一种近红外荧光增敏法测定葡萄糖的制作方法

本发明属于功能材料制备及应用技术领域，具体涉及一种近红外荧光增敏法测定葡萄糖。

背景技术：

葡萄糖是生物体基础生命活动过程中必不可少的营养物质，可直接参与到新陈代谢中，对保证人体各组织和器官的能量供应以及保持人体健康具有重要意义。除了生理必须外，葡萄糖在食品工业、医药制造、环境监测以及生物过程监控中均有着广泛的应用。

近年来，人们己经发展了多种方法用于葡萄糖含量的检测，如高效液相色谱法、旋光度法、分光光度法、电化学方法和荧光法等。但这些方法都存在一定的缺点，如色谱法在检测过程往往需要进行样品的前处理，操作复杂；旋光度法则只适宜作为一种辅助的方法；分光光度法在检测中需要加入显色剂；电化学方法虽然具有较高的灵敏度，但重复性较差。与其它检测方法相比，荧光法普遍具有灵敏度高、选择性好、操作简便快速和能够实现在线实时分析等优点。但是常规的荧光方法是基于荧光的猝灭程度与被测物之间的浓度关系进行定量检测，而在实际应用中样品的杂质极大可能会导致探针荧光的猝灭，引起假阳性信号，最终影响检测结果。荧光增敏法是通过荧光强度的增强程度与待测物浓度的相关性来进行分析检测，这样就可以大大减少假阳性信号的干扰，提高检测的灵敏度和选择性。

技术实现要素：

本发明为解决常规荧光猝灭方法的假阳性、干扰严重的问题，提供了一种近红外荧光增敏法测定葡萄糖，以金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料作为荧光探针，操作简单、响应快速、灵敏度高、选择性好。

本发明采用以下技术方案：一种近红外荧光增敏法测定葡萄糖，以巯基化合物为修饰剂制备了粒径小于2nm的金纳米粒子，通过静电作用将其吸附到葡萄糖氧化酶上制得金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料；以金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料作为近红外荧光探针，加入葡萄糖后，金纳米粒子的近红外荧光增强，荧光的增强程度与葡萄糖的浓度呈正比，从而实现对葡萄糖的检测。

所述的金纳米-葡萄糖氧化酶近红外荧光探针的制备方法为：

（1）制备金纳米粒子：以巯基化合物n-乙酰基-l-半胱氨酸为配体，通过nabh4还原haucl4∙3h2o来合成金纳米粒子；具体合成步骤如下：分别称取摩尔比为1:2.5-1:4的氯金酸和n-乙酰基-l-半胱氨酸，将其溶解于体积比为6:1的甲醇/冰醋酸溶剂中，使氯金酸和n-乙酰基-l-半胱氨酸充分溶解，然后将溶液置于冰浴中，在搅拌条件下加入硼氢化钠乙醇溶液，硼氢化钠与氯金酸的摩尔比为10:1-20:1，反应30-50min后加入丙酮使反应停止，离心除去溶剂，得到的金纳米粒子的粗产品；用二次水将粗产品重新溶解后装入透析袋中进行纯化，真空干燥得到粉末状金纳米粒子；

（2）制备金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料：分别称取质量比1:5-1:25的金纳米粒子和葡萄糖氧化酶，将其溶解于二次水中，搅拌持续5h；向反应溶液中加入适量的甲醇、乙醇或丙酮，13000rpm、10℃离心15min弃去上清液，沉淀真空干燥后得到金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料。

所述的葡萄糖检测的标准曲线由以下步骤获得：

（1）称取制备好的金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料，溶于二次水中配置成0.05mg/ml的溶液，取2ml于比色皿中置于荧光光度计的样品架上，扫描其荧光光谱，激发波长为520nm，发射波长的扫描范围为550-850nm；

（2）配制若干浓度梯度的葡萄糖标准溶液；

（3）将所配制的葡萄糖标准溶液分别加入金纳米-葡萄糖氧化酶溶液中，在常温下孵化10min后，依次进行荧光光谱扫描；

（4）对获得的数据进行处理，以葡萄糖的浓度为横坐标，金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料的荧光强度的增强程度f/f0为纵坐标作图，其中f0是未加入葡萄糖时荧光探针的最大发射峰680nm处的荧光强度，f是加入葡萄糖后相对应的荧光探针的最大发射峰的荧光强度，对点图进行线性拟合得到检测葡萄糖的标准曲线方程。

