供基于显微术的尿沉渣分析仪使用的质量控制物质及其使用方法与流程

与相关申请的相互参照

本申请要求2017年8月28日提交的美国临时申请no.62/550,852和2017年12月21日提交的美国临时申请no.62/608,656的优先权，其各自的公开内容特此整体引入作为参考。

发明领域

本文提供了供基于显微术的尿沉渣分析仪使用的质量控制物质及其使用方法。

背景

基于显微术的尿沉渣分析仪基于各种分析物的形态学来评价尿样品中那些分析物的存在。为了确保沉渣分析仪正确地基于分析物的形态学来检测它们，需要质量控制。然而，当前的沉渣尿分析质量控制（qc）材料不用作所有常见分析物的适当对照。

发明概述

本文提供了供基于显微术的尿沉渣分析仪使用的质量控制物质，所述质量控制物质包含尿基质（urinematrix）和癌细胞、藻类细胞、酵母细胞、卵清或其任何组合。

本文还公开了检测来自主体的尿样品中分析物的存在的方法。所述方法包括使用基于显微术的尿沉渣分析仪分析本文公开的质量控制物质的任一种，以确定所述质量控制物质内的组分的形态学，以及将所述质量控制物质内的组分的形态学与尿样品内的分析物的形态学进行比较，其中所述分析物和所述质量控制物质之间的匹配形态学表明所述尿样品中所述分析物的存在。

还提供了供鉴定来自主体的尿样品中一种或多种分析物的存在之用的质量控制物质，以及癌细胞、藻类细胞、酵母细胞、卵清或其任何组合在制备供基于显微术的尿分析仪使用的质量控制物质中的用途。

附图简述

当连同附图一起阅读时，进一步理解所述概述以及以下详细描述。为了举例说明所公开的质量控制物质和方法起见，在附图中显示了质量控制物质和方法的示例性实施方案；然而，质量控制物质和方法不限于所公开的具体实施方案。在附图中：

图1是具有500/μl的目标rbc浓度的样品的代表性urised2图像。

图2是通过在尿中添加杂交瘤细胞悬浮液制备的wbc和nec阳性尿样品的代表性图像。

图3是具有82.28/μl的nec浓度的尿样品的代表性urised2图像。该图像显示存在具有明确的光滑边缘的圆形细胞。

图4是具有18.48/μl的yea浓度的尿样品的代表性urised2图像。该图像显示了圆-椭圆形单和芽殖酵母细胞的存在。

图5是具有80-100/μl的yea浓度的尿样品的代表性atellicauas800图像。该图像显示了圆-椭圆形单和芽殖酵母细胞的存在。

图6是具有652-674/μl的yea浓度为的尿样品的代表性atellicauas800图像。该图像显示了圆-椭圆形单和芽殖酵母细胞的存在。

图7是muc阳性尿样品的代表性atellicauas800图像。

图8是表明尿中pat的存在的代表性urised2图像。

举例说明性实施方案详述

参考以下连同附图进行理解的详述，可以更容易地理解所公开的质量控制物质和方法，所述附图形成了本公开内容的一部分。要理解的是，所公开的质量控制物质和方法不限于本文描述和/或显示的具体质量控制物质和方法，并且本文所用的术语仅为了举例来说描述特定实施方案起见，并且不意图限制请求保护的质量控制物质和方法。

除非另外明确说明，否则关于可能的作用机理或作用方式或改进原因的任何描述仅意图是举例说明性的，且所公开的质量控制物质和方法不受到任何这种建议的作用机理或作用方式或改进原因的正确性或不正确性的约束。

贯穿本文，描述涉及质量控制物质和使用所述质量控制物质的方法。在公开内容描述或请求保护与质量控制物质有关的特征或实施方案的场合，这种特征或实施方案同样适用于使用所述质量控制物质的方法。同样，在公开内容描述或请求保护与使用质量控制物质的方法有关的特征或实施方案的场合，这种特征或实施方案同样适用于所述质量控制物质。

