烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法与流程

本发明涉及一种烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法。

背景技术：

鸡肉是被人们广泛接受的高营养价值的食品之一，作为蛋白质的极好来源，鸡肉脂质中不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例较高，并提供人体必需的维生素和矿物质，在美国，每年人均鸡肉消费量超过40公斤，其中烤鸡胸肉因其美味和口感而成为一种受世界各地欢迎的肉类产品，近些年，关于在含有美拉德反应产物的日常食品中存在荧光碳点的报道越来越多，由于与高温加工相关的潜在健康风险，关于内源性荧光碳点的细胞毒性，生物分布等研究引起了公众的关注；多巴胺（dopamine）是下丘脑和脑垂体腺中的一种关键神经递质，其是用来帮助细胞传送脉冲的化学物质，这种脑内分泌物负责传递兴奋及开心的信息，其与人类的情欲、感觉相关，人血清白蛋白（hsa）是人血浆中含量最丰富的蛋白质，具有复杂的化学特性和一系列功能基团，在体液中其可以起到运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等作用，同时可以维持血液正常的渗透压，以上两种物质都是体内含有的大分子物质，都具有重要的生理作用，如果荧光碳点与体内的大分子产生一定的相互作用，势必会对人体的健康产生一定的影响，此荧光碳点来自于日常人们食用的食物，具有食用人群基数大，食用量多等特点，因此，对于这类荧光碳点的安全性应该更加全面的考量，目前尚无关于天然食物中提取出的内源性荧光碳点的潜在风险评估的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法，包括以下步骤：

a、将不同烤制温度的鸡肉内源性荧光碳点溶液与细胞共孵育并进行四氮唑蓝测试，检测细胞吸光度的变化判断荧光碳点对细胞存活和生长的影响，并通过激光共聚焦在波长激发下检测荧光碳点在细胞中的分布情况；

b、配置一定浓度的荧光碳点溶液与对照组溶液，灌喂给小鼠处死小鼠，检测荧光碳点在小鼠体内的生物分布情况；

c、配置不同摩尔比例的荧光碳点与人血清白蛋白的混合溶液，检测各溶液在波长激发光谱下的荧光强度，建立线性关系判断荧光碳点与人血清白蛋白的相互作用，运用量热技术辅助检测相互作用的热力学常数；

d、将荧光碳点与多巴胺溶液按摩尔比1:1-1:10混合，经提纯提取到复合溶液，通过荧光变化检测荧光碳点对多巴胺的影响情况。

所述步骤a中四氮唑蓝测试的方法为，在37^oc，80-95％湿度和2-10％co2的条件下，将hepg2细胞在含有5-10％胎牛血清的培养基中培养，将荧光碳点溶液与细胞分别温育12-24小时，加入四氮唑蓝溶液后进一步孵育3-6小时，除去上清液并溶解在二甲基亚砜中，然后测量560-575nm处吸光度。

所述步骤a中将150-350^oc烤制温度的鸡肉内源性荧光碳点溶液与细胞共孵育并进行四氮唑蓝测试，在405-750nm波长激发下检测荧光碳点在细胞中的分布情况。

所述步骤b中荧光碳点溶液的配置方法为，加入碳点的量按小鼠体重称量，一次0.1-4g/kg的剂量，对照组溶液的配置方法为，加入0.1-1％的nacl溶液。

所述步骤c中荧光碳点与人血清白蛋白的摩尔比例为1:20-1:200，检测各溶液在270-295nm波长激发光谱下的荧光强度。

所述步骤d中将荧光碳点与多巴胺溶液按摩尔比1:1-1:10混合，经0.22μm膜过滤的提纯方法提取到复合溶液。

所述步骤d中复合溶液的配置方法为，用碱性缓冲液将溶液调节至ph7-10，然后将混合溶液在室温下剧烈搅拌12-36小时，加入异丙醇以终止反应。

本发明一种烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法，针对荧光碳点的安全性评估，通过细胞毒性、生物分布、与体内大分子物质（多巴胺、人血清白蛋白）的相互作用检测等多种方式对荧光碳点的安全性进行综合性的评估，该方法检测的荧光碳点来自于日常人们食用的食物，具有食用人群基数大，食用量多等特点，目前对于内源性荧光碳点的危害性尚无定论，此方法采用多样的检测方法，具有较完善的评估体系，该方法针对内源性荧光碳点的多种生物特性进行分析，有助于判断这类食源性碳点的安全性，也有利于分析其在生化传感、药物载体、成像分析等领域应用的风险。

附图说明

图1是本发明一种烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法三种不同类型不同浓度的内源性荧光碳点对hepg2细胞的细胞毒性图。

