本发明涉及用于测量g蛋白偶联受体(gpcr)活化的调控的新方法，例如用于对分子调控gpcr活化的能力进行测定的方法。根据本发明的方法使得能够检测gpcr制剂中空g蛋白(emptygprotein)或全g蛋白(fullgprotein)的出现或消失。
背景技术：
：：g蛋白偶联受体(gpcr)是哺乳动物以及整个动物界的膜受体家族。g蛋白是由gpcr激活的异三聚体蛋白(3个亚基：α、β和γ)。通过gpcr，g蛋白在将信号从细胞外转导至细胞内(即，对外部刺激的细胞反应)中发挥作用。通常描述的它们的作用机理如图1所示，并总结如下：-在其未活化状态(静息状态)中，g蛋白的α亚基与核苷酸gdp结合(与gdp结合的全g蛋白)；-gpcr活化后，gpcr结合至g蛋白的α亚基并触发g蛋白激活过程，该过程由两个步骤构成：1)gdp离开g蛋白以产生空g蛋白，并形成未活化gpcr/空g蛋白复合体；以及2)结合gtp，从而使得活化的g蛋白(处于gtp形式，与gtp结合的全g蛋白)形成。在第一步中，与受体结合的g蛋白处于称为“空形式”的形式。因为据描述核苷酸gtp快速结合至g蛋白的α亚基，该状态在文献中被描述为暂时的。此外，活化的g蛋白的β/γ亚基与α亚基解离；-然后，与gtp结合的全g蛋白的α亚基结合至效应物以将它们激活。效应物转而激活引起细胞反应的信号传导通路；-然后，gtp被g蛋白α亚基水解为gdp，而α亚基与β/γ亚基重新结合以重新形成与gdp结合的全g蛋白(未活化状态)。存在对于不同的效应物具有不同的选择性谱并由此诱导优先的信号传导通路活化的数种gα蛋白亚型。gpcr与许多重要的生理功能相关，并且被认为是多种疾病的优选治疗靶标之一。因此，开发出了许多体外筛选测试来鉴别能够调控gpcr的分子。开发出的测试利用了g蛋白激活的不同机制并实施了多种技术(zhang等；toolsforgpcrdrugdiscovery；(2012)actapharmacologicasinica)。可特别提及使用放射性标记的配体对配体与gpcr的亲和力进行测量的亲和力测试，使用与gpcr附着的闪烁显像珠的邻近闪烁显像测试(proximityscintigraphytests)或使用可缓慢水解或不可水解的gtp(例如gtpγs)的功能测试。然而，这些测试难以实施，并且有时需要可能限制其作为高通量筛选(hts)分析这一用途的膜过滤步骤。已开发出其它分析以证明gpcr活化。这些测试尤其基于共振能量转移(ret)技术，例如荧光共振能量转移(fret)或生物发光共振能量转移(bret)。实例包括通过使用以下物质来突出gpcr与g蛋白之间的相互作用的能量转移技术：融合至gpcr的供体与融合至g蛋白的接受体(wo2006/086883和wo2003/008435)，或者融合至g蛋白α亚基的接受体与融合至g蛋白β亚基和/或γ亚基的供体(bunemann等，proc.natl.acad.sci.，2003，26，16077-16082)。然而，由于这些技术需要融合蛋白的制备并且不允许进行细胞内源表达的gpcr和g蛋白(即，未修饰且未过度表达)的研究，因此这些技术有局限。另一方面，为了区分可被受体激活的gα蛋白的不同亚型，这些技术需要制备多种膜样品(针对gα蛋白的每种亚型的特定制剂)。能量转移技术也已用于开发测试以使g蛋白的gtp(活化)形式或g蛋白的gdp(未活化)形式的调控可视化。一个实例是使用以下形式：具有融合至生物素标记的g蛋白，从而结合与链霉亲和素蛋白偶联的供体以及与不可水解或可缓慢水解的gtp类似物结合的接受体(wo2006/035208)。另一方面，另一种形式使用区分gtp形式和gdp形式并通过链霉亲和素蛋白(所述链霉亲和素蛋白与供体偶联)结合至供体的生物素化肽(karobio)。使用抗6his抗体，将接受体与融合有6his标签的gpcr结合(wo2004/035614)。因为这些技术还需要制备融合蛋白并且不允许进行细胞内源表达的g蛋白和gpcr的研究，它们也是有局限的。同样，为了区分可被受体激活的gα蛋白的不同亚型，这些技术需要制备多种膜样品。最后，最近的能量转移形式使用上述生物素化肽(karobio)与偶联至供体的链霉亲和素以及结合至接受体的gtpγs类似物(frang等，https：//shop.perkinelmer.com/content/relatedmaterials/posters/sps_006943gtplance.pdf.)。然而，这种最近的形式不能将非关联的g蛋白(与gdp或gtp核苷酸结合的g蛋白)与当其被化合物激活时与gpcr关联的形式(空g蛋白)区分开。因此，真正需要灵敏且可靠的方法，以容易地测定gpcr活化的调控，例如容易地测定分子调控gpcr活化的能力，和/或测定哪种g蛋白亚型被gpcr激活。技术实现要素：本发明旨在提出用于体外筛选能够调控gpcr的分子的新方法。