一种高通量测量荧光磷光寿命的转盘和装置的制作方法

本发明涉及光致发光的寿命测量方法及相关仪器装置的制造和应用。属于光学仪器制造和仪器分析领域。

背景技术：

物质吸光性、光致发光、化学发光等特性在分析检测领域有非常多的应用。其原理大多是基于环境中某些因子的改变会导致物质吸光度、发光强度的改变，通过检测光强度的变化来判断某些因子的改变。然而在实际的测量中，不论是吸光度还是发光强度的测量，跟探测器的灵敏度有很大关系；在光致发光的检测中，激发光强度直接影响荧光和磷光的强度。除此之外，仪器对光的采集效率、环境光的干扰、杂质的发光等许多因素都会影响测量结果。因而，同一个样本，使用不同仪器测量得到的结果都会有差异。

为了排除上述各种误差，往往使用标准样本与待测样本在同样的测量条件下得到的结果进行比对，以排除仪器误差，或者制备工作曲线，以实现待测样本的定量分析。此外，由于仪器老化（如光源变弱）等因素，往往需要反复对仪器进行校正，这些都直接导致了操作过程繁琐，增加了人为误差，降低了测量结果的可重复性。在另外一方面，上述检测所依赖的仪器大多为大型仪器，不便于即时检测（POCT）。尽管近些年，发展出许多便携式的仪器设备，甚至许多检测可以在手机等智能硬件上实现，但是也没有改变检测光强的本质，因而依然存在仪器需要校正的问题。

时间分辨的发光检测在分析检测中也有很多应用（参考专利CN201210215872.0、CN201610166288.9、CN201610416029.7）。其中时间门控的检测在激发结束后经过一个延时再检测发光强度，这种方法可以去除短寿命的背景荧光干扰，具有很高的信噪比。然而其本质还是检测光强，仍然需要校正仪器。

另外一种时间分辨的检测是测量荧光或磷光的发光寿命，即激发态的寿命，通过检测发光的寿命来判断环境中某种因子的变化。检测发光寿命的一种方法是：使用脉冲光源激发样本，通过探测器检测样本的发光强度随时间的变化；对光强随时间衰减的曲线进行分析，获得寿命的长度。在单指数的衰减曲线中，寿命的长度定义为衰减为原先的1/e所需要的时间（参考文献Anal. Chem., 1990, 62, 270A–277A；Pure Appl. Chem. 2014, 86, 1969–1998.）。

激发态的寿命是分子的固有性质，在大多数情况下，激发态寿命与激发光的强度无关，因而，同一个样本在不同仪器中测得的寿命值基本一致，就不需要单独对仪器进行校正。相对于检测光强，以激发态寿命作为检测依据可以排除仪器差异导致的误差，具有非常高的可靠性。

现有的寿命检测已经应用在荧光寿命成像中（参考文献Anal. Chem., 2017, 89, 8104–8111），可以用于区分细胞、组织的结构。然而基于寿命检测还没有广泛应用到物质的分析检测中，最主要的原因是，现有检测寿命的仪器的价格昂贵，例如脉冲光源、时间相关的单光子计数器、条纹相机等探测器（参考中国专利CN201410353200.5、CN201310694918.6、CN201310027775.3）。另外一方面，上述各种测量寿命的设备很难做到小型、便携化，这都限制了寿命检测的应用和发展。

此外，现有的寿命检测中，一次测量往往只能检测一个样本的寿命，不能用于高通量的荧光寿命检测。这主要是因为现有测寿命的探测器如单光子计数器、条纹相机等，难以从空间域上区分不同样本。近些年发展了一些特殊的图像传感器，如单光子雪崩二极管（SADP）阵列、可记录相位的CMOS传感器等（参考文献M. Gersbach, et al., Proc. SPIE 2010, 7780, 77801H；R. Franke, G. A. Holst, Proc. SPIE 2015, 9328, 93281K），可同时测量多个像素点的荧光寿命，在全局的荧光寿命成像中具有较快的成像速度。然而，这些探测器还需要配合脉冲光源、锁相控制才能使用。

本发明人在先前的专利（CN201711110647.X）中公开了一种使用图像传感器测量寿命的方法，使用电机驱动受激发的样本在空间旋转，使不同延迟时间的发光信号在空间上分离，将时域信息转换为空间域信息进行探测，实现了多个样本荧光寿命的同步测量。该方法不需要脉冲和锁相控制，具有超低的成本。然而，在高通量的寿命测量中，为了实现多点激发，需要多个激光光斑或发散的LED光聚焦于转盘上。这一方面会造成散射干扰；另外一方面，对于需要强光激发的样本，分散激光或LED光束直接降低了激发光光功率密度，难以检测低浓度或微量的样本。虽然，使用多个激光器点对点激发光可以确保激发光强，但是会增加仪器的复杂程度和成本。

