一种鉴定间充质干细胞纯度的方法与流程

本发明属于细胞生物学领域，特别涉及间充质干细胞的鉴定。
背景技术：
：间充质干细胞(mesemchemalstemcells,msc)由friedenstein首先发现于骨髓中[1]。随后，在人体的其他组织中也陆续发现了msc，如脂肪[gruberhe,deeper,hoelschergl,ingramja,nortonhj,scannellb,loefflerbj,zinchenkon,hanleyen,tapph.humanadipose-derivedmesenchymalstemcells:directiontoaphenotypesharingsimilaritieswiththedisc,geneexpressionprofling,andcoculturewithhumanannuluscells.tissueengparta2010；16:2843-2860.]、胎盘[in’tankerps,scherjonsa,kleijburg-vanderkeurc,degroot-swingsgm,claasfh,fibbewe,kanhaihh.isolationofmesenchymalstemcellsoffetalormaternaloriginfromhumanplacenta.stemcells2004；22:1338-1345.]、脐带[liw,yeb,caix-y,linj-h,gaow-q.differentiationofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsintoprostate-likeepithelialcellsinvivo.plosone2014；9(7):e102657.]、牙髓[ponnaiyand,bhatkm,bhatgs.comparisonofimmunophenotypesofstemcellsfromhumandentalpulpandperiodontalligament.intjimmunopatholpharmacol2012；25:127-134.]脐血[ericesa,congetp,minguelljj.mesenchymalprogenitorcellsinhumanumbilicalcordblood.brjhaematol2000；109:235–42.]等。由于msc具有多向分化与旁分泌作用，这使得它成为再生医学的理想细胞材料。目前，对于msc尚无明确的表面标志物，根据2013年国际细胞治疗协会(theinternationalsocietyofcellulartherapy,isct)的声明[dominicim,leblanck,muellerietal.minimalcriteriafordefiningmultipotentmesenchymalstromalcells.theinternationalsocietyforcellulartherapypositionstatement.cytotherapy2006；8:315–317.]，msc应满足如下条件：1.在标准培养基条件下具有粘附塑料的特性；2.表达cd105，cd90和cd73,且不表达cd14或cd11b、cd79a或cd19,cd34、cd45、hla-dr；3.在体外能分化成骨，成脂和成软骨[m.krampera,j.galipeau,y.shi,k.tarte,andl.sensebe,immunologicalcharacterizationofmultipotentmesenchymalstromalcells—theinternationalsocietyforcellularterapy(isct)workingproposal.cytotherapy2013,15:(9)1054–1061.]。成纤维细胞是一类在人体广泛分布的细胞。它能合成细胞外基质，参与机体多种功能[reilkoffra,bucalar,herzogel.(2011)fibrocytes:emergingeffectorcellsinchronicinflammation.nat.rev.immunol.11:427–35.]。传统的间充质干细胞培养方法，并不能抑制成纤维细胞的生长，反而在传统的培养条件下，成纤维细胞对比间充质干细胞有生长优势。成纤维细胞污染，会导致间充质干细胞纯度越来越低，无论下端进行实验还是临床都不能正确评价脂肪干细胞的效果，从而导致实验误差，临床上有明显的副反应等。除了成纤维细胞污染，还有诸如静脉内皮，上皮细胞等，也是间充质干细胞培养中常见的杂细胞污染。