光学超分辨显微成像系统及成像方法与流程

本发明涉及生物医学显微成像、材料研究和集成电路芯片检测成像领域，更具体地说，本发明涉及一种光学超分辨显微成像的系统和方法。

背景技术：

目前，超分辨光学显微成像技术主要有受激发射损耗显微镜技术(sted)、光激活定位显微镜技术(palm)/随机光学重建显微镜技术(storm)和结构照明(sim)三大类。

受激发射损耗显微镜技术需要两束严格共轴的激光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光，系统结构复杂，搭建成本高昂。同时，该技术的分辨率与损耗光的光强相关，光强越高分辨率越高。而过高的损耗光光强，会对生物样品带来额外的光损伤，因而限制了该技术的适用性。

光激活定位显微成像技术/随机光学重建显微成像技术利用光谱特性对荧光分子进行分时探测和中心位置定位，从而实现荧光密集标记样本的超分辨成像。此类技术需要大量地重复激活-激发-定位-漂白过程，需要成像几千上万次，才能重构得到超分辨图像。因此，该技术的使用受到极大的限制。

结构照明显微成像技术利用一个载频条纹的照明光在样品上形成摩尔纹(moirefringes)，样品的荧光信息通过成像系统被ccd接收，之后通过傅里叶变换将空间域和频域进行变化，从而获得超分辨图像。在实际应用中，该技术主要受限于ccd，很难在视野大小和超分辨率之间做好平衡。

传统的传统共聚焦得到的图像艾利斑直径大，分辨率差，不满足使用要求。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种光学超分辨显微成像系统，在常规的共聚焦成像系统的激发光路里加入光束整形器，将激发光由高斯光束整形为环形光束，使共聚焦成像系统对样品的照明，具有主光斑尺寸小于艾利斑、带有明显旁瓣特征，提高了图像分辨率。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种光学超分辨显微成像系统，包括沿光路设置的光源、准直镜、激发滤光镜、光束整形器、扫描透镜、显微镜，其中，

所述光源发射的光经过所述准直镜和所述激发滤光镜后形成准直的激发光；

所述光束整形器将所述准直的激发光整形为环形平行光；

所述扫描透镜将所述环形平行光聚焦在所述显微镜的成像平面上，以使所述样品发射荧光。

优选的是，所述的光学超分辨显微成像系统，光束整形器与显微镜之间还设有二色分光镜，所述二色分光镜将所述样品发射的荧光从所述环形平行光光路分离；

在沿样品发射的荧光的光路上还设有发射滤光镜、聚焦透镜、设有针孔的针孔板、光电探测器；

所述发射滤光镜仅透过所述样品发射的荧光，截止其余波长的光；

所述聚焦透镜将所述样品发射的荧光聚焦于所述设有针孔的针孔板；

所述光电探测器将穿过所述设有针孔的针孔板的荧光转为电信号，并传至计算机并将所述电信号还原为图像。

优选的是，所述的光学超分辨显微成像系统，所述光束整形器包括沿光路依次设置的平凹锥透镜、平凸锥透镜、长焦距凸透镜、短焦距凸透镜或短焦距凹透镜，其中所述平凹锥透镜与平凸锥透镜的锥角相同。

优选的是，所述的光学超分辨显微成像系统，所述光束整形器包括沿光路依次设置的光空间调制器、长焦距凸透镜、短焦距凸透镜或短焦距凹透镜构成，其中，通过所述光空间调制器来改变所述环形平行光光束的直径。

优选的是，所述的光学超分辨显微成像系统，所述设有针孔的针孔板的直径等于或大于所述聚焦透镜对所述样品发射的荧光汇聚形成的光斑的直径。

优选的是，所述的光学超分辨显微成像系统，还包括移动机构，其可改变环形平行光扫描样品的角度，从而使样品被完全地、均匀地扫描。

优选的是，所述的光学超分辨显微成像系统，移动机构为位于二色分光镜后方的xy扫描振镜，通过xy扫描振镜的摆动使样品被完全地、均匀地扫描；或移动机构为三维平移台，通过所述三维平移台带动所述样品移动，以使所述样品被完全地、均匀地扫描。

