一种桃仁配方颗粒中D-苦杏仁苷的含量测定方法与流程

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种桃仁配方颗粒中d-苦杏仁苷的含量测定方法。

背景技术：

桃仁为蔷薇科植物桃prunuspersica(l.)batsch或山桃prunusdavidiana(carr.)franch.的干燥成熟种子，收载于2015版《中国药典》，具有活血祛瘀，润肠通便，止咳平喘功效，用于经闭痛经，癥瘕痞块，肺痈肠痈，跌扑损伤，肠燥便秘，咳嗽气喘。现代研究表明，桃仁的主要有效成分之一为苦杏仁苷，是《中国药典》质量控制的指标化合物，具有止咳平喘、抗动脉粥样硬化、抗氧诱导性肺损伤、抗炎、抗肿瘤及免疫调节等药理作用。

桃仁配方颗粒是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，在中医临床配方后，供患者冲服使用。苦杏仁苷具有l-苦杏仁苷和d-苦杏仁苷2种构型，一般情况下，以d-苦杏仁苷的形式存在于桃仁中，为镇咳、平喘的主要药效成分，通常所述的苦杏仁苷是指d-苦杏仁苷。据有关研究表明，苦杏仁苷的热稳定性较差，在高温煎煮条件下，苦杏仁苷易产生异构化，具体表现为d-苦杏仁苷随着水温的上升而异构化产生l-苦杏仁苷。目前文献及《广东省中药配方颗粒标准》(第一册)多报道桃仁配方颗粒中苦杏仁苷含量测定采用中国药典2015年一部桃仁药材苦杏仁苷含量测定的hplc方法，该方法色谱图显示的苦杏仁苷为单一峰(如图1)，色谱峰里面包含了2种苦杏仁苷(d型与l型)，也就是说d-苦杏仁苷和l-苦杏仁苷不能很好的分离，而中国食品药品检定研究院所提供是法定对照品属d-苦杏仁苷，因此，采用hplc方法势必会存在d-苦杏仁苷含量测定的不准确性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种桃仁配方颗粒中d-苦杏仁苷的含量测定方法，该方法能从根本分离苦杏仁苷两种手性化合物，确保含量测定的准确性。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种桃仁配方颗粒中d-苦杏仁苷的含量测定方法，包括以下步骤：

(1)色谱条件与系统适应性试验：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b，按下表规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4ml；柱温为20℃；检测波长为210nm；理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于25000；

(2)对照品溶液的制备：取d-苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

(3)供试品溶液制备：取桃仁配方颗粒，研细，取0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60-80％甲醇50ml，称定重量，超声处理15-45分钟，放冷，再称定重量，用60-80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明对供试品溶液的制备条件进行了优化，对不同提取溶剂、不同提取方式、不同提取时间及不同料液比进行考察，进一步优选的，所述供试品溶液制备，具体为：取桃仁配方颗粒，研细，取0.1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，功率为250w，频率为40khz，取出，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，即得。

本发明的桃仁配方颗粒是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，所述桃仁配方颗粒的制备方法为：取桃仁饮片，加水煎煮1-2次，每次1-2小时，滤过，滤液浓缩成清膏，喷雾干燥得干浸膏，干浸膏出膏率范围为12％～21％，加辅料适量(如麦芽糊精和二氧化硅等)，混匀，制粒，即得。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明通过优化色谱条件及供试品的制备方法，采用uplc法能从根本分离苦杏仁苷两种手性化合物，将d-苦杏仁苷与l-苦杏仁苷分离后再测定d-苦杏仁苷的含量，大大增强了含量测定的准确性。

本发明的含量测定方法灵敏度高，具有很好的分离度，检测方法具有专属性，其准确性、重现性、线性关系、稳定性均能达到科研和生产的要求，为桃仁配方颗粒的质量控制提供快速、准确、可靠的检测方法。

附图说明

图1为广东省中药配方颗粒质量标准(第一册)桃仁配方颗粒含量测定液相色谱图；

图2本发明方法桃仁配方颗粒含量测定液相色谱图，其中，峰4：l-苦杏仁苷；峰5：d-苦杏仁苷。

图3为不同酸种类的流动相的色谱图(从下向上依次为0.1％磷酸溶液、0.05％磷酸溶液、0.5％冰醋酸溶液)；

图4为标准曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

1材料和方法

1.1仪器

thermo超高效液相色谱仪(vanquish，赛默飞世尔科技有限公司)；acquityhsst3(2.1mm×100mm，1.8μm，编号：bh045)、acquityhsst3(2.1mm×100mm，1.8μm，编号：bh046)、ymctriartc18(2.1mm×100mm，1.9μm，编号：bh028)，万分之一天平(me204e，梅特勒-托利多公司)，百万分之一天平(xp26，梅特勒-托利多公司)，电子天平(jj600，常熟市双杰测试仪器厂)；数控超声波清洗器(kq500d，昆山市超声仪器有限公司)；恒温水浴锅(hws28型，上海一恒科技有限公司)；超纯水系统(milli-qdirect，默克股份有限公司)。