要理解的是，为清楚起见本文在分开的实施方案的上下文中描述的所公开的质量控制物质和方法的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的所公开的质量控制物质和方法的各种特征也可以单独地或以任何子组合（subcombination）提供。

对“一个实施方案（oneembodiment）”或“实施方案（anembodiment）”的任何引用都表示在该实施方案方面描述的特定要素、特征、结构或特性包括在至少一个实施方案中。说明书中各个地方出现短语“在一个实施方案中”不一定是指同一实施方案。

除非有相反的特意说明，否则“或”是指可兼的“或”而不是不可兼的“或”。例如，以下任何一项都满足条件a或b：a为真（或存在）且b为假（或不存在），a为假（或不存在）且b为真（或存在），以及a和b两者均为真（或存在）。可兼的“或”可以理解为等同于：条件a或b中的至少一个。

如本文所用的，单数形式“一个（a）”、“一种（an）”和“该（the）”包括复数。

在整个说明书和权利要求书中使用了与描述的各方面相关的各种术语。除非另外指出，否则将给予这种术语其在本领域中的普通含义。其他明确定义的术语将以与本文提供的定义一致的方式解释。

术语“包含”意图包括由术语“基本上由……组成”和“由……组成”所包含的实例；类似地，术语“基本上由……组成”意图包括由术语“由……组成”所包含的实例。

术语“阴性尿”是指对于沉渣分析显示阴性结果的尿样品。

如本文所用的，术语“尿基质”是指用抗微生物剂如例如通过使用bdvacutainer®ua保存管（preservativetube）（bddiagnostics,目录#364992）稳定的尿。天然尿和保存的尿之间的区别是保存的尿中存在防腐化学物质。

贯穿本公开内容使用以下缩写：细菌（bac）；晶体（cry）；非鳞状上皮细胞（nec）；病理管型（pat）；质量控制（qc）；红细胞（rbc）；尿分析（ua）；白细胞（wbc）；酵母（yea）。

当前的商业qc材料仅使一些沉渣分析物在尿中发现（例如红细胞（rbc）、白细胞（wbc）和晶体（cry））。然而，这些qc材料不含有用于分析细菌（bac）、酵母（yea）、病理管型（pat）或非鳞状上皮细胞（nec）的对照。因为bac、yea、pat和/或nec的存在（即使少量）可以指示病理状况，所以检查分析仪是否正确检测了这些分析物是重要的。本公开内容提供用于检测这些分析物的质量控制物质。

本文提供了供基于显微术的尿沉渣分析仪使用的质量控制物质，所述质量控制物质包含：

尿基质；和

癌细胞、藻类细胞、酵母细胞、卵清或其任何组合。

癌细胞可以包含在质量控制物质中，以充当尿样品中存在的非鳞状上皮细胞的形态学对照。合适的癌细胞将具有与非鳞状上皮细胞相似的形态学，包括具有光滑且明确的周界的圆形形状、在30-40微米范围内的尺寸以及颗粒状细胞质和暗圆形核。合适的癌细胞包括skbr-3细胞或h-1975细胞。skbr-3细胞是人乳腺癌细胞，且可以包括atcc®htb-30®细胞。h-1975细胞是人肺癌细胞，且可以包括atcc®crl-5908™细胞。在一些实施方案中，质量控制物质包含skbr-3细胞。在一些实施方案中，质量控制物质包含h-1975细胞。在一些实施方案中，质量控制物质包含skbr-3和h-1975细胞两者。skbr-3细胞可以在具有10％fbs（胎牛血清）的mccoy's5a培养基中生长，且h-1975细胞可以在dmem（dulbecco改良eagle培养基（dulbecco’smodifiedeagle’smedium））中生长。收集足够数目的细胞后，可用pbs（磷酸缓冲盐水）洗涤细胞以去除生长培养基。然后可以通过将细胞于2-8℃在pbs中的2％甲醛中温育24小时来固定h-1975细胞。skbr-3细胞可以通过将细胞于2-8℃在pbs中的2％甲醛中温育24小时来固定。通过上述方法获得并用戊二醛或其他普通细胞防腐剂（包括二偶氮烷基脲或咪唑烷基脲）固定的细胞可用作非鳞状上皮细胞的形态学对照。

