一种检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA的建立方法与流程

本发明涉及一种检测牛布鲁氏菌hsp70的间接elisa的建立方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

布鲁氏菌病严重影响畜牧业发展，对人类健康造成极大威胁。通常，人的感染主要通过接触带菌动物或消费被细菌污染的动物产品，因此，控制和清除带菌动物对于控制该病具有关键意义。动物布鲁氏菌病的筛查依赖于实验室诊断，国际兽医局(oie)推荐的诊断方法有：布鲁氏菌的分离鉴定、虎红凝集试验、试管凝集试验、pcr技术和补体结合试验等。细菌分离是布鲁氏菌病诊断的“金标准”，但是布鲁氏菌属于危险病原，试验要求高，且分离率非常低，不适于大规模检疫；pcr检测方法敏感性高，特异性差；补体结合试验具有良好的特异性和敏感性，但是同样存在试验要求较高的缺点；虎红凝集试验和试管凝集试验敏感性较高，但容易造成假阳性。

因此，提供一种敏感性和特异性好，易于操作和标准化的检测牛布鲁氏菌hsp70的间接elisa(ielisa)的建立方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种敏感性和特异性好，易于操作和标准化的检测牛布鲁氏菌hsp70的间接elisa的建立方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测牛布鲁氏菌hsp70的间接elisa的建立方法，具体步骤如下：

(1)制备牛布鲁氏菌hsp70融合蛋白，并对蛋白进行纯化，获得纯化的蛋白；

(2)以步骤(1)获得的纯化的蛋白为抗原检测布鲁氏菌血清样本，同时确定抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液种类、二抗稀释浓度以及显色时间；

(3)确定间接elisa的临界值：临界值＝平均值+2.58×标准差；平均值为阴性血清间接elisa结果的平均值，标准差为阴性血清间接elisa结果的标准差；间接elisa结果判定标准：布鲁氏菌血清样本的od值大于等于临界值判断为阳性，布鲁氏菌血清样本的od值小于临界值判断为阴性；

(4)分析间接elisa方法的敏感性和特异性。

进一步，步骤(1)所述制备牛布鲁氏菌hsp70融合蛋白的步骤如下：

1)pcr扩增hsp70基因；

2)构建重组表达载体pet32a-hsp70；

3)将重组表达载体转化dh5α感受态细胞，挑取单克隆进行pcr和双酶切验证，获得阳性克隆，提取质粒，测序；

4)将重组表达载体pet32a-hsp70转化bl21(de3)菌株，获得重组表达菌株pet32a-hsp70/bl21(de3)；

5)利用iptg诱导重组表达菌株，获得融合蛋白；

6)利用sds-page分析融合蛋白表达情况；

7)对融合蛋白进行westernblot验证。

进一步，检测牛布鲁氏菌hsp70的间接elisa方法在鉴别牛布鲁氏菌中的应用。

本发明的有益效果是：本发明提供了检测牛布鲁氏菌hsp70的间接elisa的建立方法，具体通过对hsp70进行原核表达，获得纯化的蛋白，以纯化蛋白作为抗原，建立检测牛布鲁氏菌间接elisa的方法，为布鲁氏菌病的血清学检测提供重要方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明hsp70基因的pcr扩增；

m.dl2000marker；1.hsp70基因扩增；

图2为本发明sds-page分析融合蛋白在大肠杆菌中的表达；

m.蛋白marker；1.pet32a-hsp70/bl21(de3)菌体裂解物；2.pet32a/bl21(de3)空载对照；

图3为本发明westernblot鉴定融合蛋白在大肠杆菌中的表达；

m.蛋白marker；1.pet32a-hsp70/bl21(de3)菌体裂解物；2.pet-32a/bl21(de3)空载对照；

图4为本发明sds-page分析融合蛋白的表达形式；

m.dl2000marker；1.全菌；2.沉淀；3.上清；

图5为本发明sds-page分析纯化前后的融合蛋白；

m.dl2000marker；1.纯化前的融合蛋白；2.纯化后的融合蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1hsp70基因的pcr扩增

从brucella.abortus2308基因组中获取hsp70的基因序列，根据表达用质粒pet32a和基因序列分析，选取bamhi和xhoi为酶切位点，利用primerpremier5.0设计引物。