此新方法特别基于区分g蛋白的全形式(与gtp结合的全g蛋白或与gdp结合的全g蛋白)与g蛋白的空形式的能力，就本发明人所知，从未使用过该方法来对gpcr的活化进行测量。具体而言，本发明具有以下优点：1)使用基于荧光的检测方法，因此为非放射性的；2)不需要任何洗涤步骤，从而简化了其实施，特别是用于筛选高通量化合物的活性；3)尤其允许对未修饰的g蛋白和gpcr蛋白的研究；4)允许在含有不同亚型的同一膜制剂中对由gpcr激活的gα蛋白的这些不同亚型进行区分(通过使用区分gα蛋白亚型的检测配体来提供所述区分)。根据第一方面，本发明涉及对分子调控g蛋白偶联受体(gpcr)的活化的能力进行测定的方法，所述方法包括以下步骤：a)将以下物质引入第一容器：-携带一种或多种gpcr以及一种或多种g蛋白的膜制剂，-gdp源或gtp源，-用ret伴侣对的第一成员标记的g蛋白α亚基(gα蛋白)的第一配体，以及用ret伴侣对的第二成员标记的gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空gα蛋白或全gα蛋白；b)对所述第一容器中发射的ret信号进行测量；c)(i)将测试分子以及与步骤a)中相同的试剂引入第二容器中，或者(ii)将测试分子引入所述第一容器中；d)对步骤c)中获得的第一容器或第二容器中发射的ret信号进行测量；e)对步骤b)和步骤d)中获得的信号进行比较；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr反向激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr反向激动剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr反向激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr反向激动剂。根据第二方面，本发明涉及对分子调控g蛋白偶联受体(gpcr)的活化的能力进行测定的方法，所述方法包括以下步骤：a)将以下物质引入第一容器：-携带一种或多种gpcr以及一种或多种g蛋白的膜制剂，-gdp源或gtp源，-用ret伴侣对的第一成员标记的g蛋白α亚基(gα蛋白)的第一配体，以及用ret伴侣对的第二成员标记的gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空gα蛋白或全gα蛋白；-gpcr激动剂；b)对所述第一容器中发射的ret信号进行测量；c)将测试分子以及与步骤a)中相同的试剂引入第二容器中；d)对步骤c)中获得的第二容器中发射的ret信号进行测量；e)对步骤b)和步骤d)中获得的信号进行比较；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂。根据第三方面，本发明涉及用于实施根据本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：-用ret伴侣对的第一成员标记的g蛋白α亚基(gα蛋白)的第一配体，以及用ret伴侣对的第二成员标记的gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空gα蛋白或全gα蛋白；-一套说明书；-任选的用于试剂的一种或多种稀释缓冲液；-任选的gdp源或gtp源；-任选的携带一种或多种gpcr和/或一种或多种蛋白的膜制剂；以及-任选的gα蛋白。附图说明图1说明了gpcr和g蛋白激活的作用机制。图2说明了通过区分全g蛋白的初始形式(与gdp或gtp或不可水解/可缓慢水解的gtp结合)与最终的空形式(无核苷酸)对gpcr和所关联的g蛋白的活化进行检测的概念。图3a-图3d说明了根据本发明的4种测试形式。图4a和图4b说明了根据形式2b用以下检测配体对进行的活化测试：生物素肽-kb1753/sa-xl+抗gαi抗体sc13533-lumi4tb。图5a和图5b说明了根据形式2b用以下检测配体对进行的活化测试：抗gαi抗体dsv36s-d2+抗gαi抗体sc13533-lumi4tb。图6a和图6b说明了根据形式2b用以下检测配体对进行的活化测试：抗gαi抗体dsv39s-d2+抗gαi抗体sc13533-lumi4tb。图7a和图7b说明了根据形式2b用以下检测配体对进行的活化测试：抗gαi抗体dsv3s-d2+抗gαi抗体dsv36s-lumi4tb。图8a和图8b说明了根据形式1a用以下检测配体对进行的活化测试：抗gαi抗体dsv39s-d2+抗gαi抗体dsv26s-lumi4tb。图9a和图9b说明了根据形式2a用以下检测配体对进行的活化测试：抗gαi抗体dsv39s-d2+抗gαi抗体dsv26s-lumi4tb。