所述的实际样品中葡萄糖的检测步骤如下：

（1）配置浓度为0.05mg/ml的金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料，取2ml于比色皿中；

（2）实际样品经离心过滤或离心超滤后，取50µl加入到上述的比色皿中，在常温下孵化10min后扫描其荧光光谱，激发波长为520nm，发射波长的扫描范围为550-850nm；

（3）由荧光光谱中可得到最大发射峰的强度f，进一步计算得到f/f0的值，代入已知的标准曲线方程中计算得到葡萄糖的浓度。

本发明具有以下有益技术效果：本发明以巯基化合物为修饰剂制备了粒径小于2nm的金纳米粒子，该纳米粒子具有优良的近红外荧光性能；然后通过静电作用将其吸附到葡萄糖氧化酶上制得金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料；该杂化材料可以作为近红外荧光探针，通过金纳米粒子的近红外荧光的增敏程度与葡萄糖浓度之间的相关性来测定葡萄糖。

（1）本发明建立的方法是基于荧光增敏原理，可以有效的避免常规的荧光猝灭法导致的假阳性干扰，很好的提高了检测的灵敏度。

（2）本发明制备的金纳米粒子的荧光发射位于近红外区，可大大减少本底荧光和瑞利拉曼散射的干扰，且金纳米粒子制备步骤简单，合成条件温和，具有很好的水溶性、分散性、稳定性和生物相容性。

（3）本发明利用金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料作为荧光探针，对于葡萄糖的识别具有很好的特异性，因而可提高该方法的选择性，拓宽检测的线性范围。以此建立的方法不需要复杂的样品前处理过程，操作简便，且金纳米和葡萄糖氧化酶的结合能增加酶的稳定性。

本发明可用于食品、工业、环境及生命体系中葡萄糖的测定。

附图说明

图1为实施例1制备的金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料的tem图。图2为实施例1制备的近红外荧光探针的荧光光谱图。图3为实施例1中葡萄糖对制备的荧光探针的荧光光谱的影响。图4为实施例1检测葡萄糖的标准曲线。图5为实施例2中葡萄糖对制备的荧光探针的荧光光谱的影响。图6为实施例2检测葡萄糖的标准曲线。

具体实施方式

实施例1：一种近红外荧光增敏法测定葡萄糖，以金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料作为近红外荧光探针，加入葡萄糖后，金纳米粒子的近红外荧光增强，荧光的增强程度与葡萄糖的浓度呈正比，从而实现对葡萄糖的检测。

（1）金纳米粒子的合成：分别称取0.0394g的haucl4∙3h2o和0.0490g的n-乙酰基-l-半胱氨酸，将其混合后溶解于5ml的甲醇/冰醋酸（体积比为6:1）有机溶剂，置于冰浴中，在搅拌下快速加入含有0.0775g硼氢化钠的乙醇溶液，持续搅拌控制反应时间为30min，然后加入10ml丙酮，通过离心除去溶剂，得到金纳米粒子的粗产品。将得到的粗产品溶于1ml的二次水中转入透析袋，纯化3天后经过真空干燥得到粉末状的金纳米粒子。

（2）金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料的制备：称取10mg金纳米粒子将其溶解于0.5ml的二次水中，在搅拌下加入10ml浓度为20.0mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液，缓慢搅拌下反应5h。向反应后的溶液中加入10ml甲醇，通过13000rpm的离心机在10℃离心15min，弃去上清液，沉淀通过真空干燥后得到金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料，附图1为它的tem图。

（3）测定葡萄糖标准曲线的绘制：称取0.1mg制备好的金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料，将其溶解于2ml的二次水中配置成0.05mg/ml的溶液，放入石英杯中置于荧光光谱仪的样品槽内扫描其荧光光谱图（见附图2）。激发波长设置为520nm，发射波长的扫描范围为550-850nm。从附图2可以看出，金纳米的最大发射峰在680nm处，位于近红外区。

