一种储粮害虫磷化氢抗性的测定设备及其使用方法与流程

本发明涉及粮食存储技术领域。更具体地，涉及一种储粮害虫磷化氢抗性的测定设备及其使用方法。

背景技术：

磷化氢作为粮食熏蒸剂有很多优势，比如它具有很高的熏蒸效率，还具有挥发性好、杀虫毒力高、扩散速度快、基本无残留且不影响谷物品质和种子活力、价格低廉、使用方便等特点。

昆虫本身是存在一定耐药性的，所谓耐药性是指昆虫首次接触某种杀虫剂所表现出的抵抗能力，也称为天然抗性。但是多次用药就会产生抗药性，抗药性是由于在同一地区连续使用同一种药剂而引起昆虫对药剂抵抗力的不断提高，最终导致防治失败，防治失败的原因不是因为药剂的品质及使用方法的不当，而是由于害虫对杀虫剂的敏感性发生了遗传性的改变。由于长期单一地使用磷化氧，对其作用特性和杀虫机理也不太清楚，再加上较差的粮仓熏蒸条件、较少的药物施放量、较短的磷化氧接触时间这些不科学的使用方法造成杀虫不彻底，导致害虫对憐化氯的抗性越来越严重。目前越来越多的人开始研究磷化氢的杀虫机理和其毒理学机制，为进一步科学的使用磷化氢提供了理论基础。

传统的磷化氢抗性测试实验中气体的制备主要采用fao规定的化学方法制备，磷化氢气体浓度的精确性不高，具体实验对实验人员和实验条件要求都比较严格，存在很多的不便利操作问题。

近年来我国主要储粮害虫对磷化氢产生了抗性，特别是通过近年来的调查研究发现锈赤扁谷盗的抗性相比于其他储粮害虫更加的严重，对磷化氢产生了很强的抗药性。一些地区的锈赤扁谷盗抗性倍数已经超过600倍，属于极高的抗性品系，用2mg/l的浓度进行击倒实验部分品系半数击倒时间达到7000min以上。因此为了解决实践中遇到的诸多问题，需要提供一种储粮害虫磷化氢抗性的测定设备和方法。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种储粮害虫磷化氢抗性的测定设备，利用该设备可快速、方便、准确地测定储粮害虫抗性程度。

本发明的第二个目的在于提供一种如上所述的储粮害虫磷化氢抗性的测定设备的使用方法。

为达到上述第一个目的，本发明采用下述技术方案：

一种储粮害虫磷化氢抗性的测定设备，所述设备包括：

两端分别设有进气口和排气口的主管路；所述进气口和排气口之间的主管路上依次设置有若干组并列的观察罐、高浓度ph3探测装置、第三滤毒罐和o2探测装置；

与观察罐并联的并联管路；所述并联管路的进口位于观察罐前端的主管路上，所述并联管路的出口位于观察罐与高浓度ph3探测装置之间的主管路上；以及

净化管路；所述净化管路的进口与并联管路连通，所述净化管路的出口位于o2探测装置后端的主管路上；所述净化管路上依次设有真空泵阀和真空泵；所述真空泵阀和真空泵之间的净化管路上连接有排空管路，所述排空管路上设有破空阀；

所述设备还包括低浓度ph3探测装置和第二滤毒罐；所述低浓度ph3探测装置通过第一支管路与真空泵阀和真空泵并联，所述第二滤毒罐通过第二支管路与真空泵阀和真空泵并联；

