本实用新型涉及生物技术诊断领域，具体涉及一种用于心肌梗塞快速定量检测的多指标时间分辨荧光免疫层析试剂盒。
背景技术：
心肌梗塞又叫心肌梗死，急性心肌梗塞(AMI)严重威胁人类健康，是全球范围内致死和致残的主要疾病之一，快速诊断早期急性心肌梗塞并及时治疗是降低病人死亡率的关键。对于无典型胸痛和心电图改变不明显的心肌梗死患者，仅依靠心电图、超声心动图，难以准确诊断。因此，检测血清心肌标志物是诊断AMI的必要依据。
心肌标志物是指在血液中可测定出的一系列生物化学物质，它们具有心肌特异性。当心肌组织损伤时大量释放至循环血液中，通过检测其血浓度变化诊断心肌损伤状况，因此可用作心肌损伤的筛查、诊断、评定预后和治疗效果的监测标志。临床实践中已陆续发现多种反映心肌组织损伤的标志物，包括反映心肌缺血损伤的标志物，如缺血修饰白蛋白、髓过氧化物酶等；心肌组织损伤坏死的确定标志物，如心肌肌钙蛋白等。心肌标志物为临床提供了方便，使鉴别诊断、评定预后的能力大大提高。
心肌标志物主要是通过试剂盒的形式辅助AMI早期诊断。现有该类试剂盒存在以下不足：因选择的标志物单一或标志物组合的科学性差，以及试剂盒技术限制，导致特异性差、检测灵敏度低、线性范围窄等，影响诊断的效率及准确性；从而难以实现尽早确诊施救的目的。
因此，急需一种检测灵敏度更高、检测线性范围更宽、检测结果更准确的心肌梗塞标志物即时检测产品。
技术实现要素：
本实用新型所要解决的技术问题是，提供一种灵敏度更高、检测线性范围更宽、检测结果更准确的心肌梗塞快速定量检测试剂盒。具体是提供一种多指标时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其通过同时检测血液中心肌肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白的指标变化，准确地检测早期心肌损伤。具有特异性强、准确性高的特点，用一滴血实现家庭检测和现场检测，有利于及早进行对症治疗，避免心肌梗塞的进一步发生，对保护患者的生命财产安全具有重要意义，同时也具有极高的社会效益。
为解决以上技术问题，本实用新型提供一种用于心肌梗塞快速定量检测的多指标时间分辨荧光免疫层析试剂盒，具体技术方案如下：
所述试剂盒包括检测卡和可选择的荧光免疫定量分析仪。所述检测卡包括上样垫、结合垫、具有检测线和质控线的检测垫、吸样垫和底板。检测指标包括心肌肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白。结合垫包括结合垫本体和涂覆于所述结合垫本体上的时间分辨荧光微球标记抗体涂层，该时间分辨荧光微球标记抗体涂层中的抗体为所述指标的抗体；所述检测线有三条，该三条检测线相互分离且分别是能够与所述时间分辨荧光微球标记抗体涂层的抗体特异性结合的配对抗体或抗原形成的涂层。
所述的检测卡还包括疏水性外壳，外壳上有加样孔及检视窗。
上述的心肌肌钙蛋白优选为CTnI。CTnI为心肌肌钙蛋白(cTn)的三个亚单位(cTnI，cTnC和cTnT)之一，是肌肉组织收缩的调节蛋白，在心肌细胞膜完整的情况下，cTnI不能透出细胞膜进入血循环。当心肌细胞因缺血、缺氧发生变性坏死时，cTnI通过破损细胞膜释放入血。由于cTnI分子量较小并持续从变性细胞内逸出，故AMI发生后，在血中出现较早，并持续相当长时间。与其他血清酶相比，cTnI是心肌损伤的更特异的标记物，同时它也很敏感，可以诊断心脏手术周围的微小梗死。cTnI在正常人血液中含量很低，约为20.4pg/ml。cTnI>20.4pg/ml，对心肌损伤就有诊断意义。患者在出现胸痛症状前几天的微小心肌损伤即可以用cTnI检测出来。cTnI具有以下优点：血中出现时间早；灵敏度高；特异性高，骨骼肌损伤不影响结果的判断，也可推测非心脏手术病人的手术类型对cTnI无明显影响；持续时间长，因此可在心肌损伤早期和后期通过检测cTnI来明确诊断和判断心肌损伤程度。在急性心梗诊断、治疗及预后具有重要的临床应用价值。
肌红蛋白(Myo)，存在于心脏骨骼的横纹肌中。当心肌损伤时，肌红蛋白1～3h即可出现异常增高。Myo虽然心肌特异性不高，但心肌梗死后迅速地从坏死的心肌中释放出来，具有高度的敏感性，Myo阴性非常有助于排除AMI的诊断。