1.2试剂

乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)、甲醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)；磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)、乙腈(默克股份有限公司，色谱纯)、水为超纯水(milli-qdirect超纯水系统，默克股份有限公司)。

1.3对照品

d-苦杏仁苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110820-201607，含量：90.7％)

1.4桃仁配方颗粒的制备

取桃仁饮片，加水煎煮2次，每次1小时，滤过，滤液浓缩成清膏，加辅料适量，喷雾干燥，干浸膏出膏率范围为12％～21％，加麦芽糊精和二氧化硅适量，混匀，制粒，制成1000g，分装，即得。

实施例1：

一种桃仁配方颗粒中d-苦杏仁苷的含量测定方法，包括以下步骤：

(1)色谱条件与系统适应性试验：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b，按下表规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4ml；柱温为20℃；检测波长为210nm；理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于25000；

(2)对照品溶液的制备：取d-苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

(3)供试品溶液制备：取桃仁配方颗粒，研细，取0.1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，功率为250w，频率为40khz，取出，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，即得；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

方法学考察：

1.色谱条件的确定

要实现桃仁配方颗粒中d-苦杏仁苷与l-苦杏仁苷两种顺反异构体的分离，流动相及洗脱条件的选择是关键技术。

本发明流动相及洗脱条件的选择采用如下方法进行比较：

(1)梯度初始条件：

梯度方法1：以acquityhsst3色谱柱，以乙腈为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b，按下表1梯度进行洗脱，检测波长为210nm，进样量为1μl，柱温20℃。

表1梯度方法1

实验结果显示，按上述条件进样测定，桃仁配方颗粒各色谱峰整体分布较为均匀，但是分离度较差，色谱峰堆叠，因此可在此色谱条件的基础上进行优化。

(2)梯度优化

在研究过程中发现，d-苦杏仁苷与l-苦杏仁苷两种顺反异构体在柱温为20℃时能达到较为良好的分离效果，因此在梯度优化过程中应将柱温控制在20℃。

梯度方法2：以乙腈为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b，以acquityhsst3色谱柱，按下表梯度进行洗脱，检测波长为210nm，进样量为1μl，柱温20℃。

表2梯度方法2

实验结果显示：按上述梯度优化后色谱峰的分离效果明显优于初始色谱条件，但是运行时间略长。

梯度方法3：以乙腈为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b，以acquityhsst3色谱柱，按表3梯度进行洗脱，检测波长为210nm，进样量为1μl，柱温20℃。

表3梯度方法3

实验结果显示：在当前色谱条件下，桃仁配方颗粒各色谱峰分离较好，整体分布均匀，运行时间较短，且梯度变化点少，色谱条件较为精简，因此，选择此梯度方法3为含量测定的梯度洗脱条件。

(3)酸种类筛选

以乙腈为流动相a，分别以0.1％磷酸溶液、0.05％磷酸溶液、0.5％冰醋酸溶液为流动相b，以acquityhsst3色谱柱，按表3规定进行梯度洗脱，检测波长为210nm，进样量为1μl，柱温20℃。

实验结果显示：0.05％磷酸溶液与0.1％磷酸溶液为流动相时，色谱峰分离效果均优于0.5％冰醋酸溶液，但是0.1％磷酸溶液对图3中标识部分色谱峰的分离效果优于0.05％磷酸溶液，因此最终确定以0.1％磷酸溶液为流动相。

(4)最佳吸收波长的确定

采用dad检测器对样品进行全波长扫描，实验结果显示：桃仁配方颗粒的各色谱峰主要为末端吸收，在210nm处，各色谱峰响应值较高，因此波长选择210nm。

(5)色谱条件的确定

以acquityuplchsst3(2.1mm×100mm，1.6μm)色谱柱；进样量：1μl；柱温：20℃；检测波长：210nm；以乙腈为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b，按表4梯度进行洗脱；流速：0.4ml/min。