细胞纯度无论是科研还是临床，是最关键的，如何评价细胞纯度则是重中之重。过去对间充质干细胞的鉴定标准是根据2013年国际细胞治疗协会(theinternationalsocietyofcellulartherapy,isct)的声明有facs：cd14≤2％,cd34≤2％,cd44≥95％,cd45≤2％,cd734≥95％,cd79a≤2％，cd904≥95％,cd1054≥95％,hla-dr≤2％；三系分化能力：成骨、成脂、成软骨。然而本发明人发现成纤维细胞也具有相同的facs表型，也具有三系分化能力，体外培养的形态也没差别，这个鉴定标准是国内外通用也是被广泛使用的，但其并不能鉴定培养的细胞中是不是间充质干细胞，由于传统的facs的表达量是不一样的，有些高有些低，所以更不能评价间充质干细胞在其中的纯度。技术实现要素：为了解决上述现有方法的不足，本发明提供了一种鉴定间充质干细胞纯度的方法,还提供了一种特异性蛋白的应用以及鉴别间充质干细胞的方法等。本发明其中一种技术方案提供了一种特异性蛋白的应用，该特异性蛋白为tm4sf1，tm4sf1用于鉴定间充质干细胞纯度的应用。本发明其中一种技术方案提供了一种特异性蛋白的应用，上述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。本发明其中一种技术方案提供了一种鉴定间充质干细胞纯度的方法，该鉴定间充质干细胞纯度的方法使用tm4sf1作为特异性指标。本发明其中一种技术方案提供了一种鉴定间充质干细胞纯度的方法，上述鉴定间充质干细胞纯度的方法使用cd105、cd90、cd79a、cd45、cd34、cd14、hla-dr、cd73、cd44和tm4sf1对应的荧光抗体。本发明其中一种技术方案提供了一种鉴定间充质干细胞纯度的方法，上述鉴定间充质干细胞纯度的方法步骤如下：1.将鉴定间充质干细胞加入15ml离心管中，加入生理盐水，离心；2.弃上清，重复上术步骤3次；3.计数后弃上清，加入适量pbs调整细胞悬液终浓度为1×107cells/ml；4.将细胞悬液转移至上样管中，并标记所用的抗体名称和荧光素；5.按照上样管标记，分别加入适量对应的荧光抗体：cd105,cd90，cd79a，cd45，cd34，cd14，hla-dr，cd73,cd44,tm4sf1，冰上避光孵育；6.用pbs清洗细胞2次，离心，吸去上清；7.加入pbs重悬细胞；8.上流式细胞仪检测并分析数据。本发明其中一种技术方案提供了一种鉴定间充质干细胞纯度的方法，上述分析数据中间充质干细胞具有tm4sf1。本发明其中一种技术方案提供了一种tm4sf1的应用，其中tm4sf1作为鉴别间充质干细胞方法中的表面标志物的应用。本发明其中一种技术方案提供了一种鉴别间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法使用tm4sf1作为鉴别间充质干细胞方法中的表面标志物。本发明发现，成纤维细胞与msc在体内的分布有诸多重合之处，而常见的分离msc的方法，无论是酶消化法或是组织块贴壁法均不能排除其中是否有成纤维细胞，尤其是在富含成纤维细胞的组织中。因而鉴定所得细胞是否为msc显得尤为重要。发明构思：本发明选用tm4sf1在间充质干细胞上表达，在成纤维细胞上不表达，从而能鉴定间充质干细胞中是否有成纤维细胞的污染；tm4sf1跟传统检测方法结合后，作为一个特异性指标，能评价脐带间充质干细胞的纯度过程：本发明人的另一发明“一种皮肤来源的成纤维细胞培养方法”，(专利号zl201710734675.2)。用该方法在皮肤的真皮层取得了纯化的成纤维细胞，通过流式鉴定cd14,cd34,cd44,cd45,cd73,cd79a，cd90,cd105,hla-dr等间充质干细胞一模一样，再做了成骨、成脂、成软骨的实验，发现成纤维细胞也具有分化能力，顾发明人发现现有的国内外对间充质干细胞的鉴定方法并不能区分间充质干细胞与成纤维细胞的区别。脐带干细胞来源于脐带华通氏胶，其中没有真皮层也没有结缔组织，故而其提取的干细胞是不存在成纤维细胞污染问题的。4次跨膜l6家族成员1(transmembrane-4l-sixfamilymember-1，tm4sf1)最早于1986年作为肿瘤细胞抗原而被发现。tm4sf1是一种小分子的质膜糖蛋白，主要参与细胞迁移、粘附与增殖的调控，在体内的诸多生物学行为进程中发挥重要作用。目前，关于tm4sf1的研究主要集中在抗肿瘤领域，有不少学者将tm4sf1作为肿瘤干细胞的标志物进行研究。在以上背景的启发下，我们尝试通过tm4sf1去鉴别成纤维细胞与脐带干细胞。