杂交稻制种异交结实率的决定因素。柱头外露是指水稻开花结束后，雌蕊柱头仍然留在颖壳外的现象。柱头外露率是指柱头外露颖花数占调查总颖花数的百分率，是水稻重要的异交性状。由于外露柱头展开度大、花粉承接面积增加、解除了颖壳对外源花粉的传播障碍以及开花的第二天甚至若干天仍有授粉机会。蔡俊迈等（1987）研究发现，不育系v41a和v20a开花当天未授粉的颖花，凭外露柱头在田间自由授粉，天然异交率分别可达到35%和37%。说明不育系柱头外露率越高，就越有利于异交。柱头外露率属数量性状遗传，不同研究者利用不同定位群体在水稻所有12条染色体共检测到104个控制该性状的qtl。然而，柱头外露率易受各种外界环境（如抽穗开花期的天气、湿度、温度等）的影响，加之性状调查步骤繁琐、误差大，导致初定位后很难进行后续的深入研究。

前人研究表明水稻柱头外露率与雌蕊长度、柱头长度、小穗长度呈显著正相关，这种正相关大多由一因多效引起。takano-kai等（2011）经转基因研究发现，控制水稻籽粒长度的gs3等位基因在幼嫩柱头的基部表达，该基因通过增加柱头非羽状段的细胞数目进而增加柱头长度以及提高柱头外露率。雌蕊柱头发育、伸长在颖花内，受环境影响小，表型调查准确度高，生物学过程较易阐释，因而与柱头外露率相比，以柱头长度为异交性状指标进行qtl定位、精细定位乃至后续的基因克隆和功能分析更可靠易行。

但目前对于水稻柱头长度的研究报道较少，这可能一是由于柱头长度的取样程序繁琐，没有统一的标准。2012年陈兰等在水稻花药成熟但未散粉时每穗上取5朵颖花进行柱头长度的调查，这在时间上不易掌握，特别是大群体材料；2017年吴健等在晴天的中午或下午，对5个当天开放的颖花进行柱头长度的调查；二是由于没有统一的测量标准，陈兰等（2012）是在双目解剖镜下进行剥离及测量，而吴健等（2017）用相机拍照，再用imagej软件对柱头长度进行测量。申请者曾对不同时期（刚抽穗、开花前、正开花以及闭颖后）的柱头长度调查发现，同一材料4个不同时期的柱头长度差异大。水稻柱头长度本身很小（1.0mm—3.0mm），取样及测量过程中的任一环节出现误差，都会给表型数据带来较大的差异。本发明中的测量方法从颖花的取样时期、后续的保存、柱头长度调查前的准备、柱头长度的剥离、校准、拍照、测量等各环节进行详细的介绍，测量出的柱头长度表型数据准确、可靠，可重复性高。此方法的应用对于长柱头水稻种质资源的发掘和高异交率不育系的选育以及柱头长度基因的挖掘、克隆和功能验证都具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种水稻柱头长度测量的方法，该方法从取样、剥离、拍照、测量及数据处理等各环节进行了详细的介绍，其测量的柱头长度表型数据准确可靠。通过本方法调查的柱头长度性状，可用于长柱头有利基因的挖掘、精细定位、克隆和功能分析，同时利用发掘的长柱头基因改良水稻不育系，增加水稻不育系的柱头长度，从而提高水稻柱头外露率，增加制种产量。

本发明提供了一种水稻柱头长度测量的方法。该方法包括以下步骤：

（1）取样：将水稻试验材料种植于试验田中，待试验材料处于盛花期时，用眼科镊子（带齿）（附图1a）从主茎穗（最高穗）上夹住正在开放的颖花基部（不要触碰到颖壳，以免破坏柱头），取下将其装入事先准备好的盛有1.5ml清水的离心管中（附图2），每份材料取8朵颖花，带回实验室当天测量；

（2）调焦：打开连接电脑带有摄像头（mdx4，广州市明美光电技术有限公司）的体式显微镜（mz11，广州市明美光电技术有限公司）及其软件（附图3），将标尺置于体式显微镜的视野中，调节焦距，直到标尺上面的刻度清晰可见，拍照保存（附图4），此后焦距不再调整；

（3）剥花、拍照：将保存于离心管中的8朵颖花取出放在2.5cm*7.5cm的载玻片上，拨出一朵颖花，左手用vetus镊子（18cm）（附图1c）压住内颖边缘，右手用vetus镊子（14cm）（附图1b）将其外颖剥离（附图5a），露出柱头，从花柱处用镊子将柱头与颖壳夹断，再用镊子将2个柱头拨直，使其与花柱之间呈一定的角度（150°左右）（附图5b），以此类推，8朵花16个柱头作2排排列于载玻片上，每排4朵（附图5c）；将剥好柱头的载玻片置于体式显微镜的载物台上（附图6a），点击“拍照—保存”，以备测量（附图6b）；

（4）测量：打开明美显微数码测量分析系统，点击“文件—打开图像到测量—打开标尺—插入单位标尺—设置参数—拍照保存”（附图7a），再次点击“文件—打开图像到测量—打开待测柱头的照片—插入线段—逐一测量柱头长度—导出文档—保存”，即完成测量（附图7b）；