所述并联管路的进口和所述净化管路的进口之间的并联管路上设有观察罐前系统处理阀；所述净化管路的进口和所述并联管路的出口之间的并联管路上设有观察罐后系统处理阀。

优选地，所述进气口和排气口之间的主管路上包括有至少三组并列的观察罐。

优选地，所述设备还包括气源管路，所述气源管路的出口与主管路的进气口连通；

所述气源管路上设有供气装置，所述供气装置包括并联的n2吹扫气源装置和ph3/空气测试气源装置。

优选地，所述n2吹扫气源装置后端的气源管路上设有n2阀；所述ph3/空气测试气源装置后端的气源管路上设有原料气阀。

优选地，所述气源管路的出口与所述并联管路的进口之间的主管路上设有减压器。

优选地，第一支管路的出口和第二支管路的出口之间的净化管路上包括有第一滤毒罐。

优选地，所述低浓度ph3探测装置前端的第一支管路上包括有第二探测器阀；所述第二滤毒罐前端的第二支管路上包括有置换放空阀；所述并联管路的出口与高浓度ph3探测装置之间的主管路上包括有第一探测器阀；所述并联管路的进口与观察罐之间的主管路上依次设有第一系统阀和第一观察罐阀；所述观察罐与所述并联管路的出口之间的主管路上依次设有第二观察罐阀和第二系统阀。

优选地，所述主管路、并联管路和净化管路的材料均为ep级管材。

为达到上述第二个目的，本发明采用下述技术方案：

一种如上所述的储粮害虫磷化氢抗性的测定设备的使用方法，包括以下步骤：

1)打开第一系统阀、第一观察罐阀、第二观察罐阀、第二系统阀和第一探测器阀，其余阀均关闭，打开原料气阀，缓慢开启减压器，调节流量至略高于大气压力，待高浓度ph3探测装置显示浓度达到要求浓度，且o2探测装置显示的氧气含量符合要求时，关闭减压器，再关闭原料气阀，待观察罐内的压力接近大气压力时，即排气口无气体流出时，关闭第一观察罐阀、第二观察罐阀，取样完成；

打开观察罐前系统处理阀及置换放空阀，然后打开减压器放空减压器前端管道内的残留气体至平压，关闭减压器、观察罐前系统处理阀、置换放空阀；

2)打开n2吹扫气源装置阀门后，再打开观察罐前系统处理阀、观察罐后系统处理阀、置换放空阀及第一探测器阀，确保相应阀的开关状态正确，然后再打开n2阀，缓慢调节减压器至0.1mpa，小气流吹扫系统2min，然后关闭n2阀，待系统压力排空，关闭置换放空阀及第一探测器阀；

3)启动真空泵，打开真空泵阀，抽空系统3min；

4)关闭真空泵阀，马上打开破空阀，然后打开n2阀，缓慢调节减压器至0.1mpa，打开低浓度ph3探测装置的第二探测器阀；

若低浓度ph3探测装置的显示浓度高于1ppm，则重复步骤2)和步骤3)，直至ph3含量低于1ppm；

若低浓度ph3探测装置的显示浓度等于或低于1ppm，则安全卸下观察罐、第一观察罐阀和第二观察罐阀，试验完成。

本发明的有益效果如下：

本发明提供一种储粮害虫磷化氢抗性的测定设备以及利用该设备快速、方便、准确地测定储粮害虫抗性程度的方法，可解决害虫高抗性难测定、磷化氢气体浓度不精确等问题。该设备可以同时测试不同浓度下的实验结果，也可测量同一浓度下多组实验数据，磷化氢气体浓度准确，制备快速，该设备同时解决了传统方法的诸多问题，为的后端进一步研究储粮害虫的抗性问题提供了扎实基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出本发明一种储粮害虫磷化氢抗性的测定设备的示意图。

图2示出本发明实施例1中锈赤扁谷盗各品系拟合的回归直线。

图3示出本发明实施例1中不同品系的锈赤扁谷盗的lg(lc50)与lg(kt50)的相互关系。

附图标记说明：11、n2吹扫气源装置；12、ph3/空气测试气源装置；13、n2阀；14、原料气阀；2、减压器；31、观察罐；32、第一系统阀；33、第一观察罐阀；34、第二观察罐阀；35、第二系统阀；41、高浓度ph3探测装置；42、低浓度ph3探测装置；43、o2探测装置；44、第一探测器阀；45、第三滤毒罐；46、第二探测器阀；51、真空泵阀；52、破空阀；53、真空泵；54、第一滤毒罐；55、第二滤毒罐；56、置换放空阀；6、观察罐前系统处理阀；7、观察罐后系统处理阀。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