藻类细胞可以包含在质量控制物质中，以充当尿样品中存在的病理管型的形态学对照。合适的藻类细胞具有与病理管型相似的形态学，包括圆柱形形状和颗粒状内部。合适的藻类细胞可包括例如硅藻（例如来自nilebiologicalinc.的那些）。硅藻是真核藻类，其在显微镜下看来似乎具有包括颗粒状内部在内的两个平行的边缘。这种独特的形态学外观与病理管型的圆柱形形状和颗粒性极为相似。硅藻藻类可以在水悬浮液中获得。可通过颠倒容器来混合悬浮液，并将其（约0.5ml）添加到3ml阴性尿中。

酵母细胞可以包含在质量控制物质中，以充当尿样品中存在的酵母的形态学对照。示例性的酵母包括存在于尿中的天然存在的酵母或啤酒糖酵母（saccharomycescerevisiae）。在一些实施方案中，酵母细胞（白色假丝酵母（candidaalbican））可从对照主体（即不是正在分析其尿的主体）的尿中分离并添加到质量控制物质中。在一些实施方案中，可以将啤酒糖酵母添加到质量控制物质中。在含有蔗糖溶液的尿培养基中生长的酵母细胞被沉渣分析仪正确地识别为酵母。然而，在没有蔗糖溶液的情况下的尿或pbs中生长的酵母细胞既被沉渣分析仪正确地识别为酵母，又被沉渣分析仪不正确地识别为rbc。（表7）。因此，在一些实施方案中，酵母细胞存在于包含蔗糖溶液的溶液中或从蔗糖溶液获得。

卵清可以包含在质量控制物质中，以充当尿样品中黏液的形态学对照。卵清是具有少量碳水化合物和钠盐的蛋白质溶液。卵清黏液样材料（约1ml）可以添加到阴性尿（3ml）中，以产生具有阳性黏液结果的样品。

在一些实施方案中，质量控制物质可包含癌细胞和藻类细胞。在一些实施方案中，质量控制物质可包含癌细胞和酵母细胞。在一些实施方案中，质量控制物质可包含藻类细胞和酵母细胞。在一些实施方案中，质量控制物质可包含癌细胞和卵清。在一些实施方案中，质量控制物质可包含藻类细胞和卵清。在一些实施方案中，质量控制物质可包含酵母细胞和卵清。在一些实施方案中，质量控制物质可包含癌细胞、藻类细胞和卵清。在一些实施方案中，质量控制物质可包含藻类细胞、酵母细胞和卵清。在一些实施方案中，质量控制物质可包含癌细胞、藻类细胞和酵母细胞。在一些实施方案中，质量控制物质可包含癌细胞、藻类细胞、酵母细胞和卵清。

所公开的质量控制物质可以进一步包含晶体、细菌细胞、精子细胞、白细胞、红细胞、透明管型或其任意组合。

还公开了检测来自主体的尿样品中分析物的存在的方法。公开的方法包括使用基于显微术的尿沉渣分析仪分析本文公开的质量控制物质的任一种，以确定所述质量控制物质内的组分的形态学，以及将所述质量控制物质内的组分的形态学与尿样品内的分析物的形态学进行比较，其中所述分析物和所述质量控制物质之间的匹配形态学表明所述尿样品中所述分析物的存在。