表4梯度洗脱表

2.供试品溶液制备方法考察

(1)提取溶剂的考察

取桃仁配方颗粒适量，研细，取约0.1g，精密称定，平行5份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、70％甲醇、50％甲醇、乙醇、70％乙醇各50ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。实验结果见表5。

表5桃仁配方颗粒含量测定不同提取溶剂考察

实验结果表明：70％甲醇提取效率最大，故选70％甲醇作为桃仁配方颗粒含量测定的提取溶剂。

(2)提取方式的考察

取桃仁配方颗粒适量，研细，取约0.1g，精密称定，平行2份，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，分别超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟、加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。实验结果见表6。

表6不同提取方式桃仁配方颗粒峰苦杏仁苷测定结果

实验结果表明：超声提取与回流提取对桃仁配方颗粒苦杏仁苷含量测定结果影响不大，从能耗与实验操作简便考虑，选择超声提取作为桃仁配方颗粒苦杏仁苷含量测定的提取方式。

(3)提取时间的考察

取桃仁配方颗粒适量，研细，取约0.1g，精密称定，平行3份，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，分别超声处理(功率250w，频率40khz)15分钟、30分钟、45分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

实验结果见表7。

表7桃仁配方颗粒含量测定不同提取时间考察

实验结果表明：不同提取时间对桃仁配方颗粒中苦杏仁苷的含量影响不大，30分钟已能提取完全，为了保证方法的耐用性，选择30分钟作为桃仁配方颗粒苦杏仁苷含量测定的提取时间。

(4)供试品溶液制备方法的确定

综上所述，最终确定供试品溶液的制备方法为：取本品适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.方法学验证

(1)专属性考察

桃仁配方颗粒中所添加的辅料为麦芽糊精和二氧化硅。本次实验考察缺桃仁的阴性样品对桃仁配方颗粒特征图谱的影响。取缺桃仁的阴性样品按供试品制备方法制备阴性样品溶液。取供试品溶液、阴性溶液与苦杏仁苷对照品溶液注入液相色谱仪，进样测定，结果见表8。实验结果表明阴性色谱图中在与苦杏仁苷相应的保留时间没有色谱峰，说明辅料及溶剂对苦杏仁苷的测定无干扰，以本法测定桃仁配方颗粒中苦杏仁苷的含量具有专属性，5号峰d-苦杏仁苷色谱峰与4号色谱峰分离度大于1.5，符合规定。

表8桃仁配方颗粒专属性考察结果

(2)峰纯度考察

取桃仁配方颗粒供试品溶液、苦杏仁苷对照品溶液各1μl，注入液相色谱仪，以dad检测器进行190～400nm扫描检测，计算峰纯度。实验结果表明，样品中d-苦杏仁苷峰未检测到杂质峰，纯度角小于纯度阈值，说明在该色谱条件下，d-苦杏仁苷峰纯度符合要求。

(3)线性关系考察

精密称取d-苦杏仁苷对照品8.995mg，置20ml容量瓶中，加70％甲醇溶解，并稀释至刻度，制成每1ml含407.92μg的对照品溶液。

精密吸取对照品溶液4ml、3ml、3ml、2ml、1ml，分别置5ml、5ml、10ml、25ml、100ml的容量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，制成每1ml分别含d-苦杏仁苷326.34μg、244.75μg、122.38μg、32.63μg、4.08μg的对照品溶液。分别精密吸取上述6个不同浓度的对照品溶液1μl进样，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标(y)，对照品浓度为横坐标(x)，并绘制标准曲线，见表9，图4。

表9d-苦杏仁苷线性考察结果

由结果发现，d-苦杏仁苷的回归方程为：y＝0.0378x-0.0123，r＝1.0000，其相关系数r＝0.9998，表明d-苦杏仁苷在进样浓度4.08～407.92μg/ml的范围内进样质量与峰面积线性关系良好。

(4)精密度考察

精密吸取浓度为97.6976μg/ml的对照品溶液，重复进样6次，以d-苦杏仁苷峰面积计算，测定结果见表10。

表10精密度考察结果

结果显示d-苦杏仁苷峰面积的rsd为0.92％，说明仪器精密度良好。

(5)稳定性考察

取桃仁配方颗粒适量，研细，取约0.1g，精密称定，按照制备供试品方法制备，进样测定，分别在0、2、5、9、12、14小时进样，测定供试品溶液中d-苦杏仁苷的峰面积，计算峰面积rsd，测定结果见表11。

