一种基于G-四联体DNA的Pb2+荧光传感检测方法与流程

本发明属于荧光检测技术领域，具体涉及一种基于g-四联体dna的pb²⁺荧光生物传感检测方法。

背景技术：

环境体系中的重金属是一类重要的污染物，具有难降解、毒性强、生物累积性等特点，严重威胁生态环境和人体健康，如pb²⁺会导致严重的神经疾病，如记忆力减退、易怒、贫血、智力低下等，尤其对儿童的健康影响很大。因此实现对重金属离子的快速、简单、灵敏检测，在环境评价、食品监测和临床毒理学研究方面均具有重要意义。传统的重金属离子分析方法主要是采用原子发射光谱法、原子荧光光谱法、icp-aes/ms等，这些仪器方法具有检测费用高、操作复杂、难于实现野外环境体系中的在线分析等缺点。

随着生物传感技术的发展，应用生物传感法对环境重金属离子的检测已成为研究热点之一，诸多优势使得生物传感器作为一种新型的检测技术用于环境监测领域。特别是随着对dna与金属离子作用的深入研究，功能性dna成为检测pb²⁺的一个强有力的工具，dna生物传感器越来越多的应用于pb²⁺的检测。

技术实现要素：

本发明研究发现，ru(bpy)2(dppz)²⁺可以与pb²⁺稳定的g-四链体dna发生作用，作用后荧光信号显著增强。本发明以ru(bpy)2(dppz)²⁺为荧光信号探针，设计了一种基于pb²⁺诱导富g碱基单链dna形成g-四联体构型变化的检测pb²⁺荧光生物传感方法。该方法具有快速、简单、灵敏、高选择性的优点。这在完善目前现有pb²⁺检测技术方面具有指导意义，同时作为一种新的检测方法在环境监测领域有着广阔的应用前景。

本发明首先提供g-四联体dna在pb²⁺荧光传感检测中的应用。

本发明还提供g-四联体dna、ru(bpy)2(dppz)²⁺共存体系为荧光信号探针在pb²⁺荧光传感检测中的应用。

本发明是基于所述g-四联体dna能够和pb²⁺发生作用形成g-四联体dna结构，该g-四联体dna结构进一步与荧光信号分子ru(bpy)2(dppz)²⁺发生作用，产生较强的荧光信号的原理，实现了对pb²⁺的荧光法检测的。

本发明还提供一种基于g-四联体dna的pb²⁺荧光传感检测方法，包括：

1)利用标准浓度的pb²⁺制备pb²⁺、g-四联体dna、ru(bpy)2(dppz)²⁺共存体系，进行荧光信号检测，构建pb²⁺浓度与荧光信号强度响应的标准曲线；

2)制备待测样品、g-四联体dna、ru(bpy)2(dppz)²⁺共存体系，进行荧光信号检测，获得荧光信号强度；

3)根据测得的荧光信号强度以及所述标准曲线，得出待测样品中的pb²⁺浓度。

进一步地，制备步骤1)、2)所述共存体系所用缓冲液由kh2po4，k2hpo4、磷酸、nahco3、na2co3、naoh、tris、hclo4、hcl、柠檬酸、柠檬酸钠中的二种或三种配制而得，优选所用缓冲液为20mmtris-hclo4缓冲溶液，ph为7.4。

进一步地，步骤1)、2)所述共存体系的ph为6.0-11.0。

进一步地，步骤1)、2)所述共存体系中，g-四联体dna浓度为0.1-100μm，ru(bpy)2(dppz)²⁺浓度为0.1-200μm；优选地，g-四联体dna与ru(bpy)2(dppz)²⁺的摩尔浓度比为1:0.1-10，更优选为1:1。

进一步地，孵育步骤1)、2)所述共存体系的时间为1-10min。

具体地，步骤2)包括以下步骤：

a)将g-四联体dna用适量20mmtris-hclo4缓冲液(ph7.4)溶解，混匀，置于70-90℃的水浴锅中加热活化处理1-10min，自然冷却至室温，备用；

b)取适量步骤a)配制的g-四联体dna溶液加到冻存管中，并用20mmtris-hclo4缓冲液(ph7.4)稀释到一定浓度，向其中加入一定量的待测样品，混匀，室温下孵育1-4h，备用；

c)取适量ru(bpy)2(dppz)²⁺溶液，加入步骤b)配制的待测样品、g-四联体dna、ru(bpy)2(dppz)²⁺共存体系中，混匀，共孵育1-10min；进行荧光信号检测，获得荧光信号强度。

可参照上述步骤2)方法制备上述标准曲线。

本发明所述g-四联体dna为单链dna，其序列如seqidno.1、2、3或4所示，优选为seqidno.1。

本发明所述ru(bpy)2(dppz)²⁺是指2,2′-联吡啶二吡啶并[3,2-a:2′,3′-c]吩嗪钌，其中ru为钌，bpy为2,2′-联吡啶，dppz为二吡啶并[3,2-a:2′,3′-c]吩嗪。该配合物可市售购得，或按现有技术方法制备。