一种储粮害虫磷化氢抗性的测定设备，所述测定设备包括：

两端分别设有进气口和排气口的主管路；所述进气口和排气口之间的主管路上依次设置有若干组并列的观察罐31、高浓度ph3探测装置41、第三滤毒罐45和o2探测装置43；

与观察罐31并联的并联管路；所述并联管路的进口位于观察罐31前端的主管路上，所述并联管路的出口位于观察罐31与高浓度ph3探测装置41之间的主管路上；以及

净化管路；所述净化管路的进口与并联管路连通，所述净化管路的出口位于o2探测装置43后端的主管路上；所述净化管路上依次设有真空泵阀51和真空泵53；所述真空泵阀51和真空泵53之间的净化管路上连接有排空管路，所述排空管路上设有破空阀52；

所述设备还包括低浓度ph3探测装置42和第二滤毒罐55；所述低浓度ph3探测装置42通过第一支管路与真空泵阀51和真空泵53并联，所述第二滤毒罐55通过第二支管路与真空泵阀51和真空泵53并联；

所述并联管路的进口和所述净化管路的进口之间的并联管路上设有观察罐前系统处理阀6；所述净化管路的进口和所述并联管路的出口之间的并联管路上设有观察罐后系统处理阀7。

优选地，所述进气口和排气口之间的主管路上包括有至少三组并列的观察罐31。

优选地，所述设备还包括气源管路，所述气源管路的出口与主管路的进气口连通；

所述气源管路上设有供气装置，所述供气装置包括并联的n2吹扫气源装置11和ph3/空气测试气源装置12。

优选地，所述n2吹扫气源装置11后端的气源管路上设有n2阀13；所述ph3/空气测试气源装置12后端的气源管路上设有原料气阀14。

优选地，所述气源管路的出口与所述并联管路的进口之间的主管路上设有减压器2。

优选地，第一支管路的出口和第二支管路的出口之间的净化管路上包括有第一滤毒罐54。

优选地，所述低浓度ph3探测装置42前端的第一支管路上包括有第二探测器阀46；所述第二滤毒罐55前端的第二支管路上包括有置换放空阀56；所述并联管路的出口与高浓度ph3探测装置41之间的主管路上包括有第一探测器阀44；所述并联管路的进口与观察罐31之间的主管路上依次设有第一系统阀32和第一观察罐阀33；所述观察罐31与所述并联管路的出口之间的主管路上依次设有第二观察罐阀34和第二系统阀35。

优选地，所述主管路、并联管路和净化管路的材料均为ep级管材。

为达到上述第二个目的，本发明采用下述技术方案：

一种如上所述的储粮害虫磷化氢抗性的测定设备的使用方法，包括以下步骤：

1)打开第一系统阀32、第一观察罐阀33、第二观察罐阀34、第二系统阀35和第一探测器阀44，其余阀均关闭，打开原料气阀14，缓慢开启减压器2，调节流量至略高于大气压力，待高浓度ph3探测装置41显示浓度达到要求浓度，且o2探测装置43显示的氧气含量符合要求时，关闭减压器2，再关闭原料气阀14，待观察罐31内的压力接近大气压力时，即排气口无气体流出时，关闭第一观察罐阀33、第二观察罐阀34，取样完成；

打开观察罐前系统处理阀6及置换放空阀56，然后打开减压器2放空减压器2前端管道内的残留气体至平压，关闭减压器2、观察罐前系统处理阀6、置换放空阀56；

2)打开n2吹扫气源装置11的阀门后，再打开观察罐前系统处理阀6、观察罐后系统处理阀7、置换放空阀56及第一探测器阀44，确保相应阀的开关状态正确，然后再打开n2阀13，缓慢调节减压器2至0.1mpa，小气流吹扫系统2min，然后关闭n2阀13，待系统压力排空，关闭置换放空阀56及第一探测器阀44；