图2是本发明一种烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法的荧光碳点的细胞分布图。

图3是本发明一种烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法的荧光碳点在小鼠主要器官内的生物分布图。

图4是本发明一种烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法的荧光碳点的一个实例中人血清白蛋白与荧光碳点反应后在280nm激发波长下的荧光光谱图。

图5是本发明一种烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法的荧光碳点的一个实例中人血清白蛋白浓度与荧光碳点反应的线性曲线。

图6是本发明一种烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法的一个实例中荧光碳点与hsa反应的itc检测结果。

图7是本发明一种烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法的一个实例中荧光碳点与hsa反应的热量与摩尔比的值，实线是拟合曲线。

图8是本发明一种烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法的一个实例中荧光碳点的紫外和荧光光谱图。

图9是本发明一种烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法的一个实例中荧光碳点与多巴胺混合物fcs-1的荧光光谱图。

图10是本发明一种烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法的一个实例中荧光碳点与多巴胺混合物fcs-2的荧光光谱图。

图11是本发明一种烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法的一个实例中多巴胺聚合物的荧光光谱图。

具体实施方式

烤鸡肉内源性荧光碳点的潜在风险评估方法，具体步骤为：a、将不同烤制温度（150-350^oc）的鸡肉内源性荧光碳点溶液（荧光量子产率0.2-90%，尺寸0.5-100nm）与细胞共孵育并进行四氮唑蓝（mtt）测试，检测细胞吸光度的变化来判断荧光碳点对细胞存活和生长的影响，并通过激光共聚焦在405-750nm激发下检测荧光碳点在细胞中的分布情况，四氮唑蓝（mtt）测试的方法为，在37^oc，80-95％湿度和2-10％co2的条件下将hepg2细胞在含有5-10％胎牛血清（fbs）的培养基中培养，将荧光碳点溶液与细胞分别温育12-24小时（每孔5×10⁴-1×10⁶个细胞），加入四氮唑蓝（mtt）溶液后进一步孵育3-6小时，除去上清液并溶解在二甲基亚砜中，然后测量560-575nm处吸光度；b、配置一定浓度的荧光碳点溶液与对照组溶液，将其灌胃给小鼠(10-2000mg/kg体重),并在0-24小时后处死小鼠，检测荧光碳点在小鼠体内的生物分布情况，荧光碳点溶液的配置方法为，加入碳点的量按小鼠体重称量，一次1-4g/kg的剂量，对照组溶液的配置方法为，加入0.1-1％的nacl溶液，检测荧光碳点在小鼠体内的生物分布情况的方法为，收集小鼠的主要器官/组织，包括肠，胃，脑，肺，肝，肾，心脏，脾和睾丸；c、配置不同摩尔比例的荧光碳点与人血清白蛋白（1:20-1:200）的混合溶液，检测各溶液在270-295nm激发光谱下的荧光强度，根据斯特恩-沃尔默方程建立线性关系判断荧光碳点与人血清白蛋白的相互作用，运用量热技术辅助检测相互作用的热力学常数，热力学变化检测的方法为：使用等温滴定量热仪检测反应的焓变、熵变、结合常数等；d、将荧光碳点与多巴胺溶液按摩尔比1:1-1:10混合，经0.22μm膜过滤等提纯方法提取到复合溶液，通过荧光变化检测荧光碳点是否会对多巴胺具有影响，复合溶液的配置方法为，用tris-hcl等碱性缓冲液将溶液调节至ph7-10，然后将混合溶液在室温下剧烈搅拌12-36小时，加入异丙醇以终止反应。

实施例一，来自烤鸡肉的内源性荧光碳点的细胞毒性情况：关于来自烤鸡肉内源性荧光碳点的一个大问题是它们潜在的细胞毒性，在这项工作中，通过mtt测定评估荧光碳点的细胞毒性。显然，随着荧光碳点浓度从0增加到4mgml^-1，细胞存活率呈下降趋势，图1所示，这表明烤鸡肉中的荧光碳点可能会带来食品安全风险，当浓度为4mgml^-1时，对于fnd-200，fnd-250和fnd-300，烤制温度分别在200,250,300^oc的荧光碳点，相对细胞存活率分别降低15％，37％和33％，这证明烤鸡肉内源性荧光碳点具有一定的细胞毒性，重要的是，从较高温度250和300^oc烤制的鸡肉中提取的荧光碳点表现出比较低温度200^oc下的鸡肉更高的细胞毒性，这可能是由不同表面基团和不同温度下荧光碳点的碳化程度引起的；来自烤鸡肉的内源性荧光碳点的细胞分布情况：在培养24小时后，发现荧光碳点内化到活细胞中，它们分布在细胞质内，但不存在于细胞核中，图2所示。