本发明具有以下优点：

1)本发明所采用的检测pb²⁺的荧光传感器制备成本低、实验周期短、可靠性高；

2)本发明所采用的检测pb²⁺的荧光传感器检测pb²⁺时操作简单、响应速度快；

3)本发明所采用的检测pb²⁺的荧光传感器对pb²⁺具有较高的灵敏性、选择性。

本发明提出一种基于荧光传感器的pb²⁺测定方法，建立、完善和发展了pb²⁺污染物的生物传感分析方法，不仅可为环境健康风险评价提供参考，同时开发一种新的快速、高灵敏、低成本的检测方法，对完善现有检测技术手段具有重要意义和较好的应用价值。本发明建立了一种基于g-四链体dna与ru(bpy)2(dppz)²⁺荧光信号探针体系检测pb²⁺污染物的荧光方法，该荧光法具有制备简单、检测快速、成本低、样品用量少、灵敏性高等优点，为环境体系pb²⁺污染物的快速检测提供了一种新的检测方法，这在完善现有pb²⁺污染物检测技术方面具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施实例2中不同体系测定的荧光光谱

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。

以下实施例荧光测定条件：激发光波长为445nm，扫描范围为525-750nm，数据点采集间隔1nm，激发和发射狭缝均为5nm。

以下实施例g-四联体dna溶液的具体配制方法：将固体g-四联体dna粉末用适量20mmtris-hclo4缓冲液(ph7.4)溶解，用漩涡振荡器混匀，并置于70-90℃的水浴锅中加热活化处理1-10min，然后自然冷却至室温，备用。

实施例1

用tris-hclo4(ph＝7.4,20mm)分别配制浓度5μm的seqidno.1、2、3、4所示g-四联体dna溶液，然后分别将5μm的pb²⁺加入上述dna溶液中，用漩涡振荡器混匀，室温下孵育2h后，加入终浓度为5μmru(bpy)2(dppz)²⁺的溶液，用漩涡振荡器混匀，共孵育5min后进行荧光测定。各混合体系测定的荧光信号i见表1。

表1不同dna序列检测体系产生的荧光信号

结果表明，seqidno.1所示g-四联体dna荧光信号强度最强。

以下实施例2-4均采用seqidno.1所示g-四联体dna。

实施例2

用tris-hclo4(ph＝7.4,20mm)配制浓度为20μm的g-四联体dna溶液，然后将10μmpb²⁺加入上述dna溶液中，用漩涡振荡器混匀，室温下孵育2h后，加入终浓度为20μmru(bpy)2(dppz)²⁺的溶液，用漩涡振荡器混匀，共孵育5min后进行荧光测定。

按同样的方法配制不含pb²⁺的混合溶液，进行荧光测定。

结果见图1。图1中，a代表含有20μmg-四联体dna、20μmru(bpy)2(dppz)²⁺的共存体系的荧光光谱图；b代表含有20μmg-四联体dna、10μmpb²⁺、20μmru(bpy)2(dppz)²⁺的共存体系的荧光光谱图。

实施例3

用tris-hclo4(ph＝7.4,20mm)配制浓度为10μm的g-四联体dna溶液，然后将不同浓度的pb²⁺加入上述dna溶液中，用漩涡振荡器混匀，室温下孵育2h后，加入终浓度为10μmru(bpy)2(dppz)²⁺的溶液，用漩涡振荡器混匀，共孵育5min后进行荧光测定。含不同浓度pb²⁺的上述混合体系测定的荧光信号变化δi见表2。

表2不同浓度pb²⁺产生的荧光信号变化

结果表明，pb²⁺的荧光信号强度随着pb²⁺的浓度升高而增强，二者呈线性相关。

实施例4其它重金属离子的检测

用tris-hclo4(ph＝7.4,20mm)配制浓度为10μm的g-四联体dna溶液，然后将100nm的hg²⁺、mg²⁺、cu²⁺、fe²⁺、pb²⁺、分别加入上述dna溶液中，用漩涡振荡器混匀，室温下孵育2h后，加入终浓度为10μmru(bpy)2(dppz)²⁺的溶液，用漩涡振荡器混匀，共孵育5min后进行荧光测定。含不同浓度重金属离子的混合体系测定荧光信号变化δi见表3。

表3不同重金属离子产生的荧光信号变化

结果表明，在相同的检测条件下，pb²⁺的荧光信号强度最强。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京农业质量标准与检测技术研究中心

<120>一种基于g-四联体dna的pb2+荧光传感检测方法

<130>khp181117611.7

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gggttagggttagggttaggg21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tttggttggtgtggttggttt21

<210>3

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gggtagggcgggttggg17

<210>4

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gggtgggtgggtgggt16