（5）数据处理：导出到excel表中的16个柱头长度的均值即为该材料的柱头长度（附图7c）。

本发明的测量方法中，（1）所采用的取样时间统一为颖花正在张开且尚未闭合的时候，此时的柱头长度已达到最大值且不再变化。

本发明的测量方法中，为了便于柱头长度测量的准确性，（2）中的焦距校正后，此时的镜头不再调整，若移动后，此时的焦距需要重新校正，标尺重新拍照，测量时用更新后的标尺。

本发明的测量方法中，步骤（3）水稻柱头剥离后一定要拉直，因为测量的柱头长度是柱头顶部到柱头和花柱交接点两点间的直线距离。

本发明的测量方法是一种水稻柱头长度的取样、剥离、测量及分析的方法。

水稻的花器构造：稻穗由主轴、一次枝梗、二次枝梗、小穗梗和小穗组成；每个小穗由基部的2片退化颖片（副互颖）小花梗和3朵小花构成；3朵小花中，顶端1朵正常发育，其下2朵均退化，仅见两片外稃（互颖）；可育小花有外颖、内颖、2个浆片、6枚雄蕊和1枚雌蕊；花药有4个花粉囊，柱头二裂呈羽毛状。

水稻柱头：是指水稻的雌蕊，是水稻的雌性生殖器官，其正常受精结实可发育成水稻种子。

柱头长度是指从水稻的花柱与柱头的交界处至柱头顶端的长度。

本发明的测量方法在水稻遗传育种方面有以下用途：

1、利用本发明测量的柱头长度数据准确，可用于长柱头水稻新材料、新资源的发掘；

2、利用本发明测量的柱头长度数据，可对控制该性状的基因进行精细定位、克隆乃至功能分析和验证；

3、利用本发明挖掘到的长柱头基因改良水稻两系/三系不育系，改良的长柱头不育系进行杂交水稻制种时可提高制种产量，降低制种成本。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种水稻柱头长度测量的方法。率先将柱头长度的整套测量流程进行了系统的规定，从而创建了一个可以准确测量水稻柱头长度的方法，解决了水稻柱头长度测量过程中不同研究者取样时期和测量标准的不同，降低了柱头长度表型数据测量过程中人为操作出现的误差，大大提高了柱头长度表型数据的准确度，实现了水稻柱头长度测量的标准化流程。

附图说明

图1取花及柱头剥离时使用的镊子：图1a，田间颖花取样时所用的眼科专用镊子（带齿），夹住小穗梗后不易移动，颖花不易掉落，避免破坏颖花；图1b和图1c，均为柱头剥离时所用的vetus镊子，长度分别为14cm和18cm，该镊子尖头，对于柱头的剥离等精细操作实用性高。

图2颖花的保存：将注入清水的2ml离心管按取样需要排列于100孔的离心管盒中。

图3拍照的体式显微镜及其连接的电脑：为取得好的拍摄效果，拍照时在体式显微镜的载物台上垫上白色纸张（紫色柱头）或灰色纸张（无色柱头）。

图4标尺：在柱头长度的测量拍照之前，先将标尺放置于载物台上，调焦、拍照（标尺）、保存。

图5柱头剥离流程：图5a，左手用vetus镊子（18cm）压住内颖边缘，右手用vetus镊子（14cm）将其外颖剥离；图5b，将柱头从花柱处用镊子夹断，再用镊子将2个柱头拨直，使其与花柱之间呈一定的角度（150°左右）；图5c，8朵花的16个柱头置于载玻片上作2排排列，每排4朵，排列紧凑。

图6柱头拍照：图6a，将载有排列整齐的柱头置于载物台上，从电脑上观察柱头上的水滴不成团时，拍照；图6b，拍照的柱头照片。

图7柱头长度的测量：图7a，打开明美显微数码测量分析系统，点击“文件—打开图像到测量—打开标尺—插入单位标尺—设置参数—拍照—保存”；图7b，再次点击“文件—打开图像到测量—打开待测柱头的照片—插入线段—逐一测量柱头长度—导出文档—保存”；图7c，将16个柱头长度的数值导出到excel表进行柱头长度的统计。

实施案例：8个不同材料的柱头长度的测量

1水稻材料：

c堡、r254、镇稻11、马来红、华占、株1s、c815s、z913s。

2试验方法：

2018年正季将8份材料种植于安徽省农业科学院水稻研究所庐江郭河基地，5月13日播种，6月14日移栽。取样日期、柱头长度表型值等见表1。

表18份不同试验材料的取样日期及柱头长度数据的统计

3结果与分析：

8份试验材料包含4份粳稻、4份籼稻（其中3份为籼型温敏核不育系）。从结果来看，本实验中的籼稻材料其柱头长度要高于粳稻材料，而籼型温敏核不育系要高于恢复系，不同材料的柱头长度间存在显著差异；从变幅来看，同一材料不同柱头间的长度存在一定的差异，但差异较小，其标准差介于0.06-0.10之间。