本发明涉及试剂盒技术领域，具体涉及一种额颞叶痴呆试剂盒。
背景技术：
额颞叶痴呆是指中老年患者缓慢出现人格改变、言语障碍及行为异常的痴呆综合征，主要表现为局限性脑萎缩，患者全脑重量减轻，大部分在1000-1250g之间。萎缩主要位于大脑半球内，包括大部分的额叶、颞叶和岛叶区域、顶叶前部，有时形成“刀切样”萎缩。额颞叶痴呆发病隐匿，病因及发病机制尚不完全明确；鉴定患者是否患有额颞叶痴呆时，不仅需要ct、mri来鉴别，还需要临床确诊需组织病理学检查，十分繁琐；并且目前尚无有限的预防方法。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种额颞叶痴呆试剂盒，该试剂盒通过简单的体外检测以诊断受检者是否患有额颞叶痴呆症，多种标志物同时检测比较，提高诊断准确率，尤其是适于早期筛查。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种额颞叶痴呆试剂盒，所述试剂盒内设有一种或者多组平行设置的检测板，每一所述检测板上设有多个检测区，所述检测区包括如下生物标志物的蛋白或其所对应的受体蛋白或特异抗体组合，所述的生物标志物是tau、pick、tdp-43，ncls，nlls和gcls；所述tau包括所有tau异构体的中任何一种tau；所述检测板为一酶标盘，所述的生物标志物的蛋白或其所对应的受体蛋白或特异抗体组合被直接或间接地包设于所述检测区内。
在本发明中，优选的，所述的生物标志物的蛋白或其所对应的受体蛋白或特异抗体组合，是预先固定在检测板的检测区内。
在本发明中，优选的，所述的生物标志物的蛋白或其所对应的受体蛋白或特异抗体组合，是在使用时加入到检测板的检测区内。
在本发明中，优选的，所述的生物标志物的蛋白或其所对应的受体蛋白或特异抗体组合被包含在同一个或不同的检测板的不同的检测区。
在本发明中，优选的，所述的生物标志物的蛋白包括其完整的蛋白或蛋白片段或含有个别氨基酸变异或缺失的该类生物标志物蛋白，或仅含该类生物标志物部分氨基酸序列的偶联蛋白。
在本发明中，优选的，所述tau蛋白为通过选择性剪切其外显子10产生的tau蛋白异构体。
在本发明中，优选的，所述tau蛋白为通过选择性剪切其外显子2、外显子3和外显子10产生的tau蛋白异构体。
tau是一种微管相关磷酸化蛋白(map)，在中枢神经及周围神经系统中都有广泛的表达；正常tau蛋白的主要功能一是促进微管的形成，二是保持微管的稳定性，在维持神经元细胞骨架完整与抽浆运输中起到重要作用。tau蛋白基因位于17染色体长臂。所述tau蛋白为通过选择性剪切其外显子10可产生3个(外显子10缺失)或4个(外显子10存在)的tau蛋白异构体；而，所述tau蛋白为通过选择性剪切其外显子2、外显子3和外显子10产生6种不同的tau蛋白异构体。研究表明，多个染色体显性遗传的ftd家系与17q21-22连锁，并具有相似的临床、神经病理及遗传特点，被称为ftdp-17。在ftdp-17病人的第17号染色体上已发现tau基因编码区和内含子的多个错义和缺失突变，导致tau功能改变、过渡磷酸化，不溶性tau在脑组织中聚集，微管系统破坏，神经细胞变性、脱失而引起了额颞叶痴呆和帕金森综合征变现。
进一步的，所述额颞叶呆症体外检测试剂盒的检测方法，包括但不限于：基于抗原-抗体反应或受体蛋白-配体反应原理，使用包括竞争酶联免疫吸收或双抗夹心酶联免疫吸收等技术来测定人的血液或脑脊液或淋巴液或组织切片或尿液或其它体液中多种生物标志物含量，进而来判定既得或潜在的额颞叶呆症相关的疾病。
本发明的有益效果是：通过简单的体外检测，如人的血液或脑脊液或淋巴液或组织切片或尿液或其它体液，然后在体外对受检者试验液中与额颞叶呆症相关的多种生物标志物进行检测分析，以诊断受检者是否患有额颞叶痴呆症，体外检测、安全、检测成本低、多标志同时检测比较，提高诊断准确率、尤其是适于早期筛查。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合实施例，进一步阐述本发明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本实施方式提供一种额颞叶痴呆试剂盒，所述试剂盒内设有一种或者多组平行设置的检测板，每一所述检测板上设有多个检测区，所述检测区包括如下生物标志物的蛋白或其所对应的受体蛋白或特异抗体组合，所述的生物标志物是tau、pick、tdp-43，ncls，nlls和gcls；所述tau包括所有tau异构体的中任何一种tau；所述检测板为一酶标盘，所述的生物标志物的蛋白或其所对应的受体蛋白或特异抗体组合被直接或间接地包设于所述检测区内。