所公开的方法可以用于检测尿样品内非鳞状上皮细胞的存在。在其中分析物是非鳞状上皮细胞的实施方案中，质量控制物质可以包含癌细胞。

所公开的方法可以用于检测尿样品内病理管型的存在。在其中分析物是病理管型的实施方案中，质量控制物质可以包含藻类细胞。

所公开的方法可以用于检测尿样品内酵母的存在。在其中分析物是酵母细胞的实施方案中，质量控制物质可以包含酵母细胞。

所公开的方法可以用于检测尿样品内黏液的存在。在其中分析物是黏液的实施方案中，质量控制物质可以包含卵清。

所公开的方法可用于检测下述的存在：非鳞状上皮细胞和病理管型；非鳞状上皮细胞和酵母；病理管型和酵母；非鳞状上皮细胞和黏液；病理管型和黏液；酵母和黏液；非鳞状上皮细胞、病理管型和酵母；非鳞状上皮细胞、病理管型和黏液；非鳞状上皮细胞、酵母和黏液；病理管型、酵母和黏液；或非鳞状上皮细胞、病理管型、酵母和黏液。在其中方法用于检测上述分析物的组合的实施方案中，质量控制物质可具有癌细胞（例如skbr-3细胞或h-1975细胞）、藻类细胞（例如硅藻）、酵母细胞（例如白色假丝酵母或啤酒糖酵母）和/或卵清的组合。

还提供了供鉴定来自主体的尿样品中一种或多种分析物的存在之用的质量控制物质。

本文提供了癌细胞、藻类细胞、酵母细胞、卵清或其任何组合在制备供基于显微术的尿分析仪使用的质量控制物质中的用途。

实施例

提供以下实施例以进一步描述本文公开的一些实施方案。实施例意图举例说明而非限制公开的实施方案。

rbc阳性尿的制备

rbc阳性尿如下制备：

1)将人血（7-8ml）抽入10ml-肝素管中并于室温贮藏2天，从而导致血细胞的稳定。

2)如表1中所示，将稳定的血液的10μl等分试样分别添加到三种不同的培养基（10ml）中。在urised2上分析来自每种制剂的3ml等分试样。

表1：稳定的rbc设计的（contrived）尿样品的不同制剂

3)从上述原液，使用各自的培养基作为稀释剂，制备把3000/μl和500/μlrbc作为目标的稀释的样品。

表2：制备稀释的样品以获得目标rbc浓度

4)如表3中所示，用2天久的rbc（在肝素管中2天久的全血）以基于尿的原液和阴性尿重复类似的稀释，以达到1000、800、400、100和50/μl的rbc浓度。通过在10ml阴性尿中添加10μl2-天久的全血来制备原液。原液的rbc浓度为6875.44/μl。

表3：具有目标rbc浓度的线性样品的制备

具有目标rbc浓度500/μl的样品的代表性urised2图像显示于图1中。

使用杂交瘤细胞制备nec和wbc阳性尿

nec和wbc阳性尿样品如下产生：

1)按照内部程序，在siemenshealthineers实验室内部培养杂交瘤细胞（小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（p653细胞）之间的杂交）。在生长培养基中获得细胞。将细胞添加到10ml培养基中，离心（200-500g，5-7分钟）以除去贮藏培养基，重悬浮于培养基中，并将容器放置于co2-培养箱中。一旦培养了足够的细胞，就通过离心除去培养基，并将细胞收获在pbs中。

