一种检测糖类抗原15-3的试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测技术，尤其是涉及一种检测糖类抗原15-3的试剂盒。

背景技术：

近半个世纪以来，肿瘤的发病率和死亡率逐年升高，成为医学界热点中的热点。20世纪70年代，美国提出的向“肿瘤进军”反映了社会对肿瘤死亡率居高不下的焦虑，同时，在过去的几十年中，肿瘤标志在技术上和定义上有了突破，这一切都促使了肿瘤标志研究的快速发展。

目前，乳腺癌已成为威胁女性健康和生命的最常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势。乳腺癌患者最主要的死亡原因是复发和转移，因此动态监测病情变化，早期发现复发转移，准确评价疗效，对乳腺癌患者来说就显得极为重要。

ca15-3是一种多形态上皮糖蛋白，分子量400kd。1984年hikens等人从乳脂肪球膜上糖蛋白mam-6制成小鼠单克隆抗体（115-db），1984年kufu等自肝转移乳腺癌细胞膜制成单克隆抗体（df-3），这两种抗体均能识别同一种抗原，这种抗原即为抗原ca15-3。血清ca15-3测定是检测乳腺癌较重要的指标，30％～50％的乳腺癌患者的ca15-3血清水平明显升高，而且ca15-3与组织学分级、肿瘤大小和腋窝淋巴结转移的出现呈正相关，对乳腺癌的动态追踪、疗效判定与判断复发转移很有价值。1997年美国fda批准mucinl（ca15-3）作为ii/iii期乳腺癌复发的检测指标。ca15-3还可与其它肿瘤标志物一起检测，用于相关肿瘤病例的辅助诊断。与ca125一起检测时，ca15-3可作为卵巢癌早期复发的指标；在肝、胃、肺、胰腺和结肠肿瘤患者中也可能升高。另外，在肝炎、肝硬化等非恶性疾病时也可见ca15-3升高的现象。

临床检测ca15-3的方法有放射免疫分析法（ria）、酶联免疫分析法（elisa）、化学发光免疫分析法（clia）和电化学发光免疫分析（ella）等。目前采用化学发光免疫分析法检测ca15-3的试剂盒为郑州安图生物工程股份有限公司的产品，临床使用时存在与罗氏（标杆产品）的相关性差、检测准确度低、特异性弱等问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测糖类抗原15-3的试剂盒，该试剂盒与罗氏相关性更好，检测准确度更好、特异性更强。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的检测糖类抗原15-3的试剂盒，包括包被有两个ca15-3抗体的包被板，两个hrp标记的抗ca15-3抗体的酶结合物，样品稀释液和标准品。

本发明试剂盒所用包被板的制备方法为：在碳酸盐（cb）包被缓冲液中加入ca15-3抗体1和ca15-3抗体2，混合均匀后，包被到发光costar空白板上，2~8℃过夜；然后用封保液封保，2~8℃过夜，干燥，包装，2~8℃保存待用。

本发明试剂盒所用酶结合物的制备方法为：将含有tris的纯化水作为缓冲液，加入牛血清白蛋白混合均匀后加入ca15-3酶标抗体1和ca15-3酶标抗体2，2~8℃保存待用。

本发明试剂盒所用样品稀释液的制备方法为：在含有tris的纯化水中加入牛血清白蛋白混合均匀，2~8℃保存待用。

本发明试剂盒所用标准品选用ph6.2的缓冲液。

本发明试剂盒为化学发光免疫分析法，属于改良的双抗体夹心，采用双包被双酶标一主一副两对抗体，既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且测试中不使用有害试剂，试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。

附图说明

图1是本发明试剂盒与罗氏的临床相关性验证。

图2是现有试剂盒与罗氏的临床相关性验证。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以利于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明所用的检测试剂和检测仪器均为本领域常规使用产品，本发明所用的检测方法为本领域常规使用的方法。

实施例1制备糖类抗原15-3检测试剂盒

1、制备包被板：配制cb包被缓冲液（在纯化水中加入0.2%的碳酸钠和0.4%的碳酸氢钠），加入8μg/ml的发光ca15-3包被抗体1和8μg/ml的发光ca15-3包被抗体2，混合均匀后，将其包被在发光costar空白板上，2~8℃放置过夜；采用固体洗液（磷酸盐缓冲液/常规产品）洗板两次后，加入封保液200μl，2~8℃放置过夜；拍干、干燥、包装；2~8℃保存待用；其中封保液为pbs缓冲液（在纯化水中加入0.8%的氯化钠、0.02%的氯化钾、0.02%的磷酸二氢钾和0.3%的磷酸氢二钠）+2%牛血清白蛋白制得；

2、制备酶结合物：配制tris缓冲液（在纯化水中加入0.6%的tris，并用盐酸调至ph7.4），加入2%牛血清白蛋白，混合均匀后加入1/1000的发光ca15-3酶标抗体1和1/1000的发光ca15-3酶标抗体2，混合均匀，2~8℃保存待用；