在本实施方式中，所述的生物标志物的蛋白或其所对应的受体蛋白或特异抗体组合，是预先固定在检测板的检测区内。
在本实施方式中，所述的生物标志物的蛋白或其所对应的受体蛋白或特异抗体组合，是在使用时加入到检测板的检测区内。
在本实施方式中，所述的生物标志物的蛋白或其所对应的受体蛋白或特异抗体组合被包含在同一个或不同的检测板的不同的检测区。
在本实施方式中，所述的生物标志物的蛋白包括其完整的蛋白或蛋白片段或含有个别氨基酸变异或缺失的该类生物标志物蛋白，或仅含该类生物标志物部分氨基酸序列的偶联蛋白。
在本实施方式中，所述tau蛋白为通过选择性剪切其外显子10产生的tau蛋白异构体。
在本实施方式中，所述tau蛋白为通过选择性剪切其外显子2、外显子3和外显子10产生的tau蛋白异构体。
进一步的，所述额颞叶呆症体外检测试剂盒的检测方法，包括但不限于：基于抗原-抗体反应或受体蛋白-配体反应原理，使用包括竞争酶联免疫吸收或双抗夹心酶联免疫吸收等技术来测定人的血液或脑脊液或淋巴液或组织切片或尿液或其它体液中多种生物标志物含量，进而来判定既得或潜在的额颞叶呆症相关的疾病。
本发明所涉及的生物标志物:tau、pick、tdp-43，ncls，nlls和gcls均为人体生物标志物。为了避免歧义，具体定义如下：
1.tau，全名：microtubule-associatedproteintau，包括所有的tau蛋白异构体(isoforms)中任何一种tau蛋白；其基因序列号分别为isoform1：nm_016835.4，isoform2：nm_005910.5，isoform3：nm_016834.4，isoform4：nm_016841.4，isoform5：nm_001123067.3，isoform6：nm_001123066.3。
2.pick，全名：pickbody，是气球样肿胀细胞，即pick细胞胞质内存在嗜银性pick小体。
3.tdp-43，全名：hereditaryfrontotemporaldementiawithparkinsonismlinkedtochromosome，其蛋白高度保守，广泛表达，主要位于细胞核，由1号染色体上的tardbp基因编码，有414个氨基酸残基组成，分子量为43；tdp-43蛋白有两个rna识别基序和一个c末端甘氨酸富含区。
4.ncls，全名：neuronalcytoplasmicinclusions，神经元胞浆包涵体。
5.nlls全名：neuronalintranuclearinclusions，核内包涵体。
6.gcls，全名：glialcytoplasmicinclusions，胶质细胞胞浆包涵体。
下面通过实施例进行详细说明：
1.所述的生物标志物相关蛋白的抗原制备：
本发明的额颞叶呆症体外试剂盒，所述的各生物标志物的抗原可以按公知的基因重组方法或天然组织提取方法来获得。所述的各生物标志物相关蛋白抗原在用作免疫前得先纯化，然后与弗氏完全佐剂(第一次免疫)或与弗氏不完全佐剂(后续免疫)一起乳化后用于免疫接种。
本发明所述生物标志物相关抗原也可以是按所列生物标志物中的任一氨基酸序列人工合成的多肽。
本发明所述生物标志物相关抗原可以是含有上述所列氨基酸序列的整个蛋白或仅含有上述所列相关蛋白的部分氨基酸序列多肽。
本发明所述生物标志物相关抗原也可以是含有在上述所列任一氨基酸序列中引入个别氨基酸变异或缺失的序列。
上述各种生物标志物相关抗原也可以进一步与载体蛋白(比如bsa，klh)相偶联，以提高免疫原性。
本发明所述生物标志物相关抗原还可以是基于dna的疫苗，它可以在免疫动物体内按基因表达程序产生含有上述所列生物标志物相关氨基酸序列的部分或完整的蛋白。
2.本发明的生物标志物相关抗体或受体蛋白的制备：
本发明的额颞叶痴呆症体外检测试剂盒，所述的各生物标志物相关的抗体可以按公知的多克隆抗体制备方法或单克隆抗体制备方法来获得。