2)然后将细胞于2-8℃用在mdm培养基中的2％甲醛固定24小时。通过离心除去甲醛溶液，并将固定的细胞重悬浮于mdm培养基中。

3)在5ml的阴性尿中添加0.5ml细胞悬浮液（浓度＝~500/μl）。将悬浮液匀浆，并在urised2上分析样品，如表4中所示的。

表4：阴性尿中不同批次杂交瘤细胞悬浮液中wbc和nec的浓度

以上结果表明，urised2将杂交瘤细胞识别为wbc和nec。图2是通过在尿中添加杂交瘤细胞悬浮液制备的wbc和nec阳性样品的代表性图像。

从人肺癌上皮细胞制备nec阳性样品（m1975）

m1975阳性尿如下制备：

1)人m1975细胞在dmem培养基中生长并在2％甲醛中于2-8℃固定24小时。将保存的细胞在pbs（具有bsa和叠氮化物）中贮藏24小时。

2)在阴性尿（3ml）中添加细胞悬浮液（100μl）。在urised2上分析3ml等分试样。结果表明nec浓度＝31.68/μl。

3)在阴性尿（3ml）中添加细胞悬浮液（500μl）。在urised2上分析3ml等分试样。结果表明nec浓度＝176.44/μl。（图3）

4)用1.5ml阴性尿稀释1.5ml的500μl-悬浮液（批次-2原液）。在urised2上分析3ml等分试样。如表5中所示的，结果表明nec浓度＝77.88/μl。

5)为了检查再现性，通过在阴性尿（3ml）中添加细胞悬浮液（500μl）来制备另一组。在urised2上分析3ml等分试样。结果表明nec浓度＝164.12/μl。

6)用1.5ml阴性尿稀释1.5ml的第二批次的500μl-悬浮液（批次-3原液）。在urised2上分析3ml等分试样。如表5中所示的，结果表明nec浓度＝82.28/μl。

表5：通过向阴性尿中添加所添加的m1975细胞悬浮液而制备的不同批次的nec-阳性尿材料中nec的浓度

图3是具有82.28/μl的nec浓度的批次-3原液的代表性urised2图像。该图像显示存在具有明确的光滑边缘的圆形细胞。

通过按照上述程序单独培养m1975细胞且然后在沉渣阴性尿（5ml）中添加细胞悬浮液的两个不同等分试样（100μl），测试了制剂的再现性。

表6：通过将m1975细胞悬浮液添加到阴性尿制备的不同批次的nec-阳性尿材料中nec的浓度

从酵母细胞制备yea阳性样品

酵母阳性尿如下制备：

1)酵母细胞（娄格法尔特氏青霉（penicilliumroqueforti）或面包酵母啤酒糖酵母）在有葡萄糖（约0.5％）的情况下分别在pbs溶液和阴性尿中于37℃生长。

2)从酵母阳性临床尿样品获得的酵母细胞也通过将1ml酵母阳性尿样品添加到40ml沉渣阴性尿中来生长。临床尿样品中发现的酵母细胞一般是白色假丝酵母。酵母细胞在没有碳水化合物的情况下和在有1ml5％蔗糖溶液的情况下均生长。将混合物于室温下保持24小时以允许酵母细胞生长。

3)将通过上述方法生长的酵母细胞添加到阴性尿样品中，并在urised2和atellicauas800上分析样品。

酵母和红细胞的形态学（圆形，较暗的边缘）彼此非常接近。在基于显微术的尿分析中，酵母和红细胞经常彼此相干扰。当人工生长的酵母细胞被设计到阴性尿样品中并通过沉渣尿分析分析仪进行分析时，也发现了类似的观察结果。然而，在有蔗糖溶液的情况下生长的酵母细胞看来似乎仅被检测为酵母，而不被错误地检测为红细胞。

图4是yea浓度为18.48/μl的尿样品（表7中的实验id040616-20）的代表性urised2图像。该图像显示了圆-椭圆形单和芽殖酵母细胞的存在。图5是yea浓度为80-100/μl的尿样品（表7中的实验id=yea-2am-1）的代表性atellicauas800图像。该图像显示了圆-椭圆形单和芽殖酵母细胞的存在。图6是yea浓度为652-674/μl的尿样品（表7中的实验id=11082017-yea-设计的）的代表性atellicauas800图像。该图像显示了圆-椭圆形单和芽殖酵母细胞的存在。