3)启动真空泵53，打开真空泵阀51，抽空系统3min；

4)关闭真空泵阀51，马上打开破空阀52，然后打开n2阀13，缓慢调节减压器2至0.1mpa，打开低浓度ph3探测装置42的第二探测器阀46；

若低浓度ph3探测装置42的显示浓度高于1ppm，则重复步骤2)和步骤3)，直至ph3含量低于1ppm；

若低浓度ph3探测装置42的显示浓度等于或低于1ppm，则安全卸下观察罐31、第一观察罐阀33和第二观察罐阀34，试验完成。

在本发明优选的实施方式中，设备的管路连接方式采用的是卡套连接。卡套连接是高压管道连接方式之一，其他接连方式还有npt、焊接、vcr等，均是气体行业最常用的管道连接方式。卡套连接不仅可以可靠的连接系统，保证系统的气密性，而且装配、维修方便。

设备气密性测试：由于供气装置与减压器2前端之间的管道承受的高压，故此段管路采用高压保压试漏，保压压力10mpa，保压时长30min，无掉压，则系统气密性良好。将连接在设备上的观察罐31中的空气置换为相应浓度磷化氢+空气混合气，是试验的关键，故减压器2后端压力只需略大于大气压力，即可完成置换。所以减压器2后端可采用低压保压测试，保压压力0.5mpa，保压时长30min，无掉压，则系统气密性良好。

另外，设备使用期间采用肥皂泡检查熏蒸罐接口阀门的气密性，如无泡表示接口气密良好。同时，为保证实验人员安全，优选地，需要给操作人员配备的磷化氢报警仪，在使用期间全程佩戴。

设备灵敏性测试：为了保证试验的真实、可靠，在开始杀虫试验之前，可以进行o2探测装置43、低浓度ph3探测装置42、高浓度ph3探测装置41的测试。测试方法如下：安排专业的气体从业人员，为每台探测装置配制3瓶3个浓度的气体标物(本单位为国家二级标准物质研制单位，具备生产二级标准物质的能力)，为o2探测装置43配制20％、21％及22％的氧/氮各一瓶；为低浓度ph3探测装置42配制0.3ppm、0.5ppm、0.7ppm磷化氢/空气各一瓶；为高浓度ph3探测装置41配制30ppm、50ppm、70ppm磷化氢/空气各一瓶，测试中各台探测器的显示数据与相应的气体配制浓度的偏差均在2％以内，则判断该测试设备的灵敏度完全达到要求。

接下来列举一个具体实施例来说明该测定设备的应用。

实施例1

1.试虫和培养方法

每个品系的储粮害虫(锈赤扁谷盗)已经过国家粮食局科学研究院粮油储藏技术研究组储粮害虫饲养实验室纯化培养数十代。将锈赤扁谷盗培养在实验室32℃、78％rh、24h无光照条件的恒温恒湿培养箱中。取数百头成虫，投入装有饲料的500ml玻璃瓶中，产卵3d后筛出成虫，放入另一个准备好的玻璃瓶中饲养，然后将带卵的小麦放回原瓶内置于培养箱中饲养，每3d一批，待其子代发育到成虫后，挑选2周龄的成虫作为试验用虫。于文江等报道在温度32℃、相对湿度75％～90％条件下，卵到成虫的羽化需要20.3d～27.5d。

每种试虫按国家粮食局科学研究院粮油储藏技术研究组的标准化方法进行培养。粉食性害虫以全麦粉∶燕麦片∶酵母∶碎麦＝5∶3∶3∶1为饲料，在温度(30±2)℃，相对湿度(75±5)％的条件下培养。(品系：内蒙古通辽、广西南宁、山东费县、广东广州)

2.实验材料和设备

磷化氢(ph3)气体是由杭州贝斯特气体公司生产的钢瓶气体，钢瓶储存的磷化氢气体可根据具体实验需要通过磷烷-气体配置装置配置相应的浓度梯度，磷化氢测试装置即为本发明提供的一种储粮害虫磷化氢抗性的测定设备，由杭州贝斯特气体公司生产。熏蒸瓶(50ml)，培养箱(宁波艾德生仪器有限公司)，磷化氢气体报警仪(德尔格安全设备(中国)有限公司)，恒温干燥箱(杭州蓝天化验仪器厂)，小毛笔，培养皿，害虫分选筛，漏斗。