技术实现要素：

本专利为专利（CN201711110647.X）的一种重要改进，都使用电机驱动受激发的样本在空间旋转，使不同延迟时间的发光信号在空间上分离，将时域信息转换为空间域信息进行探测。本专利的改进之处在于将激发光聚焦于一束，使激发光束从样本旋转平面的平行方向激发样本，这样所有样本的旋转轨迹都会与激发光束相交，即样本在旋转过程中都会受激发光激发。这种方法只使用一个光源，既保证了光束的能量密度，又可以用于高通量的荧光寿命测量，相对于先前的专利具有显著的进步。

为实现上述目的，本专利公开一种用于测量荧光磷光寿命的转盘，其特征在于：

转盘上有多个样品槽，各样品槽距离转盘圆心的距离不等，每个样品槽连接一个光通道，所有光通道分布在转盘上，每个光通道各自独立，相互不干扰；

光通道另外一端连接转盘边缘，用于将照射在转盘边缘的激发光引入光通道，并激发样品槽中的样品；

构成光通道的介质选自空气、光纤、毛细管。

一种优选的转盘中，光通道介质为多模光纤。

另外一种优选的转盘中，光通道介质为空气，并且光通道内壁有反射膜。

另外一种优选的转盘中，光通道介质为透明毛细管，毛细管同时作为样品槽。

基于上述各种转盘，本专利公开一种荧光磷光寿命测量装置，其特征在于：

包括上述各种转盘中任意一种转盘，还包括电机、光源、照相机，

其中，转盘由电机轴连驱动，光源发出的光照射在转盘边缘的某一点上，照相机的镜头与转盘平行，用于拍摄转盘的像。

一种优选的寿命测量装置，光源和转盘之间还包括聚光透镜，用于将光源的光聚焦到转盘边缘的某一点上。这样可以提高激发光利用率，增强荧光信号。

一种优选的寿命测量装置，其特征在于：光源选自激光二极管或LED光源。

一种优选的寿命测量装置，其特征在于：光通道介质为毛细管；对液体样本进行测量时，液体样本置于毛细管中，可以先离心，再检测，实现离心分离和寿命检测的一体化。

另外一种优选的寿命测量装置，相机和转盘之间还包括成像透镜，用于将转盘的像放大，再拍照。

优选的，上述所有测量装置中，照相机镜头前还包括滤光片，用于将激发光滤除。

上述所有装置可以用于检测荧光磷光寿命。

运用上述各种装置测量荧光寿命的原理如下：

光源发出的光照射在转盘的边缘某处，当转盘转动的过程中，光会依此进入转盘的各个光通道，并激发光通道末端样品槽中的样品发光，

由于转盘是持续转动的，因而，只有当光通道的末端转到光照区域时，才能够使样本槽中的样本被激发；随着转盘的持续转动，光通道的末端转到光照区域之外，样本不再受光照激发，但是样本的发光会随着时间衰减；如果转盘转速是匀速的，则样本的发光会在转盘上形成一个光弧，且弧长与延迟时间成正比。

由于转盘上有多条光通道，因而可以激发多个样本形成多个光弧，如果对转盘进行拍照，则可以记录所有的样本发出的光弧的像，每一条光弧代表一个样本的发光随时间衰减的曲线；

根据转盘转速，可以计算光弧上每一点的延迟时间；

又根据图像像素点的亮度或灰度值，可以计算光弧上每一点的相对发光强度；

如此就获得了样本的发光光强随时间衰减的曲线，对该曲线进行拟合就可以得到寿命。

这样的一种方法，仅通过一张照片就可以获得多个样本的发光寿命，因而是高通量的寿命测量。

相对于先前专利（CN201711110647.X）中的方法，这种方法的优势在于：

将单个光源的光聚焦于一点，在高通量测量的同时，保证了激发光的功率密度，无需多个光源，显著简化了仪器并降低了成本；

由于激发光具有较高功率密度，可以测量低浓度样本和弱发光的样本；

将激发光限制在光通道内部传输，可显著降低光源散射背景；

采用多模光纤传输激发光，可以使各个样本受到大致等强度的光激发，便于多个平行样本的测试。

相对于现有的荧光磷光寿命测量装置，本专利公开的方法和装置实现了用稳态的光源测量激发态的寿命，具有显著的优势：

不需要昂贵的脉冲光源和探测器，不需要锁相控制，极大降低了寿命测量的成本；

所有零部件均可以小型化，可以做成便携的微型设备，便于即时检测应用；

可以同时检测多个样本的发光寿命，提高了检测的通量和效率，并有利于降低系统误差。

附图说明

图1为一种寿命测量装置，其中101为转盘，102为样品槽，103为光通道，104为电机，105为光源，106为照相机。

图2为一种寿命测量装置，其中201为转盘，202为样品槽，203为光通道，204为挡光环，205为电机，206为光源，207为反光罩，208为透镜，209为透镜，210为滤光片，211为手机。

图3为一种转盘俯视示意图，301为样品槽，302为光通道。

图4为一种转盘侧视和俯视示意图，401为转盘，402为透明毛细管，403为加样槽，404为通光孔。

图5为一种转盘侧视和俯视示意图，501为转盘，502为毛细管，503为通光孔。

具体实施方式

为了说明本发明的原理以及其优势，下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，其目的在于帮助更好的理解本发明的内容，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。

