一种基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法与流程

本发明属于分析检测技术领域，特别涉及一种基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法。

背景技术：

秀丽线虫(caenorhabditiselegans)是一种对环境因素变化非常敏感的模式生物，具有繁殖周期短、易于培养的优点，近年来被广泛应用于重金属、纳米材料的环境毒理学评价中。秀丽线虫遗传背景清楚，与高等动物具有相似的细胞分子结构以及信号通路，可以从宏观和分子水平解析环境毒物的毒效应及作用机制；运动速率、生长发育和生命周期等指标由于简单易测，常作为毒效应评价中的指标。

邻苯二甲酸酯类塑化剂是一类高分子材料助剂，因可以提高塑料的柔韧性而广泛应用于塑料玩具、各种包装材料、胶管、乙烯地板等产品中。用秀丽线虫测定塑化剂毒性的方法已经有所研究，其方法涉及塑化剂对秀丽线虫运动行为、代谢、脂肪积累及寿命等行为和代谢指标的影响等多个方面。塑化剂是一类存在于环境中的污染物，人类及生物体的实际接触方式是多世代、重复或持续、低剂量的接触，不会发生急性毒作用，但长期低浓度接触可能会产生预想不到的作用，研究与确定化合物的长期重复接触毒作用在化合物的毒性效应评价中至关重要。已有研究通常只在秀丽线虫生命周期的某一时间段接受暴露，并不是整个生命时期的暴露，没有考虑从卵发育到成虫的敏感时间段，也没有考虑秀丽线虫多个世代持续暴露的真实环境条件，因而还无法判断真实环境中的塑化剂所产生的毒效应及生态风险，无法表征塑化剂对环境生物及其子代的长期作用是否具有蓄积毒性效应。而如果采用传统蓄积毒性方法，则是以致死量作为评价终点的，也不能体现多世代持续低剂量接触的实际环境暴露水平。

技术实现要素：

本发明提供一种方便快捷、成本低廉、操作简单的用秀丽线虫测定邻苯二甲酸酯类塑化剂的跨世代蓄积毒性的方法，对模拟实际环境暴露情形下的毒性研究方法进行了补充和扩展。

本发明提供了一种基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法，包括以下步骤：

s1，培养秀丽线虫至产卵期，用磷酸钾缓冲液清洗并收集产卵期秀丽线虫，再用裂解液裂解秀丽线虫母体并收集对裂解液有抵抗能力的虫卵，用磷酸钾缓冲液清洗，加入磷酸钾缓冲液调整秀丽线虫虫卵浓度为10枚/μl，得处于同一时期的虫卵溶液；

s2，将s1中的虫卵溶液培养12-18h，使虫卵孵化但保持在l1幼虫时期，将l1幼虫培养至l4幼虫时期，用磷酸钾缓冲液清洗并调整l4幼虫浓度为19-21条/100μl，得幼虫溶液；用磷酸钾缓冲液清洗并调整大肠杆菌op50溶液在波长570nm时吸光度1.2-1.4，得菌液；

s3，设置不同的待检塑化剂样品浓度梯度，每个浓度塑化剂样品中依次加入s2中的幼虫溶液和菌液，20℃下染毒培养48h，4h/次记录虫体死亡数，计算塑化剂样品的lc50；

其中，塑化剂样品：幼虫溶液：菌液的体积用量比为2:1:1；

s4，配制lc50的1/1000浓度的塑化剂样品，加入s1中的虫卵溶液、s2中的菌液，20℃下染毒培养48h，记为p0代，然后分别测定p0代寿命、体长、身体弯曲和头部摆动频率指标；

其中，塑化剂样品：虫卵溶液：菌液的体积用量比为2:1:1；

s5，用磷酸钾缓冲液将s4中p0代清洗并收集，重复s1、s4并分别获得f1代、f2代、f3代的寿命、体长、身体弯曲和头部摆动频率指标；

s6，如果f1代与p0代各指标差异中任一项有统计学意义，则塑化剂样品有明确的世代蓄积毒性；如果f1代与p0代各指标差异均无统计学意义，且f2代与p0代各指标差异中任一项有统计学意义，则塑化剂样品有中等的世代蓄积毒性；