表7：通过将实验室生长的酵母细胞悬浮液添加到阴性尿中制备的不同批次的yea-阳性尿材料中的yea浓度

从卵清制备muc阳性样品

通常，卵清包含~90％的水和~10％的蛋白质作为其主要组分，但还包含少量的碳水化合物和钠盐。卵清具有稠的黏液样外观。卵清阳性尿如下制备：

1)在5ml阴性尿中添加约1ml卵清。

2)通过非常缓慢地颠倒容器来混合所述混合物。

3)在atellicauas800上分析样品。

表8和图7表明在阴性尿中添加卵清导致阳性黏液浓度。

表8：在向阴性尿中添加卵清的样品中的muc浓度

从水网藻属（hydrodictyon）藻类制备病理管型（pat）阳性样品

遵循以下程序以获得pat阳性尿样品：

1)将10ml的水网藻属藻类在水中的悬浮液于3000rpm离心2分钟。离心后，除去上清液，并将残余物重悬浮在剩余的1ml体积的悬浮液中。

2)将1ml离心的重悬浮液与3ml阴性尿混合。

3)混合的样品在urised2上进行测试。

结果表明存在pat（3.08/μl），如图8中所示的。

如以上实施例所示的，除了在显微术图像中观察到的外观相似性外，来自尿沉渣分析仪的相应结果还表明，该仪器还将这些类似物识别为尿沉渣分析物。因此，所公开的质量控制物质使得能够更好地评价重组分析仪的性能，所述沉渣分析仪测量病理上重要的分析物，例如pat、nec和yea。

本领域技术人员将理解，可以对质量控制物质和方法的优选实施方案进行许多改变和修改，并且可以在不背离所公开主题的精神的情况下进行这种改变和修改。因此，意图是所附权利要求包括落入本发明的真实精神和范围内的所有这种等同变化。

实施方案

以下实施方案列表意图补充而不是置换或取代先前的描述。

实施方案1.供基于显微术的尿沉渣分析仪使用的质量控制物质，所述质量控制物质包含：

尿基质；和

癌细胞、藻类细胞、酵母细胞、卵清或其任何组合。

实施方案2.实施方案1的质量控制物质，其中所述癌细胞是skbr-3细胞或h-1975细胞。

实施方案3.实施方案1的质量控制物质，其中所述藻类细胞是硅藻。

实施方案4.实施方案1的质量控制物质，其中所述酵母细胞是存在于尿中的天然存在的酵母（白色假丝酵母）或啤酒糖酵母。

实施方案5.前述实施方案任一项的质量控制物质，其进一步包含晶体、细菌细胞、精子细胞、白细胞、红细胞、透明管型或其任意组合。

实施方案6.检测来自主体的尿样品中分析物的存在的方法，包括：

使用基于显微术的尿沉渣分析仪分析实施方案1-5任一项的质量控制物质，以确定所述质量控制物质内的组分的形态学，以及

将所述质量控制物质内的组分的形态学与尿样品内的分析物的形态学进行比较，其中所述分析物和所述质量控制物质之间的匹配形态学表明所述尿样品中所述分析物的存在。

实施方案7.实施方案6的方法，其中：

（i）所述分析物是非鳞状上皮细胞，并且所述质量控制物质包含癌细胞；

（ii）所述分析物是病理管型，并且所述质量控制物质包含藻类细胞；

（iii）所述分析物是酵母细胞，并且所述质量控制物质包含酵母细胞；

（iv）所述分析物是黏液，并且所述质量控制物质包含卵清；或

（v）（i）-（iv）的任何组合。

实施方案8.实施方案7的方法，其中所述癌细胞是skbr-3细胞或h-1975细胞。

实施方案9.实施方案7的方法，其中所述藻类细胞是硅藻。

实施方案10.实施方案7的方法，其中所述酵母细胞是存在于尿中的天然存在的酵母（白色假丝酵母）或啤酒糖酵母。

实施方案11.实施方案1-5任一项的质量控制物质，其供鉴定来自主体的尿样品中一种或多种分析物的存在之用。

实施方案12.癌细胞、藻类细胞、酵母细胞、卵清或其任何组合在制备供基于显微术的尿分析仪使用的质量控制物质中的用途。