本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种预测胃肠间质瘤耐药性的试剂盒及其应用。
背景技术：
胃肠道间质瘤(gastrointestinalstromaltumors，gist)是一类起源于胃肠道间叶组织的肿瘤，占消化道间叶肿瘤的大部分，由于肿瘤对常规放疗不敏感，手术切除曾是治疗gist唯一有效的方法，对于肿瘤进展转移或术后复发而失去手术机会的患者，其中位生存期仅6-18个月，5年生存率小于10％。10余年来，随着现代分子生物学技术在gist临床诊断治疗中的广泛应用，尤其以伊马替尼为代表的分子靶向药物的出现和普及，使gist患者的预后得到显著改善。靶向治疗成为肿瘤治疗的热门，目前，伊马替尼用于治疗晚期gist及gist术后辅助治疗的显著疗效以得到广泛共识，但同时伊马替尼的原发性和继发性问题也日益受到研究者关注，成为近期gist研究的热点。目前，伊马替尼和舒尼替尼是用于治疗gist的主要靶向药物，伊马替尼，酪氨酸激酶抑制剂，是一种小分子蛋白激酶抑制剂，它具有阻断一种或多种蛋白激酶的作用。临床用于治疗慢性髓性白血病和恶性胃肠道间质肿瘤。舒尼替尼可用于治疗失败或不能耐受的胃肠间质瘤(gist)、不能手术的晚期肾细胞癌(rcc)、不可切除的，转移性高分化进展期胰腺神经内分泌瘤(pnet)成年患者。伊马替尼和舒尼替尼都能作为假底物与atp竞争性结合kit/pdgfra受体的酪氨酸激酶位点，发挥阻滞激酶激活和信号传导的作用，此外，舒尼替尼还具有抗肿瘤血管形成的作用，虽然靶向药物的治疗明显改善了gist的预后，约80％的患者在最初接受伊马替尼治疗后获益，但靶向药物耐药是不可避免的，耐药问题成为靶向治疗中的棘手问题。研究发现，有40％-50％的患者在接受伊马替尼治疗后2年内出现耐药，发生伊马替尼耐药的患者如接受舒尼替尼治疗，其无进展生存期。耐药可分为原发性耐药和继发性耐药，前者是指用药后疾病仍然进展或疾病稳定小于6个月者，后者是指经治疗病情稳定6个月之后再次发生的疾病进展。耐药性可能与以下因素有关：
(1)基因突变因素；
(2)kit/pdgfra基因的过表达等。
因此，对于肿瘤耐药性的预测，可有助于靶向药物的选择。对于患者的恢复有很大的帮助。
中国专利申请：cn105074009b公开了及一种egfr抑制剂的敏感性的预测方法，其包括：(a)确定工序，该工序用以确定从受试者中采集的血液样品中是否存在kras基因来源的核酸或其蛋白质，以及确定该血液样品中的上述kras基因来源的核酸或其蛋白质是野生型还是变异型；以及，(b)判断工序，在上述工序(a)中，若在上述血液样品中检测到野生型kras基因来源的核酸或其蛋白质而没有检测到变异型kras基因来源的核酸或其蛋白质，则判断上述受试者的肿瘤对egfr抑制剂敏感的可能性高，若在上述血液样品中检测到变异型kras基因来源的核酸或其蛋白质，则判断上述受试者的肿瘤对egfr抑制剂不敏感的可能性高。但是关于本发明一种预测胃肠间质瘤耐药性的试剂盒及其应用目前还未见报道。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是针对限现有技术的不足，提供一种预测胃肠间质瘤耐药性的试剂盒。
本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供一种预测胃肠间质瘤耐药性的试剂盒的应用。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种预测胃肠间质瘤耐药性的试剂盒，所述试剂盒包括操作说明书，所述操作说明书记载有：
所述得分计算方法为：染色强度*染色面积；
所述试剂盒内还包括正常组织标本、rad51蛋白免疫组化检测试剂和ku70蛋白免疫组化检测试剂，所述rad51蛋白免疫组化检测试剂包括兔抗人rad51多克隆抗体、rad51蛋白提取试剂、染料、fitc或dylight549标记的山羊抗兔荧光二抗；所述ku70蛋白免疫组化检测试剂包括鼠抗人ku70单克隆抗体、ku70蛋白提取试剂、染料、fitc或dylight549标记的山羊抗鼠荧光二抗。
作为本发明的一个优选实施方案，所述试剂盒的操作说明书中还记载有：
作为本发明的一个优选实施方案，所述试剂盒的使用步骤如下：
(1)提取胃肠间质瘤患者术后肿瘤组织切片白片，备用；
(2)使用rad51与ku70蛋白免疫组化检测试剂分别对步骤(1)中制备得到的切片白片进行rad51蛋白与ku70蛋白免疫组化染色，并对病理切片读片，按照免疫组化计算方法计算结果；