如果f1代与p0代、f2代与p0代各指标差异均无统计学意义，且f3代与p0代各指标差异中任一项有统计学意义，则塑化剂样品有轻度的世代蓄积毒性；如果f1代与p0代、f2代与p0代、f3代与p0代各指标差异均无统计学意义，则塑化剂样品无明确世代蓄积毒性。

优选地，上述塑化剂样品为邻苯二甲酸酯类塑化剂。

优选地，上述s1、s2中秀丽线虫的培养条件均为：20℃下在ngm培养基中培养。

优选地，上述磷酸钾缓冲液中含53mmol/l的nacl和32mmol/l的kcl。

优选地，上述s1中裂解液的组成：0.45mol/l的naoh和质量浓度为2％naclo。

优选地，上述配制塑化剂样品溶液时以体积浓度为1％的二甲亚砜溶液为溶剂。

优选地，上述塑化剂样品溶液的浓度≤20mg/ml。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供一种方便快捷、成本低廉、操作简单的用秀丽线虫测定邻苯二甲酸酯类塑化剂的跨世代蓄积毒性的方法，更加贴近塑化剂实际环境暴露情形，对模拟实际环境暴露情形下的毒性研究方法进行了补充和扩展；采用秀丽线虫对塑化剂进行涵盖p0代、f1代、f2代、f3代多个连续世代的持久性暴露，从而检测该塑化剂的长期毒性效应，并判断该毒性效应在长期跨世代的暴露条件下是否具有蓄积毒性效应。

附图说明

图1为本发明实施例1中lc50的1/1000浓度的dehp对秀丽线虫寿命的影响图；

图2为本发明实施例1中lc50的1/1000浓度的dehp对秀丽线虫体长的影响图；

图3为本发明实施例1中lc50的1/1000浓度的dehp对秀丽线虫身体弯曲行为的影响图；

图4为本发明实施例1中lc50的1/1000浓度的dehp对秀丽线虫头部摆动行为的影响图；

图5为本发明实施例2中lc50的1/1000浓度的dbp对秀丽线虫不同世代寿命的影响图；

图6为本发明实施例2中lc50的1/1000浓度的dbp对秀丽线虫不同世代体长的影响图；

图7为本发明实施例2中lc50的1/1000浓度的dbp对秀丽线虫不同世代身体弯曲行为的影响图；

图8为本发明实施例2中lc50的1/1000浓度的dbp对秀丽线虫不同世代头部摆动行为的影响图；

其中，图2-图4、图6-图8中的“＊”表示p＜0.05，“＊＊”表示p＜0.01。

具体实施方式

下面结合附图1-8对本发明的一个具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例1

一种基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

s1，20℃下在常规ngm培养基中培养秀丽线虫至产卵期，用磷酸钾缓冲液清洗并收集产卵期秀丽线虫，再用裂解液裂解秀丽线虫母体并收集对裂解液有抵抗能力的虫卵，用磷酸钾缓冲液清洗，加入磷酸钾缓冲液调整秀丽线虫虫卵浓度为10枚/μl，得处于同一时期的虫卵溶液；

裂解液的组成：0.45mol/l的naoh和质量浓度为2％naclo。

s2，将s1中的虫卵溶液20℃下在常规ngm培养基中培养12-18h，使虫卵孵化但保持在l1幼虫时期，将l1幼虫培养至l4幼虫时期，用磷酸钾缓冲液清洗并调整l4幼虫浓度为19-21条/100μl，得幼虫溶液；

用现有lb液体培养基在37℃、200rpm条件下将大肠杆菌op50培养24-48h，4000rpm离心5-10min，弃上清液保留沉淀，用磷酸钾缓冲液清洗并调整大肠杆菌op50溶液在波长570nm时吸光度1.2-1.4，得菌液；

s3，等对数间距设置10个待检塑化剂样品浓度梯度，每个浓度塑化剂样品中依次加入s2中的幼虫溶液和菌液，20℃下染毒培养48h，4h/次记录虫体死亡数(体视显微镜下观测，虫体僵直则认定为死亡)，以浓度对数为横坐标，死亡率为纵坐标，采用直线内插法计算塑化剂样品的半数致死浓度，即lc50；