表11稳定性考察结果

结果显示14小时内d-苦杏仁苷峰面积的rsd小于3％，说明供试品溶液在14小时内稳定可测。

(6)重复性考察

取桃仁配方颗粒适量，研细，取约0.1g，精密称定，平行6份，按照供试品制备方法制备供试品溶液，进样测定供试品溶液中d-苦杏仁苷的峰面积，计算含量rsd，测定结果见表12。

表12重复性考察结果

实验结果显示d-苦杏仁苷含量的rsd<2％，表明该分析方法的重复性良好。

(7)中间精密度考察

选择不同的测定时间、不同的高效液相色谱仪、不同实验人员(人员2)，取桃仁配方颗粒适量，研细，取约0.1g(共6份)，精密称定，制备供试品溶液。按照供试品制备方法制备供试品溶液，分别进样测定供试品溶液中d-苦杏仁苷含量，与重复性项下结果比较，见表13。

表13桃仁配方颗粒d-苦杏仁苷含量测定中间精密度结果

实验结果表明，不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，d-苦杏仁苷含量

rsd<2.0％，该分析方法中间精密度较好。

(8)准确度试验

精密称取d-苦杏仁苷28.415mg(含量90.7％)，置20ml容量瓶中，加70％甲醇溶解，制成每1ml含1.289μg的对照品溶液。

分别按对照品加入量与待测成分含量之比分别为1.5：1，1：1，0.5:1设计高、中、低三组实验，每组平行3份。取具塞锥形瓶3组，每组平行3份，分别精密加入d-苦杏仁苷对照品贮备液1ml、2ml、3ml置具塞锥形瓶中，置氮吹仪下挥干溶剂，再分别称取桃仁配方颗粒0.05g，精密称定，按d-苦杏仁苷含量测定测定方法制备9份供试品溶液，进样测定，根据重复性考察结果中d-苦杏仁苷含量为51.53mg/g计算准确度，结果见表14。

表14桃仁配方颗粒含量测定加样回收率结果

结果显示，苦杏仁苷的加样回收率范围为97.95～103.95％，平均加样回收率为100.57％，rsd＝1.65％，说明该方法准确度良好。

(9)耐用性考察

①不同色谱柱考察

比较不同色谱柱对桃仁配方颗粒d-苦杏仁苷含量的影响，本次考察了3种色谱柱，分别是acquityhsst3(2.1mm×100mm，1.8μm，编号：bh045)、acquityhsst3(2.1mm×100mm，1.8μm，编号：bh046)、ymctriartc18(2.1mm×100mm，1.9μm，编号：bh028)。

取桃仁配方颗粒适量，研细，取约0.1g，精密称定，按照供试品溶液制备方法制备，进样测定，实验结果见表15。

表15桃仁配方颗粒含量测定不同色谱柱耐用性考察结果

实验结果：比较不同色谱柱的分离效果及含量值，各色谱柱分离效果良好，含量rsd为1.96％，表明该分析方法在不同色谱柱下分析耐用性良好。

②不同柱温考察

比较15℃、20℃、25℃不同柱温对桃仁配方颗粒d-苦杏仁苷含量测定的影响。

取桃仁配方颗粒适量，研细，取约0.1g，精密称定，按照供试品溶液制备方法制备，进样测定不同柱温下d-苦杏仁苷含量，实验结果见表16。

表16桃仁配方颗粒含量测定不同柱温耐用性考察结果

实验结果：比较三种不同柱温(±5℃)的桃仁配方颗粒的含量值，含量rsd为2.44％，表明该分析方法在柱温±5℃范围内耐用性良好。

③不同流速考察

比较0.40ml/min、0.35ml/min、0.45ml/min不同流速对桃仁配方颗粒d-苦杏仁苷含量测定的影响。

取桃仁配方颗粒适量，研细，取约0.1g，精密称定，按照供试品溶液制备方法制备样品，进样测定不同流速下苦杏仁苷含量，实验结果见表17。

表17桃仁配方颗粒含量测定不同流速耐用性考察结果

实验结果：比较三种不同流速(±0.05ml/min)的桃仁配方颗粒的含量值，含量rsd为1.06％，表明该分析方法在流速±0.05ml/min范围内耐用性良好。

实施例2不同批号的桃仁配方颗粒的含量测定

取不同批号的桃仁配方颗粒，按照上述含量测定方法进行测定，测定其结果见表18。

表1815批桃仁配方颗粒d-苦杏仁苷含量测定结果