(3)使用rad51与ku70蛋白免疫组化检测试剂分别对正常组织切片白片进行rad51蛋白与ku70蛋白免疫组化染色，并对病理切片读片，按照免疫组化计算方法计算结果；
(4)分别计算肿瘤组织与正常组织rad51蛋白与ku70蛋白得分比值；
(5)将上述计算计算结果按照操作说明书记载内容确定待检测组织的耐药性。
作为本发明的一个优选实施方案，所述免疫组化方法包括如下步骤：
(1)脱蜡和水化；
(2)使用pbs洗涤；
(3)抗原修复；
(4)3％h2o2洗涤与pbs洗涤；
(5)加入一抗孵育过夜；
(6)pbs洗涤；
(7)加入二抗；
(8)pbs洗涤；
(9)滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素孵育；
(10)pbs洗涤；
(11)显色剂显色；
(12)冲洗，封片。
作为本发明的一个优选实施方案，所述药是指胃肠间质瘤的靶向药物，包括伊马替尼和舒尼替尼。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述试剂盒在预测胃肠间质瘤耐药性中的应用。
作为本发明的一个优选实施方案，所述药是指胃肠间质瘤的靶向药物，包括伊马替尼和舒尼替尼。
所述舒尼替尼的化学名称是：(z)-n-[2-(二乙胺基)乙基-5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3h-吲哚-3-亚基)甲基]-2，4-二甲基-3-氨甲酰-1h-吡咯苹果酸盐，分子式是：c22h27fn4o2·c4h6o5，其适应症如下：
(1)甲磺酸伊马替尼治疗失败或不能耐受的胃肠间质瘤(gist)；
(2)不能手术的晚期肾细胞癌(rcc)；
(3)不可切除的，转移性高分化进展期胰腺神经内分泌瘤(pnet)成年患者。
其治疗胃肠间质瘤和晚期肾细胞癌的推荐剂量是50mg，每日一次，口服；服药4周，停药2周。
对于胰腺神经内分泌瘤，其推荐剂量为37.5mg，口服，每日一次，连续服药，无停药期。
其对于胃肠间质瘤和转移性肾细胞癌，根据患者个体的安全性和耐受性，以12.5mg为梯度单位逐步调整剂量。每日最高剂量不超过75mg，最低剂量为25mg。
对于胰腺神经内分泌瘤，根据患者个体的安全性和耐受性，以12.5mg为梯度单位逐步调整剂量。在3期临床试验中使用的最大剂量为每日50mg。
作为本发明的一个优选实施方案，所述伊马替尼的结构式如下：
作为本发明的一个优选实施方案，所述伊马替尼的化学名称是：4-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-n-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺；其分子式是：c29h31n7o。
本发明优点在于：
1、本发明的试剂盒可用于预测胃肠道间质瘤耐药性，从而针对性地选择靶向药物，为胃肠道间质瘤患者大大节省了治疗时间，对胃肠道间质瘤患者的治疗提供了很大的帮助。
2、本发明的试剂盒预测效率高，可很好的应用于肿瘤治疗中，具有很好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1预测胃肠道间质瘤耐药性试剂盒
预测胃肠道间质瘤耐药性的试剂盒中包括操作说明书，
所述操作说明书记载有：
所述操作说明书还记载有：
所述得分计算方法为：染色强度*染色面积；
所述试剂盒内还包括正常组织标本、rad51蛋白免疫组化检测试剂和ku70蛋白免疫组化检测试剂，所述rad51蛋白免疫组化检测试剂包括兔抗人rad51多克隆抗体、rad51蛋白提取试剂、染料、fitc或dylight549标记的山羊抗兔荧光二抗；所述ku70蛋白免疫组化检测试剂包括鼠抗人ku70单克隆抗体、ku70蛋白提取试剂、染料、fitc或dylight549标记的山羊抗鼠荧光二抗。
实施例2预测胃肠道间质瘤耐药性试剂盒的使用方法
预测患者肿瘤耐药性的试剂盒的使用方法如下：
(一)对患者rad51蛋白表达的水平的检测与计算：
(1)按照石蜡切片脱蜡至水的方法提取胃肠间质瘤患者术后肿瘤组织切片白片，备用；
(2)取步骤(1)制备得到的切片白片，蒸馏水冲洗，并用pbs浸泡5分钟；
(3)使用酶消化的方法进行抗原修复；
(4)使用配制好的3％h2o2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，pbs冲洗，2分钟×3次；