我们通过rt-pcr与facs验证了成纤维细胞不表达tm4sf1，而脐带干细胞高表达。我们首次发现了tm4sf1在成纤维细胞与脐带干细胞上的区别。然后我们做了脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞的相关实验，得出来相同的结论。附图说明图1、为本发明其一个实施例中成纤维细胞与ucmsc常见免疫表型facs检测结果比较图；图2、为本发明其中一个实施例中倒置像差显微镜下观察成纤维细胞成脂、成软骨与成骨分化结果图；图3、为本发明其中一个实施例中倒置像差显微镜下观察成ucmsc成脂、成软骨与成骨分化结果图；图4、为本发明其中一个实施例中rt-pcr检测fsp-1表达图；图5、为本发明其中一个实施例中rt-pcr检测tm4sf1表达图。具体实施方式下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。材料与试剂本发明的实验经长海医院与上海科医联创生物科技有限公司伦理委员会批准通过，告知产妇及家属并签署知情同意书。足月顺产新生儿脐带、新生儿包皮(长海医院)；干细胞完全培养基(达科为)；dmem、fbs、dpbs、青霉素-链霉素、成脂、成软骨、成骨分化试剂盒(gibco)；t175、六孔板(corning)；胶原酶(serva)；分散酶、染料油红o、番红、茜素红s(sigma)；总rna提取试剂盒(genemark)，rt-pcr试剂盒(takara)，流式抗体apc-cd105、fitc-cd90、pe-cd73、fitc-cd44、fitc-cd14、pe-cd34、fitc-cd45、fitc-cd79a、fitc-hla-dr(biolegend)；流式抗体pe-tm4sf1(美天旎)；rt-pcr引物(杰李生物)。实施例1间充质干细胞鉴别1.将收集的细胞加入15ml离心管中，加入生理盐水，1200rpm/5min；2.弃上清，重复上术步骤3次；3.计数后弃上清，加入适量pbs调整细胞悬液终浓度为1×107cells/ml；4.将100微升细胞悬液转移至上样管中，并标记所有的抗体名称和荧光素；5.按照上样管标记，分别加入适量对应的荧光抗体：cd105,cd90，cd79a，cd45，cd34，cd14，hla-dr，cd73,cd44,tm4sf1。冰上避光孵育20分钟。(根据荧光抗体活性的不同，染色时间可适当调整)；6.用适量pbs清洗细胞2次，300g离心5分钟。仔细吸去上清；7.加入适量pbs重悬细胞；8.上流式细胞仪检测并分析数据。(如果不能及时上机检测，可将已染色细胞在多聚甲醛中4℃固定30分钟，避光保存)；实施例2脐带间充质干细胞鉴别本发明实施例研究选取了一类极具临床应用前景的msc——脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesemchemalstemcells,ucmsc)，试图找到能鉴别成纤维细胞与脐带间充质干细胞的方法。1.细胞的获得与培养成纤维细胞的获得与培养如[philippea.lysyetal.humanskinfibroblasts:frommesodermaltohepatocyte-likedifferentiation.hepatology2007,vol.46,no5,pp1574-1584.]，简言之：全皮经dispase4度处理过夜，除去表皮。余下真皮部分剪碎，经胶原酶37度消化3小时，将所得细胞计数，按1*104个细胞每平方厘米的密度接种于培养皿中，放置于含5％co2的细胞培养箱中37度培养，每隔3天细胞换液。脐带间充质干细胞的获得与培养如[liw,yeb,caix-y,linj-h,gaow-q.differentiationofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsintoprostate-likeepithelialcellsinvivo.plosone2014；9(7):e102657.]，简言之：将脐带浸泡于70％乙醇中30秒，重复三遍。然后将脐带浸泡于dpbs中，洗去附着的血液，剥除其中的脐静脉与脐动脉，将华通氏胶剪成小块，用胶原酶消化3小时，将所得细胞计数，按1*104个细胞每平方厘米的密度接种于培养皿中，放置于含5％co2的细胞培养箱中37度培养。每隔3天细胞换液。待细胞密度达到80％，进行消化传代。本实验所用细胞均为第三代细胞。2.流式分析细胞表型待细胞达到80％～90％密度时，消化以获得细胞，用dpbs清洗细胞两次。按照1*106个细胞每100微升体积加入对应的荧光标记的流式抗体，4℃避光孵育30分钟。