优选的是，所述的光学超分辨显微成像系统，所述光束整形器还包括运动机构，所述运动机构可控制所述平凸锥透镜沿光轴前后移动，以改变所述环形平行光光束的直径。

本发明还提供了一种光学超分辨显微成像方法，包括以下步骤：

s1、获取待测样品的共聚焦图像，将共聚焦图像分割成多个区域图像，每个区域图像均包括一个中心光斑以及环绕中心光斑外周的环形旁瓣，对每个区域图像进行线性插值计算得到插值后的区域图像，获取每个插值后的区域图像的灰阶分布曲线，依据灰阶强度分布曲线构建与区域图像的中心光斑灰阶强度分布一致的第一光斑图像或依据灰阶强度分布曲线构建最高强度与灰阶强度分布曲线最高灰阶相同、分布与区域图像的环形旁瓣灰阶强度分布一致的第二光斑图像；

s2、将每个第一光斑图像代替每个区域图像拼接后形成没有旁瓣的超分辨图像；或将每个第二光斑图像代替每个区域图像拼接后形成没有旁瓣的超分辨图像。

本发明还提供了一种光学超分辨显微成像方法，包括以下步骤：

a1、获取标准样品的共聚焦图像，在标准样品的共聚焦图像选择一个包含中心光斑以及环绕中心光斑外周的环形旁瓣的区域作为模板；

a2、对每个模板区域的图像进行插值计算得到插值后的模板区域图像，获取插值后的模板区域图像的灰阶强度分布曲线，依据灰阶强度分布曲线构建与模板区域图像的中心光斑灰阶强度分布一致的第三光斑图像或依据灰阶强度分布曲线构建最高强度与灰阶强度分布曲线最高灰阶相同、分布与模板区域图像的环形旁瓣灰阶强度分布一致的第四光斑图像；

a3、在与标准样品相同条件下，获得待测样品的共聚焦图像，在待测样品的共聚焦图像中标记出多个与模板相对应的位置，并使用第三光斑图像或第四光斑图像代替对应位置处的图像，拼接后形成没有旁瓣的超分辨图像。

本发明至少包括以下有益效果：

1、本发明的光学超分辨显微成像系统，在常规的共聚焦成像系统的激发光路里加入光束整形器，将激发光由高斯光束整形为环形光束，使共聚焦成像系统对样品的照明，具有主光斑尺寸小于艾利斑、带有明显旁瓣特征，提高了图像分辨率。

2、本发明的光学超分辨显微成像系统，设置共聚焦成像系统的设有针孔的针孔板的尺寸，等于或大于样品发射的荧光在共聚焦成像系统光路里形成的艾利斑，不以牺牲系统的光采集效率为代价压制旁瓣，而是保持系统原有的光采集效率，获取具有明显旁瓣特征的原始共聚焦图像。

3、本申请的主光斑直径比传统共聚焦的艾利斑直径小，分辨率高，且环形旁瓣比主光斑更小，更进一步提高分辨率。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明的光学超分辨显微成像系统其中一个技术方案的结构示意图；

图2为本发明的光学超分辨显微成像系统另一个技术方案的结构示意图；

图3为本发明的光学超分辨显微成像系统另一个技术方案的结构示意图；

图4为本发明的光学超分辨显微成像系统另一个技术方案的结构示意图；

图5为本发明的光束整形器将准直的激发光整形为环形平行光的原理示意图；

图6为样品共聚焦图像的区域图像的示意图；

图7为经插值计算后区域图像的示意图；

图8为区域图像的灰阶分布曲线；

图9为样品共聚焦图像的示意图；

图10为第一光斑的示意图；

图11为第一光斑拼接后的示意图；

图12为第二光斑的示意图；

图13为第二光斑拼接后的示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，在本发明的描述中，术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