实施例二，来自烤鸡肉的内源性荧光碳点的生物分布情况：使用balb/c小鼠作为测试模型研究了动物脑中荧光碳点的离体生物分布。在口服给药后仅2小时检测到小鼠体内荧光碳点的存在，如图3所示，在小鼠体内的胃，肠道，睾丸和脑中，荧光强度在口服摄取荧光碳点后2小时跳跃至最大水平，并随时间逐渐降低，如图3，直至其在20小时后达到对照组的水平，结果表明，荧光碳点能够通过bbb并在摄入后出现在小鼠脑中，然后通过代谢逐渐从脑中除去，在小鼠体内的肝脏，脾脏，肾脏和肺中荧光强度几乎不变，表面此荧光碳点对于肝脏，脾脏，肾脏和肺的影响不大，因此，这些食源性荧光碳点可能对消化系统以及脑部具有潜在的健康风险，可能影响正常的消化或具有神经退行性作用。

实施例三，来自烤鸡肉的内源性荧光碳点与生物大分子人血清白蛋白相互作用情况：配制一系列等体积不同浓度的标准溶液，其中，标准溶液中血清白蛋白的浓度依次为0、2×10^-5mol/l、4×10^-5mol/l、6×10^-5mol/l、8×10^-5mol/l，其编号分别为a、b、c、d、e标准溶液中荧光碳点的浓度为0.1mg/ml；用荧光分光光度计在280nm的激发波长下，分别检测上述标准溶液的荧光强度，得到如图4所示的荧光光谱图，从荧光光谱图上读出不同浓度的血清白蛋白的标准溶液所对应的荧光强度值，以荧光光谱图中血清白蛋白浓度为零的空白荧光碳点标准溶液的荧光强度与不同浓度的血清蛋白标准溶液的荧光强度的差值为纵坐标，以标准溶液中血清蛋白的浓度为横坐标，绘制如图5所示的标准曲线，得出线性方程y＝1.964x+1.960，r²＝0.995，由此线性关系符合斯特恩-沃尔莫方程，证明来自烤鸡肉的内源性荧光碳点与生物大分子人血清白蛋白存在相互作用，图6显示了在环境温度下用荧光碳点滴定hsa的量热曲线，可以看出，用缓冲液与荧光碳点滴定时二者的正加热速率保持不变，而添加hsa后荧光碳点的加热速率先增加后不断下降，在校正用于稀释的热变化之后，每分子荧光碳点的热变化与每次注射时的摩尔比（fnds/hsa）显示在图7中，使用独立的位点结合模型确定热力学参数，并将拟合的参数总结在表1中。荧光碳点和hsa之间的解离常数（kd）估计为1.29±0.52×10^-4lmol，缔合常数（ka）在298k时为7.73×10³moll^-1，这与先前报道的不同荧光碳点-蛋白质复合物的值相似，实验证明荧光纳米粒子与人血清白蛋白具有一定的相互作用，在人体中可能对血容量及血压等方面产生一定的影响。

实施例四，来自烤鸡肉的内源性荧光碳点与生物大分子多巴胺相互作用情况：通过荧光光谱研究荧光碳点与da之间的相互作用，将2.5ml的荧光碳点（20mgml^-1）加入2.5ml的2，4mgml^-1da溶液中，分别命名为fcs-1和fcs-2，用tris-hcl缓冲液将溶液调节至ph8.5，混合物的颜色从黄色变为棕色，然后将混合溶液在室温下剧烈搅拌36小时以确保反应完成，并加入25ml异丙醇以终止反应，将水相进一步通过0.22μm膜过滤以除去沉淀物，为了区分荧光碳点的荧光，合成荧光缀合物（pda-fnd），并使用自聚多巴胺（pda）作为对照，对于荧光结合物fcs，荧光碳点的最大发射波长为455nm，如图8，随着da的增加，fcs-1和fcs-2和聚多巴胺荧光缀合物（pda-fc）的最大发射波长变为475nm，如图9，485nm，如图10和503nm，如图11，荧光碳点的发射波长的红移表现出da剂量依赖性行为并且清楚地证明了在向fnd添加da之后发生反应，当激发从340nm变为420nm时，fcs-1的发射峰从469移位到511nm，而fcs-2的发射峰从484移位到514nm，而fnd-250的发射峰移位从424到480nm的56nm，fnd-250，fcs-1和fcs-2的最大激发波长显示了发射波长的偏移，红移现象归因于da与fnd的表面官能团的相互作用，引起表面结构的变化，实验证明荧光纳米粒子与da有一定的相互作用，在人体中可能对神经系统等方面产生一定的影响。