本发明的额颞叶痴呆症体外检测试剂盒,所述的各生物标志物相关的受体蛋白可以按公知的基因重组方法或天然组织提取方法来获得。
3.额颞叶痴呆症相关的多生物标志物筛查用检测试剂盒的制备例：
1)所述的检测试剂盒包括：检测板、示踪液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、洗涤液、显色液。
2)检测板制备：
用间接包被法固定生物标志物特异的抗体。首先，用pbs缓冲液将兔抗鼠的抗体稀释至浓度0.5ug/ml-20ug/ml，再添加100ul该抗体稀释液到96-孔酶标板的孔内，在室温下孵育2-3小时或低温(4-8℃)下孵育12小时；用pbs+0.1％吐温20的洗液冲洗酶标板孔3-5次；然后，在酶标板的孔内添加200ul的2％bsa-pbs封闭液，室温下孵育1-4小时,再用pbs+0.1％吐温20的洗液冲洗酶标板孔3-5次；
其次，用pbs缓冲液配制浓度为0.1ug/ml-10ug/ml的下述12个生物标志物特异的鼠抗体溶液，按酶标板布局表(表1)所示，在酶标板上1-12列的孔内分别添加100微升下述生物标志物特异的抗体溶液：
tau(列1)、pick(列2)、tdp-43(列3)，ncls(列4)，nlls(列5)和gcls(列6)；
在室温下孵育2-3小时(或低温(4-8℃)孵育12小时)，用pbs+0.1％吐温20洗液冲洗酶标板孔3-5次；然后，45℃下干燥，将该盘抽真空密封于铝袋内，储存在低温干燥冰箱备用。
3)阳性对照液制备：
阳性对照是用纯化的并经准确定量过的各生物标志物按临床诊断要求的检出界限浓度制备(各生物标志物阳性对照浓度不尽相同)。为示例方便，本实施例仅以100pg/ml(并非临床诊断要求的检出界限浓度)做示范，配置2倍的工作浓度。将各个生物标志物：tau、pick、tdp-43，ncls，nlls和gcls溶解于含1％bsa的pbs溶液里配成100pg/ml浓度的阳性对照，分装、低温储存备用。
4)阴性对照液：
定量用：阴性对照液是含1％bsa的pbs溶液；低温储存备用。
定性用：将年轻(18-28岁)正常人血清溶解于含1％bsa的pbs溶液里配成等同于定性检测时的样品血清浓度，比如：10％，低温储存备用。
5)样品稀释液：
样品稀释液是含1％bsa的pbs溶液；制备：将1克bsa蛋白溶解于100毫升pbs缓冲液，低温储存备用。
6)示踪剂：
示踪剂是标记分子与纯化的生物标志物共价偶联物，如:hrp-tau。所述的标记分子是常用的过氧化氢酶(hrp)，也可以是碱性磷酸酶(ap)或荧光分子、量子点等；示踪剂可以按公知的方法制备。比如通过edc介导羧基与胺基反应来获得；将各示踪剂分别溶解于含1％bsa的pbs溶液里配成每毫升0.3微克的浓度，备用。
7)洗涤液：
将1克吐温20(tween20)溶解于1升的pbs溶液配成0.1％的浓度，备用。
8)显色液：
常用显色液有两种，其一是：过氧化氢酶用显色底物溶液:将tmb(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)以0.2mg/ml的浓度溶于10mm(ph4)柠檬酸缓冲液，再加0.03％过氧化氢(h2o2)，避光低温储存备用。适于测定波长：370nm或450nm(用等量1m硫酸终止后)；其二是：碱性磷酸酶用显色底物溶液：将pnpp(对硝基苯磷酸盐)以10mmol/l的浓度溶于含1mmol/lmgcl2的0.1mol/l二乙醇胺缓冲液(ph9.8)，避光低温储存备用。适于测定波长：405nm。本实施例使用过氧化氢酶底物tmb显色液。
选取298例自愿者，男女各占一半，随机并尽量平均抽取自愿者血液或脑脊液或淋巴液或组织切片或尿液，用上述方法进行与预检测；再对上述自愿者进行ct、mri来鉴别及组织病理学临床确诊；
记录数据，并分析：经ct、mri来鉴别及组织病理学临床确诊，确认所有自愿者有3例额颞叶患者；而本发明试剂盒检测发现所有自愿者中有25例疑似患者，此25例疑似患者包括该确诊的3例额颞叶患者；因此本发明试剂盒通过简单的体外检测，诊断准确率相对较高，尤其是适于早期筛查。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。