如图1～5所示，提供了一种光学超分辨显微成像系统，包括沿光路设置的光源1、准直镜2、激发滤光镜3、光束整形器，扫描透镜11、显微镜，其中，

所述光源1发射的光经过所述准直镜2和所述激发滤光镜3后形成准直的激发光；

所述光束整形器将所述准直的激发光整形为环形平行光；

所述扫描透镜11将所述环形平行光聚焦在所述显微镜的成像平面上，进而在位于所述显微镜的物镜焦平面的样品上形成带有环形旁瓣的照明光斑，以使所述样品发射荧光；

光束整形器与显微镜之间还设有二色分光镜8，所述二色分光镜8将所述样品发射的荧光从所述环形平行光光路分离；

在沿样品发射的荧光的光路上还设有发射滤光镜12、聚焦透镜13、设有针孔的针孔板14、光电探测器15；

所述二色分光镜8将所述样品发射的荧光从所述环形平行光光路分离；

所述发射滤光镜12仅透过所述样品发射的荧光，截止其余波长的光；

所述聚焦透镜13将所述样品发射的荧光聚焦于所述设有针孔的针孔板；

所述光电探测器15将穿过所述设有针孔的针孔板的荧光转为电信号，并传至计算机并将所述电信号还原为图像。光电探测器为单点光电探测器或面阵探测器。

本发明的光学超分辨显微成像系统，光源1发射的光经过准直镜2和激发滤光镜3后形成准直的激发光；光束整形器将准直的激发光整形为环形平行光；扫描透镜11将环形平行光聚焦在显微镜的成像平面上，显微镜包括一个筒镜16、一个物镜17，进而在位于所述显微镜的物镜焦平面的样品21上形成带有环形旁瓣的照明光斑，以使所述样品21发射荧光；二色分光镜8将样品发射的荧光从环形平行光光路分离；发射滤光镜12仅透过所述样品发射的荧光，截止其余波长的光；聚焦透镜13将样品21发射的荧光聚焦于设有针孔的针孔板；光电探测器15将穿过所述设有针孔的针孔板的荧光转为电信号，并传至计算机并将所述电信号还原为图像。本发明的光学超分辨显微成像系统，在常规的共聚焦成像系统的激发光路里加入光束整形器，将激发光由高斯光束整形为环形光束，使共聚焦成像系统对样品的照明，具有主光斑尺寸小于艾利斑、带有明显旁瓣等特征，本发明的光学超分辨显微成像系统，可对fitc和dapi等染料，gfp等荧光蛋白，量子点等样品显微成像，本发明的成像系统大大提高了对样品的分辨率。该共聚焦图像与传统共聚焦的图像相比，分辨率提高了1.6倍(主光斑的半峰宽：艾利斑的半峰宽＝1:1.6)，且带有明显的环形旁瓣特征。

在另一种技术方案中，所述的光学超分辨显微成像系统，所述光束整形器包括沿光路依次设置的平凹锥透镜4、平凸锥透镜5、长焦距凸透镜6、短焦距凸透镜7或短焦距凹透镜，其中所述平凹锥透镜4与平凸锥透镜5的锥角相同。通过平凹锥透镜4、平凸锥透镜5、长焦距凸透镜6、短焦距凸透镜7或短焦距凹透镜可将准直的激发光整形为环形平行光。该光束整形器将准直的激发光整形为环形平行光现有技术即可实现，其原理如图5所示。

在另一种技术方案中，所述的光学超分辨显微成像系统，所述光束整形器包括沿光路依次设置的光空间调制器20、长焦距凸透镜、短焦距凸透镜或短焦距凹透镜构成，其中，通过所述光空间调制器20来改变所述环形平行光光束的直径。

在另一种技术方案中，所述的光学超分辨显微成像系统，针孔的直径等于或大于所述聚焦透镜13对所述样品发射的荧光汇聚形成的光斑的直径。针孔的尺寸等于或大于样品发射的荧光在共聚焦成像系统光路里形成的艾利斑，不以牺牲系统的光采集效率为代价压制旁瓣，而是保持系统原有的光采集效率，获取具有明显旁瓣特征的原始共聚焦图像。