实施实例1，一种转盘和寿命测量装置

如附图1所示，转盘101上面有样品槽102，每个样品槽都连接一条光通道103，光通道为空气管道，激光器光源105射出的激光与转盘101平行，且当转盘转动时，激光可以依次进入各个光通道，并激发样品槽中的样品。转盘101由电机104轴连驱动转动。

在工作状态下，转盘匀速转动，激光开启，每转一圈，所有的样品槽的样本都受到激光激发一次，并且，样本的荧光或磷光在旋转过程中释放，形成光弧，各个样品槽的旋转半径不同，因而各个样本的光弧不会重叠，使用照相机106对光弧拍照，即记录了发光信息。

对图像进行处理，可以得到发光寿命，处理方法与专利（CN201711110647.X）一致，具体如下：

光弧的像素点的灰阶值与发光强度成正比，可以作为相对发光强度，

在匀速转动条件下，光弧弧长与延迟时间成正比，知道电机的转速可以计算出各个像素点的延迟时间，

以像素点灰阶值对延迟时间作图即可以得到发光衰减曲线，根据本领域已知的公式和方法对曲线拟合即可以得到发光的寿命值。

本实施实例中，光通道也可以使用光纤。

根据同样的原理，可以在转盘上增加样品槽和光通道的数量，实现更多样品的同时测量。

与先前专利（CN201711110647.X）的方法相比，本方法激发光能量集中于一处，具有更高的功率密度，可以激发更低浓度的样本和更弱的发光，每转一圈，各个样本轮流被激发，提高了激发光的利用率，而且，各个样品槽收到的激发光强大致相等，各个样本之间可以对比。此外，光通道预埋在转盘中，极大降低了散射光干扰。

实施实例2，一种转盘和寿命测量装置

如附图2所示，转盘201上面有样品槽202，各个样品槽的旋转半径不同，每个样品槽都连接一条光通道203，光通道为多模光纤，通向转盘边缘，光源206发出的光经过反光罩207反射，然后被透镜208聚焦于转盘201的边缘；204为挡光环，用于遮挡激发光散射；转盘201由电机205轴连驱动转动；透镜209，滤光片210，手机211构成拍照系统，用于对光弧进行拍照。

该装置测量寿命的方法和原理于实施实例1一致。

使用透镜209可以将转盘的局部像放大，即对光弧进行放大成像，由于光弧长度代表延迟时间，在同一转速下，放大后的光弧被更多的像素点记录，因而具有更高的时间分辨率，可以测到更短的发光寿命。

滤光片210可以将散射光和非测量波长的光滤除，增强光弧成像的信噪比。

整个装置可以做到小型化，便于使用手机拍照。

实施实例3，一种转盘

转盘的主要结构俯视图如附图3所示，301为样品槽，302为光通道，光通道由光纤构成，连接样品槽和转盘边缘，可以将转盘边缘的光导入到样品槽中。该转盘可以代替实施实例1和2中的转盘，用于寿命测量。

该转盘充分发挥了光纤的柔性优势，可以将转盘上的任意一点与转盘边缘建立非直线的光通路。

实施实例4，一种转盘

如附图4所示，转盘401分为2层，402为透明毛细管，403为加样槽，404为通光孔，在转盘内层分布有多跟透明毛细管402，每根毛细管类似一个s型，连接加样槽403和转盘边缘，由于毛细作用，可以自动吸取液体样本进入毛细管，毛细管自身可以作为波导，将转盘边缘的光导入到液体样本所在处，并激样本发光。

在转盘旋转过程中，又由于离心力，使液体样本限制在毛细管的转弯角；转盘的上层不透光，但是有多个通光孔404，并各自对映一个毛细管的转弯角，这样液体样本的发光就可以形成发光弧，并且，各个毛细管的转弯角的旋转半径不同，因而各个光弧不重叠。

该转盘可以代替实施实例1和2中的转盘，用于寿命测量。

该实施实例充分发挥了毛细管的波导特性、毛细原理，同时还利用了离心力。

该方法可以用于混合物的离心分离和寿命测量。

实施实例5，一种转盘

如附图5所示，转盘501分为2层，上层不透光，具有多个通光孔503；下层埋有U型透明毛细管502，U型毛细管开口指向转盘圆心，底部通向转盘边缘，用于将转盘边缘的光导入到毛细管中，使管内的样本可以被激发；每个通光孔对应一根毛细管，使毛细管的一小段的光可以从转盘内透出，因而转盘旋转时，可以形成发光弧，又由于各个通光孔的旋转半径不同，各光弧轨迹不会重叠，因而可以用于多个样本的寿命发光寿命检测。

该转盘可以代替实施实例1和2中的转盘，用于寿命测量。

该转盘中，毛细管即作为样品槽，又用于导光；并且，转盘旋转时会产生离心力，使一些样本的不同组分可以在U型毛细管内分离，达到分离检测的目的。

同实施实例4一样，该实施实例充分发挥了毛细管的波导特性、毛细原理，同时还利用了离心力。

该方法可以用于混合物的离心分离和寿命测量。