3、制备样品稀释液：配制tris缓冲液，加入2%牛血清白蛋白，混合均匀后，2~8℃保存待用；

4、标准品选用ph6.2的缓冲液，添加2%牛血清白蛋白，混合均匀。

5、发光底物为鲁米诺试剂。

实施例2本发明试剂盒的检测方法

使用时，首先将所有待测血清用样品稀释液稀释51倍（注意：ca15-3标准品已经预先稀释，可直接使用，切勿再做稀释）。

分别吸取50μlca15-3标准品或稀释后的血清样本，加入相应的微孔中，轻轻摇动，混合10s后37℃孵育60分钟，固体洗液洗板5次后，分别吸取100μl酶结合物加入相应的微孔中，轻轻混合10s后37℃孵育60分钟，固体洗液洗板5次后，加入100μl发光底物，室温避光5分钟后检测发光值，通过发光值计算出ca15-3的浓度。

ca15-3浓度的计算方法：

本试剂盒采用点到点拟合方式，即以标准品浓度值为横坐标（x轴），以标准品发光强度值为纵坐标（y轴），建立标准曲线，进行计算。注意，所求浓度即是真实浓度，不需要再乘以稀释倍数。

实施例3本发明试剂盒的性能检测

1、灵敏度检测

lob（配方为纯化水1000ml、nah2po40.8g、na2hpo44.0g、bsa20g、10%nan32ml），准备5份接近0值的临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；lod（标准品s2以lob为稀释液稀释），准备5份浓度范围为1-4倍lob的系列临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；fs：采用lod实验中的数据，5个浓度样本每天测3次，总共测4天，每个样本得到12个结果，计算每个样本的均值、sd和cv%，最接近20%的浓度为功能灵敏度；灵敏度检测结果见下表1。

表1

从表1检测结果可以看出：中试第1批试剂盒能够准确检测出ca15-3的最低浓度为0.40u/ml；中试第2批试剂盒能够准确检测出ca15-3的最低浓度为0.30u/ml；可以看出本试剂盒的灵敏度能够满足临床检测需求。

2、特异性检测

2.1血红蛋白、胆红素、甘油三酯干扰

准备高中低值样本各一份，高值浓度为80u/ml，中值浓度为40u/ml，低值浓度为20u/ml。血红蛋白分别用高中低值样本配制500mg/dl的浓度；胆红素分别用高中低值样本配制20mg/dl的浓度，甘油三酯分别用高中低值样本配制3000mg/dl的浓度，分别重复三次一天内完成考核2批；自身抗体（类风湿因子、rf、ana）干扰重复两次考核1批。结果见下表2、表3、表4。

表2血红蛋白干扰

由表2血红蛋白干扰检测结果可以看出，血红蛋白浓度500mg/dl以下，干扰<10%。

表3胆红素干扰

由表3胆红素干扰检测结果可以看出，本发明试剂盒检测胆红素浓度20mg/dl以下，干扰<10%。

表4甘油三酯干扰

由表4甘油三酯干扰检测结果可以看出，本发明试剂盒检测甘油三酯浓度3000mg/dl以下，干扰<10%。

2.2自身抗体的干扰

考核类风湿因子、ana、hama等自身抗体对本发明试剂盒的干扰，结果见下表5、表6、表7。

表5类风湿性因子干扰

表6ana干扰

表7hama干扰

由表5、表6、表7考核结果可以看出，类风湿因子、ana和hama对本发明试剂盒检测无干扰现象。

3、准确度检测

选择高值样本3份，按照1:9的比例分别加入到3份低值样本/基质样本中，制成回收样本，加入高值样本的体积不得超过总体积的10%。每个回收样本重复检测3次求均值，计算回收率。比较回收率偏差与试剂盒允许偏倚（行标正确度的允许偏倚，无行标的项目一般设定为10%）的大小，若回收率偏差小于等于试剂盒允许偏倚，则回收准确性符合要求，否则不符合要求。

回收率r=[c×(v0+vs)-c0×v0]/（cs×vs）×100%

式中：r—回收率；

v0—低值样本/基质样本的体积；

vs—加入的高值样本的体积；

c—回收样本的检测浓度；

c0—低值样本/基质样本的检测浓度；

cs—高值样本的浓度。

表8.回收率样本制备表

表9.回收样本检测表

计算可知，第1批3个回收样本的回收率分别为106.5%，100.6%，107.0%，第2批3个回收样本的回收率分别为102.5%，96.1%，95.4%，其偏差均小于试剂盒允许偏倚10%，回收准确性符合要求。

实施例4本发明试剂盒与罗氏的临床相关性验证

为了判断本发明试剂盒检测浓度与罗氏的相关性，取来自d15医院血清样本597例，血清浓度跨度整个线性范围（3.73-297.5u/ml），分别用本发明试剂盒（试剂盒2）与郑州安图生物工程股份有限公司生产的现有ca15-3检测试剂盒（试剂盒1）进行检测，检测结果表明，本发明试剂盒（试剂盒2）与标杆罗氏的相关性为r²=0.7138，如图1所示，而试剂盒1与标杆罗氏的相关性为r²=0.5202，如图2所示，说明本发明试剂盒与罗氏的相关性更好，准确度更高。

注：本申请中所用的化学发光仪（lumo）由郑州安图生物工程股份有限公司提供。