本实用新型所述的肌酸激酶同工酶，是指肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)，是肌酸激酶(CK)四种同功酶形式(肌肉型-MM、脑型-BB、杂化型-MB和线粒体型-MiMi)之一。主要存在于心肌细胞中，当心肌损伤时，CK-MB立刻被释放入血液循环，在心肌损伤后3～4h开始升高，48～72小时降至正常范围。
心肌肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白三项检测指标联合用于心肌梗塞的诊断，可大大提高检测的特异性和准确性。
本实用新型的试剂盒，检测灵敏度更高，其检测线可以达到现有上述标志物同类产品的10-30％，可正真实地了解身体状况。
所述的荧光微球选自修饰过的聚苯乙烯微球，内部填充镧系元素的螯合物，选自括铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)、钕(Nd)或镝(Dy)中的一种。
检测垫上包被有分别与cTnI、CK-MB和Myo相对应的单克隆抗体、多克隆抗体，或相应的抗原构成的检测线和鼠IgG抗体构成的质控线。
优选地，质控线通过包被包括但不限于羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgY或羊抗兔IgG等抗体形成。
本实用新型还提供一种用于心肌梗塞快速定量检测的多指标时间分辨荧光免疫层析试剂盒的方案，该试剂盒包括检测卡和可选择的荧光免疫定量分析仪，所述检测卡包括上样垫、结合垫、具有检测线和质控线的检测垫、吸样垫及底板；检测指标包括心肌肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白；该试剂盒还包括时间分辨荧光微球标记抗体溶液，该时间分辨荧光微球标记抗体溶液中的抗体为所述指标的抗体；所述检测线有三条，该三条检测线相互分离且分别是能够与所述时间分辨荧光微球标记抗体特异性结合的配对抗体或抗原形成的涂层。该方案的结合垫仅经过玻纤处理液处理，未涂覆时间分辨荧光微球标记抗体涂层，另制备包含荧光微球标记的cTnI单克隆抗体、荧光微球标记的CK-MB单克隆抗体和荧光微球标记的Myo单克隆抗体的荧光液。
根据本实用新型的一个具体方面，检测卡由上样垫、结合垫、检测垫及吸样垫依次相互交错粘贴在底板上构成。
根据本实用新型的一个优选方面，检测卡还包括滤血膜，该滤血膜覆设在上样垫上，上样垫、结合垫、检测垫及吸样垫依次相互交错粘贴在底板上。
根据本实用新型的又一优选方面，检测卡还包括助推垫，且检测卡由上样垫、结合垫、助推垫、检测垫及吸样垫依次相互交错粘贴在底板上构成。
根据本实用新型的还一优选方面，检测卡还包括滤血膜和助推垫，滤血膜覆设在上样垫上，上样垫、结合垫、助推垫、检测垫及吸样垫依次相互交错粘贴在底板上。
根据本实用新型的一个优选方面，所述检测垫仅有一条，所述三条检测线、一条质控线相互平行且沿着所述检测垫的长度方向依次设置在所述检测垫上。
进一步地，所述质控线位于所述检测垫的靠近所述吸样垫的端部；所述三条检测线中靠近结合垫的检测线为心肌肌钙蛋白的配对抗体或抗原涂层，靠近质控线的检测线为肌红蛋白的配对抗体或抗原涂层，中间的检测线为肌酸激酶同工酶的配对抗体或抗原涂层。
根据本实用新型的又一优选方面，所述检测垫包括三条检测分垫，所述三条检测线分别分布在三条检测分垫上。在各检测分垫上分别设置有质控线。cTnI、CK-MB和Myo相对应的单克隆抗体、多克隆抗体，或相应的抗原分别包被在三条检测分垫上，每条检测分垫上平行设置质控线，包被羊抗鼠IgG、羊抗鸡IgY或羊抗兔IgG等抗体之一。
根据本实用新型的又一优选方面，检测卡包括三个独立的检测分卡，上样垫、结合垫、吸样垫和底板各有三条，每一条上样垫、结合垫、检测分垫、吸样垫和底板组装成一个检测分卡。或，滤血膜、上样垫、结合垫、助推垫、吸样垫和底板各有三条，每一条滤血膜、上样垫、结合垫、助推垫、助推垫、检测分垫、吸样垫和底板组装成一个检测分卡。
优选地，检测垫为硝酸纤维素膜，进一步优选为孔径5～12um的多孔样结构膜；上样垫、结合垫的材质为玻璃纤维素膜或无纺布，吸样垫的材质为吸水滤纸，底板的材质优选为塑料。
荧光微球时间分辨技术和免疫层析检测技术是已知的，本实用新型所述的时间分辨荧光微球标记抗体可采用本领域熟知的方法制备。