引物序列如下：

p1：5’-gcggatccatggctaaagttattggtatc-3’；bamhi；seqidno：1；

p2：5’-gcctcgagttagcggatctggtgctcctt-3’；xhoi；seqidno：2。

以brucella.abortus2308基因组dna为模板，利用上述引物进行pcr扩增，pcr反应体系为：

pcr反应程序为94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1.5min，共30个循环；最后72℃延伸5min。

反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收pcr产物，获得1485bp大小的条带，结果如图1所示。

实施例2重组表达载体和表达菌株的构建

将实施例1获得的hsp70基因和质粒pet32a分别进行双酶切，凝胶回收，连接、转化后涂布lb/amp平板，温箱中倒置培养。挑取lb/amp平板上的单克隆，摇菌后利用通用引物进行菌液pcr鉴定，获得阳性克隆pet32a-hsp70；

其中，通用引物序列如下：

s-tagprimer：5’-cgaacgccagcacatggaca-3’；seqidno：3；

t7terminatorprimer：5’-tgctagttattgctcagcgg-3’；seqidno：4。

pcr反应体系为：

pcr反应程序为94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃1.5min，共30个循环；最后72℃延伸5min。

阳性克隆pet32a-hsp70经扩大培养，提取质粒pet32a-hsp70，酶切鉴定后送北京生工测序。

将测序正确的阳性质粒pet32a-hsp70转化大肠杆菌感受态bl21(de3)，并进行pcr鉴定，获得重组表达菌株pet32a-hsp70/bl21(de3)。

实施例3融合蛋白的诱导表达

利用终浓度为1mm的iptg在37℃、200rpm条件下对重组表达菌株pet32a-hsp70/bl21(de3)进行诱导表达，同时设置pet32a/bl21(de3)空载对照组；6h后收集菌体，煮样后进行sds-page分析，经过考马斯亮蓝染色和脱色，重组表达菌株pet32a-hsp70/bl21(de3)经诱导获得约70kd的融合蛋白，大小符合预期；空载没有获得蛋白条带，结果如图2所示。

实施例4westernblot验证

为了进一步验证融合蛋白表达，对融合蛋白进行针对表达标签his的westernblot鉴定。

诱导表达后，收集菌体，煮样后进行sds-page，同时设置空载对照组。转膜1h后抗体孵育：取出nc膜，使用5％脱脂奶，4℃封闭过夜；取出nc膜，使用封闭液稀释的鼠源his标签单克隆抗体(1:4000稀释)37℃孵育1h，pbst洗膜3次，每次5min；使用hrp标记的羊抗鼠多克隆抗体(封闭液1:8000稀释)37℃孵育1h，pbst洗膜3次，每次5min；显影、曝光。结果如图3所示，表明所表达的蛋白为目的蛋白。

实施例5融合蛋白表达形式鉴定和蛋白纯化

诱导表达后收集菌体，加入pbs重悬，超声裂解菌体，并离心分离上清和沉淀，sds-page分析表达形式。经过验证表达产物为包涵体表达，结果如图4所示，因此进行包涵体纯化。

蛋白诱导表达后，超声破碎，4℃，12000g离心10min；弃上清，将沉淀重悬于solublebindingbuffer中，离心并弃上清，重复两次，直至包涵体沉淀呈洁净的乳白色；弃上清，加入inclusionbodybindingbuffer，冰浴1h，使包涵体溶解；4℃，12000g离心20min，取上清，0.22μm微孔滤膜过滤；ni琼脂糖凝胶灌柱，并使用inclusionbodybindingbuffer平衡；将蛋白液体负载上柱，自然流穿；使用15倍柱体积的inclusionbodybindingbuffer冲洗柱子；使用5倍柱体积的inclusionbodyelutionbuffer洗脱，收集洗脱峰。

取适量洗脱液，加入5×蛋白电泳sdsbuffer煮样，sds-page分析，结果如图5所示，得到了纯度较高的融合蛋白。

实施例6牛布鲁氏菌血清抗体检测ielisa方法的建立

取牛布鲁氏菌阳性血清和阴性血清，以纯化的蛋白作为抗原建立ielisa方法，检测布鲁氏菌血清抗体样品。在此过程中，优化抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液的种类、二抗稀释度及显色时间。