用dpbs清洗细胞两次后重悬细胞，上机检测。3.细胞诱导分化实验按照诱导分化试剂盒说明书进行操作。待诱导时间到(成脂、成软骨的诱导分化时间为14天，成骨的诱导分化时间为21天)，用油红o进行成脂实验染色，番红进行成软骨实验染色，茜素红s进行成骨实验染色。染色操作按试剂盒说明书操作即可。4.反转录聚合酶链反应(reversetranscriptase-polymerasechainreaction.rt-pcr)用总rna纯化试剂盒提取成纤维细胞与ucmsc的rna,然后按照takara的rt-pcr试剂盒说明书进行后续操作。实验中所用引物序列见表1。表1.rt-pcr引物序列信息基因名称正向引物序列反向向引物序列fsp-1aaaaggacagatgaagctgctcatttcttcctgggctgcttm4sf1cctagcagaccaccagtcctgggttggttctgapdhtcagtggtggacctgacctgtgctgtagccaaattggttg结果如下：1.根据isct的msc标准，我们分别检测了成纤维细胞与ucmsc表面分子cd14、cd34、cd45、cd79a、hla-dr、cd44、cd73、cd90及cd105的表达情况。我们发现成纤维细胞与ucmsc均高表达cd44、cd73、cd90和cd105；均低表达cd14、cd34、cd45、cd79a及hla-dr(如图1所示)。2.分化能力检测按照试剂盒说明书操作，将第三代成纤维细胞与第三代ucmsc分别进行了细胞成脂、成软骨与成骨的诱导分化实验，如图2图3所示。我们发现两种细胞都有分化能力。3.rt-pcr检测fsp-1表达情况如图4可见，成纤维细胞与ucmsc均表达fsp-1,且表达量相当。4.tm4sf1在成纤维细胞与ucmsc上的表达情况本发明首先通过rt-pcr的方法检测成纤维细胞与ucmsc上tm4sf1的表达情况，如图5，本发明发现，成纤维细胞不表达tm4sf1，而ucmsc表达tm4sf1。同时我们用facs进行验证，也得到同样的结果。结论按照isct的最低标准，本发明实施例检测了成纤维细胞表面cd14、cd34、cd45、cd79a、hla-dr、cd44、cd73、cd90及cd105的表达情况。本发明发现成纤维细胞与ucmsc一样高表达cd44、cd73、cd90和cd105，低表达cd14、cd34、cd45、cd79a及hla-dr。同时我们也将两种细胞分别加入诱导培养基进行细胞的诱导分化实验，实验结果表明成纤维细胞与ucmsc一样能被诱导分化为脂肪、软骨与骨。本发明从成纤维细胞方面找到突破口。现有文献没有研究比较过ucmsc是否表达fsp-1(fibroblast-specificprotein-1)。本发明实施例进行了rt-pcr检测成纤维细胞与ucmsc表达fsp-1情况，发现二者均表达fsp-1。tm4sf1是一种小分子的质膜糖蛋白，主要参与细胞迁移、粘附与增殖的调控，在体内的诸多生物学行为进程中发挥重要作用。目前，关于tm4sf1的研究主要集中在抗肿瘤领域[mitsutaken,iwaoa,nagaik,nambah,ohtsurua,saenkovandyamashitas.characterizationofsidepopulationinthyroidcancercelllines:cancerstem-likecellsareenrichedpartlybutnotexclusively.endocrinology.2007；148:1797-1803.][alliolin,vincents,vlaeminck-guillemv,decaussinpetruccim,ragagef,ruffionaandsamarutj.tm4sf1,anovelprimaryandrogenreceptortargetgeneover-expressedinhumanprostatecancerandinvolvedincellmigration.prostate.2011；71:1239-1250.]，没有作为鉴别间充质干细胞使用的。本发明通过tm4sf1去鉴别成纤维细胞与ucmsc。本发明实施例通过rt-pcr与facs验证了成纤维细胞不表达tm4sf1，而ucmsc高表达。本发明首次发现了tm4sf1在成纤维细胞与ucmsc上的区别，tm4sf1可作为鉴别成纤维细胞与ucmsc的极有潜力的表面标志物，可将tm4sf1纳入msc的质控体系中。上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。当前第1页12