3.实验方法

3.1锈赤扁谷盗各品系抗性水平确定

在一定ph3浓度下，产生保护性昏迷的时间长短与其磷化氢的抗性成都有密切关系，储粮害虫致死时间与保护性昏迷的时间成正相关，可通过害虫击倒时间快速判定害虫是否产生抗性。本实验采用半数击倒时间的方法确定储粮害虫的抗性品系与敏感品系，并记录其半数击倒时间(kt50)。

首先从准备好的试虫中挑出同一品系同一代的储粮害虫成虫10头放入观察罐31内，同时做3个重复。然后将观察罐31接入本发明提供的储粮害虫磷化氢抗性的测定设备中，将测定设备接通预先配好的ph3气体浓度为2.0mg/l的钢瓶，观察试虫反应，当观察罐31中的锈赤扁谷盗不能正常爬行或者缓慢爬行，只有触角能偶尔动弹则视为被ph3击倒(konckdown)，将试虫接触ph3气体开始到试虫被击倒的时间称为击倒时间(konckdowntime,简记为kdt)。观察每头成虫被击倒的时间。记录kt50，如果30min有5头试虫被击倒说明该品系是敏感品系，如果击倒头数小于5头说明是抗性品系。

3.2锈赤扁谷盗抗性倍数测定

锈赤扁谷盗抗性鉴别浓度0.064mg/l，浓度设定：0.120、0.060、0.050、0.040、0.030、0.020mg/l、(0.000±0.002))。每组2个对照(以未经磷化氢处理的试虫作为空白对照)，重复2次，从中挑选健康程度及个体大小一致的虫体，每组均放50头。充入气体后，室温下(25℃、rh70％)(气体温度与环境温度一致)密闭熏蒸。根据预实验观察的结果显示，20h仅通辽品系的锈赤扁谷盗有死亡，其他3个品系的害虫均没有死亡，因此本实验延长熏蒸时间到48小时。处理48小时，散气后,取出试虫,加入适量饲料，分别放在25℃，rh70％下培养14d,14d后用毛笔触动害虫检查其死活情况并记录。计算死亡率、校正死亡率和lc50。如果对照组有死亡的记录，则用abbots公式与其它的试验组进行校正。

3.3数据处理

试验成虫击倒快速测定的试验结果用microsoftexcel进行处理，毒力测定的试验结果也采microsoftexcel进行处理分析，得到不同品系的毒力回归方程和抗性系数(rf)。其中，抗性倍数(rf)＝害虫实际lc50/敏感品系lc50。

3.4结果分析

3.4.1锈赤扁谷盗的磷化氢半数击倒时间

磷化氢抗性击倒快速测定的试验结果得到的半数击倒时间如表1所示。

表1各个品系的锈赤扁谷盗成虫的半数击倒时间kt50

当测定品系kt50值>30min时,为抗性品系害虫；

当测定品系kt50值<30min时,为敏感品系害虫。

实验结果表明4个品系的锈赤扁谷盗均已成为抗性品系，其中内蒙古通辽的品系所需击倒时间比较短基本接近敏感品系，其他3个品系的锈赤扁谷盗已经具有很高的抗性。实验结果显示粮食流通不频繁储粮环境较稳定的通辽地区的抗性不太大，而其他3个地区的锈赤扁谷盗则相对的抗性的产生要更严重些。

3.4.2锈赤扁谷盗抗性倍数测定

4个品系的绣赤扁谷盗的磷化氢抗性倍数实验数据经过microsoftexcel进行处理，结果如表2。

表2不同品系锈赤扁谷盗的磷化氢抗性倍数测定

注：磷化氢的浓度由1mg/l换算ml/m3的系数按720计；锈赤扁谷盗各品系的抗性系数rf＝待测品系lc50值/fao推荐敏感品系的lc50值。(锈赤扁谷盗对磷化氢的敏感数值以通辽品系的进行参考)

根据预实验观察的结果显示，20h仅通辽品系的锈赤扁谷盗有死亡，其他3个品系的害虫均没有死亡，因此本实验在fao法的基础上延长熏蒸时间到48小时。根据fao推荐的敏感品系lc50值范围为0.007～0.013mg/l,本实验4种品系的昆虫lc50均不在此范围内，判断4种品系均为抗性品系。