由于以上技术方案的实施，本实用新型与现有技术相比具有如下优点：
本实用新型的创新点在于，采用时间分辨荧光免疫层析法同时检测cTnI、CK-MB和Myo的指标变化，更加准确地对心肌梗塞的发生进行定量监测，能实现家庭检测和现场检测，所需样本量少，灵敏度高，特异性强，线性范围宽，操作简便，结果可靠。
本实用新型检测卡将原本只能应用于医院检验科的试剂盒，经过技术创新，通过增加滤血膜，使其可以方便、快捷、准确的应用于对心肌梗塞的发生、发展进行同步定量监测，适用于家庭、养老院、社区卫生所，其使用方法也仅是由病人或家属针刺一滴血来实现心肌梗塞的自我检测，提高了实时自我监测的可能性，免去身体轻度不适时去医院挂号、排队、化验、取报告等繁琐过程，减轻公共医疗机构的压力，更有益于患者的日常治疗。
进一步地，本实用新型在结构上增加了助推垫，可以有效的去除背景干扰，从而进一步提高诊断灵敏度高和准确度，此外助推垫还有助于加快检测样品流动，提高检测效率，缩短检测时间。
附图说明
图1为本实用新型的实施例1的检测卡的主视结构示意图；
图2为本实用新型的实施例2的检测卡的主视结构示意图；
图3为本实用新型的实施例3的检测卡的立体结构示意图；
图4为本实用新型的实施例4的检测分卡的主视结构示意图(含T1检测线)；
图5为本实用新型的实施例4的检测分卡的主视结构示意图(含T2检测线)；
图6为本实用新型的实施例4的检测分卡的主视结构示意图(含T3检测线)。
附图标记：
1,1’,1”—上样垫 2,2’,2”—结合垫 3—检测垫
30，30’,30”—检测分垫 4，4’,4”—吸样垫 5,5’,5”—底板
6,6’,6”—滤血膜 7，7’,7”—助推垫 T1、T2、T3—检测线
C,C’,C”—质控线 20，20’,20”—结合垫本体
21,21’,21”—时间分辨荧光微球标记抗体涂层
具体实施方式
实施例1
如图1所示，本实施例提供一种用于心肌梗塞快速定量检测的多指标时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其包括检测卡、荧光免疫定量分析仪，检测卡包括上样垫1、结合垫2、具有检测线T和质控线C的检测垫3、吸样垫4、底板5、滤血膜6和助推垫7，滤血膜6覆设在上样垫1上，上样垫1、结合垫2、助推垫7、检测垫3及吸样垫4依次相互交错粘贴在底板5上。其中，检测垫3为硝酸纤维素膜且为孔径5～12um的多孔样结构膜；上样垫1、结合垫2和助推垫7的材质为玻璃纤维素膜或无纺布，吸样垫4的材质为吸水滤纸。
进一步地，检测卡能够同时检测心肌肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白三种指标，结合垫2包括结合垫本体20和涂覆于结合垫本体20上的时间分辨荧光微球标记抗体涂层21，该时间分辨荧光微球标记抗体涂层21中的抗体为心肌肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白的抗体。该检测垫3为一个，其上有三条检测线T1、T2和T3，这三条检测线相互分离且分别为三种标志物的配对抗体或抗原形成的涂层，三种标志物的配对抗体或抗原分别能够与时间分辨荧光微球标记抗体涂层特异性结合。三条检测线T1、T2、T3和质控线C相互平行且沿着检测垫3的长度方向依次设置。质控线C位于检测垫3的靠近吸样垫4的端部；三条检测线T1、T2、T3中靠近结合垫2的检测线T1为心肌肌钙蛋白的配对抗体或抗原涂层，靠近质控线C的检测线T3为肌红蛋白的配对抗体或抗原涂层，中间的检测线T2为肌酸激酶同工酶的配对抗体或抗原涂层。质控线C通过包被鼠IgG抗体形成。
本例中的各部件是这样组装到一起的：在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于40％，取底板5，将已包被的检测垫3放置在底板5的中部粘贴，在检测垫3靠检测线一侧搭接粘贴助推垫7，结合垫2粘贴在助推垫7的另一侧，结合垫2的另一侧搭接粘贴上样垫1；滤血膜6覆设在上样垫1上；在检测垫3的质控线一侧搭接吸样垫4。最后用裁剪机将贴好的底板切成3～5mm宽的试纸条，装入塑料卡壳内即形成检测卡。
本例试剂盒的检测方法如下(干法上样)：
(1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出检测卡，平放；