向上述的金纳米-葡萄糖氧化酶溶液中，分别加入浓度为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60mmol/l的葡萄糖溶液。在常温下孵化10min后分别记录其荧光光谱，结果如图3所示。对获得的数据进行处理，以葡萄糖的浓度为横坐标，金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料的荧光强度的增强程度f/f0为纵坐标作图，其中f0是未加入葡萄糖时荧光探针的最大发射峰680nm处的荧光强度，f是加入一定浓度的葡萄糖后相对应的荧光强度，最后对点图进行线性拟合得到标准曲线图，如图4所示。由此方法得到测定葡萄糖的线性范围为5.0×10^-6~6.0×10^-4mol/l，回归方程为f/f0=1.0604c+1.3842（c为10^-4mol/l），检测限为1.0×10^-7mol/l，r²=0.9906。

（4）新鲜人血液中葡萄糖的检测：取新鲜人血液，用超滤管进行离心超滤（截留分子量为3000），滤液用移液器移取50µl加入到2ml0.05mg/ml的金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料溶液中，在常温下孵化10min后扫描其荧光光谱，得到最大发射峰的强度f，计算f/f0的值，代入（3）的标准曲线方程中，求得检测溶液中葡萄糖的浓度为1.42×10^-4mol/l，而人血液加入到检测溶液中后被稀释了40倍，因而得到人血样中葡萄糖的含量为5.68×10^-3mol/l。本发明测得的结果与标准方法比较无明显差异。

实施例2：一种近红外荧光增敏法测定葡萄糖，以金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料作为近红外荧光探针，加入葡萄糖后，金纳米粒子的近红外荧光增强，荧光的增强程度与葡萄糖的浓度呈正比，从而实现对葡萄糖的检测。

（1）金纳米粒子的合成：分别称取0.0394g的haucl4∙3h2o和0.0572g的n-乙酰基-l-半胱氨酸，将其混合后溶解于6ml的甲醇/冰醋酸（体积比为6:1）有机溶剂，置于冰浴中，在搅拌下快速加入含有0.0775g硼氢化钠的乙醇溶液，持续搅拌控制反应时间为40min，然后加入10ml丙酮，通过离心除去溶剂，得到金纳米粒子的粗产品。将得到的粗产品溶于1ml的二次水中转入透析袋，纯化3天后经过真空干燥得到粉末状的金纳米粒子。

（2）金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料的制备：称取10mg金纳米粒子将其溶解于0.5ml的二次水中，在搅拌下加入5ml浓度为20.0mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液，缓慢搅拌下反应4.5h。向反应后的溶液中加入10ml甲醇，通过13000rpm的离心机在10^oc离心15min，弃去上清液，沉淀通过真空干燥后得到金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料。

（3）测定葡萄糖标准曲线的绘制：称取制备好的金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料，将其溶解于二次水中配置成0.02mg/ml的溶液，取0.5ml于石英杯中放置到荧光光谱仪的样品槽内扫描其荧光光谱图。激发波长设置为520nm，发射波长的扫描范围为550-850nm。

向上述的金纳米-葡萄糖氧化酶溶液中，分别加入浓度为0、0.04、0.15、0.30、0.40、0.50、0.55mmol/l的葡萄糖溶液。在常温下孵化10min后分别记录其荧光光谱，结果如图5所示。对获得的数据进行处理，以葡萄糖的浓度为横坐标，金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料的荧光强度的增强程度f/f0为纵坐标作图，其中f0是未加入葡萄糖时荧光探针的最大发射峰660nm处的荧光强度，f是加入一定浓度的葡萄糖后相对应的荧光强度，最后对点图进行线性拟合得到标准曲线图，如图6所示。由此方法得到测定葡萄糖的线性范围为4.0×10^-6~5.5×10^-4mol/l，回归方程为f/f0=0.4060c+0.9679（c为10^-4mol/l），检测限为1.0×10^-7mol/l，r²=0.9965。

（4）长城红酒中葡萄糖的检测：用移液器移取长城干红葡萄酒10µl加入到2ml0.05mg/ml的金纳米-葡萄糖氧化酶杂化材料溶液中，在常温下孵化10min后扫描其荧光光谱，得到最大发射峰的强度f，计算f/f0的值，代入（3）的标准曲线方程中，得到混合溶液中葡萄糖的浓度为9.9×10^-5mol/l，而葡萄酒加入到溶液中后浓度被稀释了200倍，因此得知长城干红葡萄酒中葡萄糖的含量为1.98×10^-2mol/l。本发明测得的结果与标准方法比较无明显差异。