在另一种技术方案中，所述的光学超分辨显微成像系统，还包括移动机构，其可改变环形平行光扫描样品的角度，从而使样品被完全地、均匀地扫描。

在另一种技术方案中，所述的光学超分辨显微成像系统，移动机构为位于二色分光镜8后方的xy扫描振镜9和10，通过xy扫描振镜的摆动使样品被完全地、均匀地扫描；xy振镜摆动，可以改变环形光束进入扫描透镜的角度，进而改变光束在样品上汇聚的位置，使样品被完全地、均匀地扫描；或移动机构为三维平移台，通过所述三维平移台带动所述样品移动，进而使环形平行光扫描样品的角度改变，以使所述样品被完全地、均匀地扫描。

在另一种技术方案中，所述的光学超分辨显微成像系统，所述光束整形器还包括运动机构，所述运动机构可控制所述平凸锥透镜5沿光轴前后移动，以改变所述环形平行光光束的直径。该运动机构为设置于平凸锥透镜5下方的沿光轴方向设置的滑轨，平凸锥透镜5可沿滑轨滑动，使平凹锥透镜4和平凸锥透镜5的相距设定的距离，当光源1打开时，以改变所述环形平行光光束的直径，得到合适的环形平行光。

在另一种技术方案中，所述的光学超分辨显微成像系统，所述光电探测器15为单点光电探测器或面阵探测器。

本发明还提供了使用光学超分辨显微成像系统成像方法，包括以下步骤：

利用超分辨显微成像系统获取待测样品的共聚焦图像如图9所示，将共聚焦图像分割成多个区域图像，如图6所示，每个区域图像均包括一个中心光斑31以及环绕中心光斑外周的环形旁瓣32，即共聚焦图像由多个区域图像拼接叠加而成，对每个区域图像进行线性插值计算得到插值后的区域图像如图7所示，比如区域一个位置的灰阶为1、另一个位置灰阶为3，经插值计算后灰阶为2，将插值计算后的灰阶连接即得到每个插值后的区域图像的灰阶分布曲线，区域图像不同位置处的灰阶不同，获取不同位置的灰阶值，并得到灰阶强度分布曲线，如图8所示，依据灰阶强度分布曲线构建与区域图像的中心光斑31灰阶强度分布一致的第一光斑图像如图10所示，即第一光斑图像的强度与分布与中心光斑31完全一致，将每个第一光斑图像代替每个区域图像拼接后形成没有旁瓣的超分辨图像，如图11所示；或者依据灰阶强度分布曲线构建最高强度与灰阶强度分布曲线最高灰阶相同、分布与区域图像的环形旁瓣灰阶强度分布一致的第二光斑图像如图12所示，即第二光斑图像的最高光强与中心光斑31的最高光强相同，但光强的分布趋势与环形旁瓣32的灰阶强度分布曲线一致，将每个第二光斑图像代替每个区域图像，拼接后形成没有旁瓣的超分辨图像，如图13所示。

在实际中，还可利用超分辨显微成像系统获取标准样品的共聚焦图像，标准样品可为直径小于100nm的荧光小球，在标准样品的共聚焦图像中截取大小为n*n的区域图像作为模板区域，该区域图像具有中心光斑和环形旁瓣，并记录系统中的激发光波长、荧光波长、扫描振镜摆动范围、进入扫描透镜的环形平行光的直径、物镜的倍率和数值孔径，作为系统参数；并按照上述类似的方法，构建与模板区域图像的中心光斑灰阶强度分布一致的第三光斑图像或依据灰阶强度分布曲线构建最高强度与灰阶强度分布曲线最高灰阶相同、分布与模板区域图像的环形旁瓣灰阶强度分布一致的第四光斑图像；在与标准样品相同的系统参数条件下，获得待测样品的共聚焦图像，在待测样品的共聚焦图像中标记出多个与模板相对应的位置，并使用第三光斑图像或第四光斑图像代替对应位置处的图像，拼接后形成没有旁瓣的超分辨图像。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。