(5)5-10％正常兔血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的兔抗人一抗，37℃孵育1-2小时或4℃过夜；
(6)pbs冲洗，2分钟×3次；
(7)滴加适当比例稀释的山羊抗兔二抗(1％bsa-pbs稀释)，37℃孵育10-30分钟；37℃或室温孵育10-20分钟；
(8)pbs冲洗，2分钟×3次；
(9)滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(pbs稀释)，37℃孵育10～30分钟，37℃或室温孵育10-20分钟；
(10)pbs冲洗，2分钟×3次；
(11)显色剂显色；
(12)自来水充分冲洗，复染，脱水透明、封片；
(13)对病理切片读片按照免疫组化计算方法计算结果，计算方法为:染色强度*染色面积；
(二)对患者ku70蛋白表达的水平的检测与计算：
(1)按照石蜡切片脱蜡至水的方法来提取胃肠间质瘤患者术后肿瘤组织切片白片，备用；
(2)取上述制备得到的切片白片，蒸馏水冲洗，并用pbs浸泡5分钟；
(3)使用酶消化的方法进行抗原修复；
(4)使用配制好的3％h2o2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，pbs冲洗，2分钟×3次；
(5)5-10％正常兔血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的鼠抗人一抗，37℃孵育1-2小时或4℃过夜；
(6)pbs冲洗，2分钟×3次；
(7)滴加适当比例稀释的山羊抗鼠二抗(1％bsa-pbs稀释)，37℃孵育10-30分钟；37℃或室温孵育10-20分钟；
(8)pbs冲洗，2分钟×3次；
(9)滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(pbs稀释)，37℃孵育10～30分钟，37℃或室温孵育10-20分钟；
(10)pbs冲洗，2分钟×3次；
(11)显色剂显色；
(12)自来水充分冲洗，复染，脱水透明、封片；
(13)对病理切片读片，按照免疫组化计算方法计算结果，计算方法为：染色强度*染色面积；
(三)、对正常组织rad51蛋白及ku70蛋白表达的水平的检测与计算：
(1)取试剂盒中的正常组织切片白片，蒸馏水冲洗，并用pbs浸泡5分钟；
(2)使用酶消化的方法进行抗原修复；
(3)使用配制好的3％h2o2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，pbs冲洗，2分钟×3次；
(4)5-10％正常兔血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的鼠抗人一抗，37℃孵育1-2小时或4℃过夜；
(5)pbs冲洗，2分钟×3次；
(6)滴加适当比例稀释的山羊抗鼠二抗(1％bsa-pbs稀释)，37℃孵育10-30分钟；37℃或室温孵育10-20分钟；
(7)pbs冲洗，2分钟×3次；
(8)滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(pbs稀释)，37℃孵育10～30分钟，37℃或室温孵育10-20分钟；
(9)pbs冲洗，2分钟×3次；
(10)显色剂显色；
(11)自来水充分冲洗，复染，脱水透明、封片；
(12)对病理切片读片，按照免疫组化计算方法计算结果，计算方法为：染色强度*染色面积；
(四)将上述计算计算结果按照操作说明书记载内容确定待检测组织的耐药性。
实施例3临床验证
本实施例中的实验均是在本人知情同意的前提下进行的，且签署知情同意书。
1资料
1.1一般资料
收集2015年11月-2018年5月复旦大学附属金山医院确诊为胃肠道间质瘤患者180例。
1.2诊断标准
肿瘤形态：肿瘤大小不一，自0.2cm～44cm不等，起源于胃肠道壁固有肌层，可向腔内、腔外或同时向腔内、腔外生长。向腔内生长可形成溃疡，因此根据肿瘤主体位置可分为腔内型、壁内型、哑铃型、腔外型和腹内胃肠道外型。大多数肿瘤呈膨胀生长，边界清楚，质硬易碎；切面鱼肉状，灰红色，中心可有出血、坏死、囊性变等继发性改变。肿瘤数目可为多个。
组织学特点：gists主要是由梭形细胞和上皮样细胞构成，两种细胞可同时出现于不同的肿瘤中，但形态学变化范围大。依据两种细胞的多少可分为梭形细胞型、上皮样细胞型以及梭形和上皮细胞混合型。肿瘤细胞的排列也呈多样化，以束状和片状排列居多。胃与小肠的形态学变化大，直肠的形态学变化小，大部分为梭形细胞型，交叉束状排列多。肿瘤细胞分化不等。
1.3纳入标准