从表2的数据结果可以看出内蒙古通辽品系属于抵抗性，接近敏感品系，其他3个品系的锈赤扁谷盗均已成为高抗性品系。实验结果与击倒时间所测定的比较接近。半数击倒浓度lc50的标准误差se内蒙古通辽＜广西南宁＜山东费县＜广东广州，总体看来均相对比较小说明所得的抗性倍数比较可靠，可靠性依次减小。利用excel求出的内蒙古通辽、广西南宁、山东费县、广东广州4个品系的lc95分别为0.11302mg/l、31.7391mg/l、35.5471mg/l、49.315mg/l，但所求结果lc95的标准误差se和95％置信区间均比较大，仅内蒙古通辽品系的可靠性比较高，因此本实验仅采用半数击倒浓度lc50判断害虫的抗性程度，lc95仅作为参考，猜测后期害虫可能受磷化氢影响发生了变异。

b值是分散程度的代表数值，因为b＝1/s(s为标准差)，所以b值又是回归方程直线的坡度，坡度越大(b值越大，s值越小)，即分散程度越小，也即这一群体对杀虫剂的反应较为均匀，反之这一群体有更大的异质性，其抗药性之间的差异较大。如图2所示，拟合的回归方程直线坡度较小，说明这几个品系的锈赤扁谷盗群体有更大的异质性，其抗药性之间的差异较大，分析可能是挑选试虫时未分雌雄，也有可能是个体大小差异影响。

3.4.3锈赤扁谷盗的lg(kt50)与lg(lc50)的相关性

将四个品系的锈赤扁谷盗的kt50和lc50的值进行对数转换与回归分析，数据处理用microsoftexcel进行分析，得出的结果如表3和图3所示。

表3各品系锈赤扁谷盗实验结果

从图3可以看出，不同品系的锈赤扁谷盗的lg(lc50)与lg(kt50)之间具有一定的相关性，其回归方程的决定系数即r2为0.9648，拟合度相对较好，其回归方程为y＝2.6765x-5.7922。曹阳等研究的结果也表明lg(lc50)与lg(kt50)之间存在线性关系。

4个品系击倒时间的顺序为广西南宁＞山东费县＞广东广州＞内蒙古通辽，抗性倍数的顺序为广东广州＞山东费县＞广西南宁＞内蒙古通辽。山东费县、广东广州、广西南宁三个品系的锈赤扁谷盗抗性击倒时间比较相近观察时可能存在误差，半数击倒浓度lc50的标准误差se的显示结果也说明了这一现象，但综合来看3个品系的抗性水平是比较接近的。由此可见，磷化氢抗性倍数较高的锈赤扁谷盗，其半数击倒时间也相对较长，半数击倒时间的长短与抗性水平的高低是呈现正相关性的。因此，对于磷化氢抗性倍数较高的储粮害虫，磷化氢快速测定方法可以用于测定害虫对磷化氢的抗性高低，可以总体判断害虫处于什么抗性水平。

实验结果显示，4个品系内蒙古通辽、山东费县、广东广州、广西南宁的半数击倒时间分别为45min、174min、170min、187min，以内蒙古通辽品系为参考求得的抗性倍数分别为1、36.40、35.37、43.73。通辽的品系属于抵抗性品系，其余3个品系属于高抗性品系。半数击倒时间的长短与抗性水平的高低是呈现正相关性的。实验过程中通入气体后试虫呈兴奋状态分散状爬行且速度比较快，待试虫处于半晕倒状态时开始向中间聚拢直至晕倒。实验过程中用磷化氢报警仪进行全程测试，报警仪读数始终为零，即使在磷化氢测试装置的排气管口也未发现报警仪有读数显示，说明测定装置中滤毒罐发挥了作用，同时整个测定装置和观察罐31的气密性比较可靠。

本实验过程中需要注意的几点有：气体浓度的准确配制、系统所处环境温湿度的控制、观察罐31的气密性检测、试虫虫龄的控制和试虫挑选的一致性和准确性、击倒实验试虫观察的连续性等。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。