在确定最佳反应条件时，通常选择阳性od值为1，且阳性od值和阴性od值差异明显，也就是阳性od值/阴性od值(p/n值)比较大时为最佳反应条件。

(1)确定最佳抗原包被浓度和血清稀释度

首先优化抗原包被浓度和血清稀释度：抗原包被浓度梯度为4ng/μl、2ng/μl、1ng/μl和0.5ng/μl，4℃包被过夜；血清稀释度为1/50、1/100、1/200和1/400，37℃孵育1h。羊抗牛-hrp二抗稀释度1/4000，37℃孵育1h，显色10min后终止反应，检测od值，结果如表1所示。根据od值，计算p/n值，确定最佳抗原包被浓度为2ng/μl，血清稀释度为1/200。

表1最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定

(2)确定封闭液

以抗原浓度2ng/μl包被板子，选择不同种类的封闭液进行封闭。封闭液包括5％脱脂奶、10％脱脂奶、1％bsa、1％明胶和10％马血清。血清稀释度1/200，羊抗牛-hrp二抗稀释度1/4000，37℃孵育1h，显色10min后终止反应，检测od值，结果如表2所示。根据od值，计算p/n值，结果发现5％和10％脱脂奶封闭效果最好，因此本试验选择5％脱脂奶作为最佳封闭液。

表2封闭液的确定

(3)确定二抗稀释度和显色时间

以抗原浓度2ng/μl包被板子，以5％脱脂奶封闭，血清稀释度为1/200，37℃孵育1h。二抗选择不同的稀释度1/1000、1/2000、1/4000和1/6000，37℃孵育1h，显色时间分别是5min、10min、15min和20min，终止反应后测定od值，结果如表3所示。根据od值，计算p/n值，二抗稀释度1/4000，显色10min为最佳反应条件。

表3二抗稀释度及反应时间的确定

实施例7ielisa方法临界值(cutoff)的确定

经虎红凝集试验、微量凝集试验和svanova牛布鲁氏菌抗体ielisa检测试剂盒(购自瑞士svanova公司)确定临床牛血清样品的阴、阳性，并选择64份阴性血清用来确定本发明所建立ielisa方法的临界值。临界值＝平均值+2.58×标准差，即临床样品的od值大于或等于临界值为阳性，od值小于临界值为阴性。

选择64份阴性血清用来确定ielisa方法的临界值。血清ielisa结果如表4所示，计算临界值＝平均值+2.58×标准差，即临界值＝0.098+2.58×0.034＝0.186，平均值为阴性血清间接elisa结果的平均值，标准差为阴性血清间接elisa结果的标准差；即本研究建立ielisa方法，od值大于0.186即可判为阳性，小于0.186则为阴性。

表4ielisa方法临界值的确定

实施例8ielisa方法的敏感性和特异性分析

对试验前期临床采集的牛血清样品进行虎红凝集试验、微量凝集试验和svanova牛布鲁氏菌抗体ielisa检测试剂盒检测，分别选取48份阳性血清和48份阴性血清，按照本发明建立的方法进行ielisa试验。通过结果比较分析，确定本发明方法的敏感性和特异性。

对试验室前期临床采集的牛血清样品进行检测，确定阴阳性血清，并分别选取48份阳性血清和48份阴性血清，按照本发明建立的方法进行ielisa检测。检测结果如表5和表6，计算得出敏感性：(48-6)/48×100％＝87.5％；特异性：(48-4)/48＝91.7％。

表5ielisa方法的敏感性分析

表6ielisa方法的特异性分析

布鲁氏菌病对养殖业和人类公共卫生健康造成巨大威胁，目前的检疫方法主要以虎红凝集试验和试管凝集试验为主，但是两种方法存在特异性不高、假阳性等缺点。本发明建立了牛布鲁氏菌血清抗体检测ielisa方法，其敏感性达到87.5％，特异性达到91.7％，能够用来进行临床牛布鲁氏菌病的诊断。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>河北科技师范学院

<120>一种检测牛布鲁氏菌hsp70的间接elisa的建立方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>29

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

gcggatccatggctaaagttattggtatc29

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>2

gcctcgagttagcggatctggtgctcctt29

<210>3

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cgaacgccagcacatggaca20

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<400>4

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