(1)符合上述胃肠道间质瘤诊断标准；
(2)年龄在18-60岁之间，男女不限；
(3)受试者签署知情同意书。
1.4剔除标准：
不符合纳入标准而误纳入的病例；虽符合纳入标准而纳入后未曾用本研究方案治疗的病例；非疗效原因及不良反应而试验中途停止的脱落病例；加用其他药物者；资料不全不能统计者。
1.5终止和撤除临床试验标准：在试验中出现其他疾病，影响试验进行者；不可预见的其他情况。
2方法
2.1实验方法
2.1.1患者切片组织处理方法
按照石蜡切片脱蜡至水的方法来提取胃肠间质瘤患者术后肿瘤组织切片白片，备用；
按照上述实施例2中试剂盒的使用方法对180例患者的切片组织的rad51蛋白与ku70蛋白进行免疫组化染色并计算得分结果。
按照免疫组化计算方法计算肿瘤组织与正常组织rad51、ku70蛋白表达水平得分，并计算二者的比值，然后将计算结果按照试剂盒操作说明书记载的内容记录其耐药性结果。
2.1.2患者术后处理方法
将180例患者肿瘤组织切片取下后，给予患者伊马替尼药物进行治疗并观察，治疗时间为6个月，治疗期间，密切观察患者是否会出现肿瘤耐药性，治疗时间结束后记录结果。用法用量：应在进餐时服用.并饮一大杯水。通常成人每日一次.每次400mg或600mg，以及日服用量800mg即400mg剂量，每天2次(在早上及晚上)。不能吞咽药片的患者(包括儿童)，可以将药片分散于不含气体的水或苹果汁中(100mg片约用50ml，400mg约用200ml)。应搅拌混悬液，一旦药片崩解完全应立即服用。
2.2评分标准
按照免疫组化评分标准进行
免疫组织化学染色结果分配一个平均评分，既考虑一个明确阳性反应染色强度和肿瘤细胞的比例。
阳性反应被定义为那些细胞浆显示棕色信号的。对于δ-catenin，一个染色指数(0-12)被定义为染色强度和染色区域的乘积。
染色强度的分数被定为：阴性0分；弱1分；中等2分；强阳性3分。阳性细胞的频率被定义为：少于5％，0分；5％-25％，1分；26％-50％，2分；51％-75％，3分；大于75％，4分。
当染色异构的时候，我们这样评分：每个评分都是独立的，结果是综合的。
数据分析的时候，0-7被认为是低表达而8到12被认为是高表达。
3结果
计算结果为：42例患者：(肿瘤组织rad51得分/正常组织rad51得分)>1，(肿瘤组织ku70得分/正常组织ku70得分)<1，按照试剂盒的操作说明书，判定这些患者不会出现耐药性；该42例患者术后药物治疗结果为：41例患者在治疗期间未出现耐药性，1例患者出现耐药性，试剂盒操作说明书验证正确率为97.62％。
46例患者：(肿瘤组织rad51得分/正常组织rad51得分)<1，(肿瘤组织ku70得分/正常组织ku70得分)>1，按照试剂盒的操作说明书，判定这些患者短期内会出现耐药性；该46例患者术后药物治疗结果为：45例患者在治疗期间短期内出现耐药性，1例患者未出现耐药性，试剂盒操作说明书验证正确率为97.82％。
45例患者：(肿瘤组织rad51得分/正常组织rad51得分)>1，(肿瘤组织ku70得分/正常组织ku70得分)>1，按照试剂盒的操作说明书，判定这些患者需要密切随访；该45例患者术后药物治疗结果为：43例患者在治疗期间肿瘤组织的耐药性为不确定结果，需要密切随访，2例患者治疗期间短期内出现耐药性，试剂盒操作说明书验证正确率为95.56％。
47例患者：(肿瘤组织rad51得分/正常组织rad51得分)<1，(肿瘤组织ku70得分/正常组织ku70得分)<1，按照试剂盒的操作说明书，判定这些患者需要密切随访；该47例患者术后药物治疗结果为：45例患者在治疗期间肿瘤组织的耐药性为不确定结果，需要密切随访，2例患者治疗期间短期内出现耐药性，试剂盒操作说明书验证正确率为95.74％。
需要说明的是，正确率是指将患者给予药物治疗期间其耐药性的结果与试剂盒操作说明书记录耐药性结果进行计算。
“耐药性”是指用药后疾病仍然进展或疾病稳定小于6个月；
“不耐药性”是指经治疗6个月内病情稳定，未出现疾病进展。
综上所述，本发明的试剂盒的操作说明书的正确率在95.74％以上。
将本发明的试剂盒应用于预测胃肠道间质瘤患者肿瘤耐药性，从而有助于患者下一步治疗，为患者大大节省了治疗时间，帮助患者尽早恢复健康。
本发明的试剂盒可用于预测胃肠道间质瘤耐药性，从而针对性选择靶向药物，对胃肠道间质瘤患者的治疗提供了很大的帮助。本发明的试剂盒预测效率高，可很好的应用于肿瘤治疗中，具有很好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。