若所设定浓度梯度所产生的死亡率均小于50％，则保持待测样品最低浓度不变，适当增加所采用的等对数间距，设定较高的浓度梯度；若所设定的浓度梯度所产生的死亡率均大于50％，则保持待测样品的最高浓度不变，适当增加所采用的等对数间距，设定较低的浓度梯度；然后进行染毒培养，直至获得lc50。若最高浓度已经达到20mg/ml而死亡率仍低于50％，则以20mg/ml最为后续计算标准；

其中，s3中塑化剂样品：幼虫溶液：菌液的体积用量比为2:1:1；

s4，配制lc50的1/1000浓度的塑化剂样品，加入s1中的虫卵溶液、s2中的菌液，20℃下染毒培养48h(虫卵已长成成虫)，记为p0代，然后分别测定p0代寿命、体长、身体弯曲和头部摆动频率指标；

其中，s4中塑化剂样品：虫卵溶液：菌液的体积用量比为2:1:1；

s5，用磷酸钾缓冲液清洗并收集s4中处于产卵期的p0代清洗并收集，重复s1、s4并分别获得f1代、f2代、f3代的寿命、体长、身体弯曲和头部摆动频率指标；

s6，如果f1代与p0代各指标差异中任一项有统计学意义，则塑化剂样品有明确的世代蓄积毒性；如果f1代与p0代各指标差异均无统计学意义，且f2代与p0代各指标差异中任一项有统计学意义，则塑化剂样品有中等的世代蓄积毒性；

如果f1代与p0代、f2代与p0代各指标差异均无统计学意义，且f3代与p0代各指标差异中任一项有统计学意义，则塑化剂样品有轻度的世代蓄积毒性；如果f1代与p0代、f2代与p0代、f3代与p0代各指标差异均无统计学意义，则塑化剂样品无明确世代蓄积毒性。

需要说明的是，用数据分析软件spss对两个世代的寿命、体长、身体弯曲和头部摆动频率中任一个指标做差异分析时，若p＜0.05，则说明该指标有统计学意义。

上述磷酸钾缓冲液中含53mmol/l的nacl和32mmol/l的kcl；配制塑化剂样品溶液时以体积浓度为1％的二甲亚砜溶液为溶剂。

为验证本发明的准确性，实施例1的塑化剂样品采用dehp(邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯)，设置的待检塑化剂样品浓度梯度为：0μg/ml、0.02μg/ml、0.08μg/ml、0.32μg/ml、1.28μg/ml、5.12μg/ml、20.48μg/ml、81.92μg/ml、327.68μg/ml、1310.72μg/ml，dehp塑化剂样品以100μl/孔加入96孔板中，幼虫溶液、虫卵溶液和菌液均以50μl/孔加入96孔板中，dehp的lc50为204.8μg/ml。dehp对秀丽线虫不同世代寿命、体长和运动行为影响如图1-图4所示，从图中可以看出0.2μg/ml的dehp暴露后秀丽线虫寿命随着暴露世代的延长逐渐缩短，生长发育受到影响，体长变小，运动行为能力受损，头部摆动和身体弯曲的频率随暴露时代的延长而下降更为明显，f1代与p0相比具有显著性差异，p＜0.05，因此0.2μg/ml的dehp对秀丽线虫具有明确的世代蓄积效应。

实施例2

实施例2与实施例1的步骤和试剂用法用量都相同，区别在于实施例2采用dbp(邻苯二甲酸二丁酯)为待检塑化剂样品，dbp的lc50为211.7μg/ml。dbp对秀丽线虫不同世代寿命、体长和运动行为影响如图5-图8所示，从图中可以看出0.2μg/ml的dbp暴露后秀丽线虫寿命随着暴露世代的延长逐渐缩短，生长发育受到影响，体长变小，运动行为能力受损，头部摆动和身体弯曲的频率随暴露时代的延长而下降更为明显，f1代与p0代相比具有显著性差异，p＜0.05，因此0.2μg/ml的dehp对秀丽线虫具有明确的世代蓄积效应。

需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。