(2)吸取待测样本，加入洁净的离心管中，用样本稀释液进行稀释，充分混匀；
(3)用移液枪吸取稀释后的样本通过样本孔加入到上样垫1，15分钟后，根据已预先设置在时间分辨荧光免疫层析读数仪的标准曲线对cTnI、CK-MB和Myo的浓度进行计算并显示结果。
本例检测卡的检测原理如下：
当样本加入到样品孔后，样本中含有的cTnI、CK-MB和Myo抗原与荧光微球标记的cTnI、CK-MB和Myo抗体结合，借助毛细管作用，所形成的抗体-抗原免疫复合物沿硝酸纤维素膜层析至检测线，然后与固化在检测线上的cTnI、CK-MB和Myo抗体发生高特异性和高亲和性的免疫反应,因而免疫复合物被富集或截留在层析材料的检测带上,未结合的免疫复合物则继续层析至质控线被羊抗鼠IgG抗体捕获。反应完成后,检测带上Eu 3+螯合物的含量与目标被检物的浓度有一定的对应关系。如果待测样品溶液中不含被检物,则检测带上就没有Eu 3+螯合物。由于镧系离子螯合物的荧光衰变时间长，为传统荧光的103-106倍。用时间分辨荧光仪测量其荧光时，在脉冲光源激发之后，可以延迟一段时间再进行测量，此时其他成分的短半衰期荧光已经衰变，只存在Eu3+标记物的特异性荧光，通过测量免疫反应后试纸条检测带上Eu 3+螯合物的含量,参照标准浓度曲线就可以定量得到待测样品中对应抗原的浓度。
当反应结束后，进行分析，根据已预先设置在时间分辨荧光免疫定量读数仪内的标准曲线对cTnI、CK-MB和Myo的浓度进行计算并显示结果。
实施例2
如图2所示，本实施例提供一种用于心肌梗塞快速定量检测的多指标时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其基本同实施例1，不同的是，其结合垫2不具有时间分辨荧光微球标记抗体涂层21，试剂盒还进一步包括时间分辨荧光微球标记抗体溶液。
本例试剂盒的检测方法如下(湿法上样)：
(1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出检测卡，平放；
(2)吸取待测样本，与时间分辨荧光微球标记抗体溶液充分混合；
(3)用移液枪吸取混合液通过样本孔加入到上样垫1，15分钟后，根据已预先设置在时间分辨荧光免疫定量读数仪的标准曲线对cTnI、CK-MB和Myo的浓度进行计算并显示结果。
实施例3
如图3所示，本实施例提供一种用于心肌梗塞快速定量检测的多指标时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其基本同实施例1，不同的是，其检测垫3包括三个并排设置的检测分垫30，30’，30”，每个检测分垫30，30’，30”上分别形成一条检测线和质控线C。
本例试剂盒的制备、检测及检测原理同实施例1。
实施例4
如图4、图5、图6所示，本实施例提供一种用于心肌梗塞快速定量检测的多指标时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其基本同实施例1，不同的是，检测卡包括三个独立的检测分卡，滤血膜6、上样垫1、结合垫2、助推垫7、检测分垫30、吸样垫4和底板5分别有三条，每一条滤血膜6，6’，6”、上样垫1，1’，1”、结合垫2，2’，2”、助推垫7，7’,7”、检测分垫30，30’，30”、吸样垫4，4’，4”和底板5，5’，5”组装成一个检测分卡，每个检测分卡上的检测分垫30，30’，30”上分别形成一条检测线和一条质控线。
本例试剂盒的制备、检测及检测原理同实施例1。
实施例5
本实施例提供一种用于心肌梗塞快速定量检测的多指标时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其基本同实施例1，不同的是，没有助推垫7。结合垫2直接与检测垫3粘贴连接。本例试剂盒的检测及检测原理同实施例1。
以上对本实用新型做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本实用新型的内容并加以实施，并不能以此限制本实用新型的保护范围，凡根据本实用新型的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本实用新型的保护范围内。