图10说明了根据形式2b用以下检测配体对进行的活化测试：生物素肽kb1753/sa-xl+抗gαi抗体sc13533-lumi4tb，在四种不同的gpcr(δ阿片、甘丙肽r1(galaninr1)、nop、5ht1a)以及两种不同的细胞背景(hek293和cho-k1)下验证了测试形式。图11说明了根据形式2a用以下检测配体对进行的活化测试：抗gαi抗体dsv39s-d2+抗gαi抗体dsv26s-lumi4tb，用gtpγs或gtp验证了测试形式。图12a和图12b说明了根据形式2b用以下检测配体对进行的活化测试：抗gαi抗体dsv36s-lumi4tb+抗gαi抗体sc13533-d2。图13a和图13b说明了根据形式2b用以下检测配体对进行的活化测试：抗gαi抗体sdabf11-d2+抗gαi抗体sc13533-lumi4tb。图14a和图14b说明了根据形式2b用以下检测配体对进行的活化测试：抗gαisdabf4-d2抗体+抗gαisc13533-lumi4tb抗体。图15a和图15b说明了根据形式2b用以下检测配体对进行的活化测试：抗gαi抗体sdabg6-d2+抗gαi抗体sc13533-lumi4tb。图16a和图16b说明了根据形式2b用以下检测配体对进行的活化测试：抗gαi抗体sdabb11-d2+抗gαi抗体sc13533-lumi4tb。图17a和图17b说明了根据形式2b用以下检测配体对进行的活化测试：抗gαi抗体sdabf9-d2+抗gαi抗体sc13533-lumi4tb。图18a和图18b说明了根据形式2b用以下检测配体对进行的活化测试：抗gαi抗体sdabg7-d2+抗gαi抗体sc13533-lumi4tb。图19a和图19b说明了根据形式2b用以下检测配体对进行的活化测试：抗gαi抗体sdaba10-d2+抗gαi抗体dsv36s-lumi4tb。图20a说明了检测配体对抗gαi抗体sdabe2-d2+抗gαi抗体sc13533-lumi4tb，从gα蛋白的空形式中特异性检测gα蛋白的全gtpgs形式的能力。具体实施方式定义在本发明的意义中，术语“g蛋白”是指由称为gα蛋白、gβ蛋白和gγ蛋白的三个亚基组成的异三聚体蛋白。在本发明的意义中，术语“gα蛋白”或“gα”是指g蛋白α亚基。gα蛋白具有两个结构域：gtpase结构域和α螺旋结构域。至少存在20种不同的gα蛋白，其可分为以下主要蛋白家族：gαs(已知激活腺苷酸环化酶以增加camp合成)、gαi(已知抑制腺苷酸环化酶)、gαolf(与嗅觉受体有关)、gαt(已知用于与视紫红质联合在视网膜中转导视觉信号)、gαq(已知刺激磷脂酶c)或gα12/13家族(已知调节细胞骨架、细胞连接以及与细胞运动有关的其它过程)。在本发明的优选实施方式中，gα蛋白选自以下蛋白：gαi1、gαi2、gαi3、gαo1、gαo2、gαq、gα12、gα13、gαs、gαz、gαt1、gαt2、gα11、gα14、gα15、gα16和gαgus蛋白，优选选自gαi1、gαi2和gαi3蛋白。在本发明的意义中，术语“全gα蛋白”是指与gtp或者不可水解或可缓慢水解的gtp或者gdp结合的gα蛋白。因此，此术语既指与gdp结合的gα蛋白(“结合gdp的全gα蛋白”)也指与gtp或不可水解或可缓慢水解的gtp结合的gα蛋白(“结合gtp的全gα蛋白”)。全gα蛋白(结合gdp或gtp)如图1所示。术语“gdp”是指二磷酸鸟苷。术语“gtp”是指三磷酸鸟苷。术语“gtp源”是指提供gtp和/或不可水解或可缓慢水解的gtp的化合物，例如gtp本身和/或不可水解或可缓慢水解的gtp本身。术语“gdp源”是指提供gdp的化合物，例如gdp本身。术语“不可水解或可缓慢水解的gtp”是指不水解或些微水解为gdp的gtp类似物。实例包括gtpgammas(cas号37589-80-3)、gppnhp(cas号148892-91-5)或gppcp(cas号10470-57-2)。术语“gtpgs”或“gtpγs”为术语“gtpgammas”的缩写。在本发明的意义中，术语“空gα蛋白”是指未结合gtp或gdp或不可水解或可缓慢水解的gtp的gα蛋白。空gα蛋白在文献中被描述为结合gdp的全形式与结合至gtp的全形式或结合至不可水解或可缓慢水解的gtp的全形式之间的过渡状态。空gα蛋白如图1所示。在本发明的意义中，术语“膜制剂”是指包含携带(或在其表面上表达)一种或多种gpcr以及一种或多种gα蛋白的细胞膜或细胞膜的片段或模拟细胞膜的人工系统的制剂。因此，术语“膜制剂”包括携带(或在其表面上表达)一种或多种gpcr以及一种或多种gα蛋白的全细胞、透性化的全细胞、裂解的细胞、经纯化的细胞膜、以及在纳米圆盘(nanodiscs)(也称为“纳米级磷脂双层”)或洗涤剂混合物中重构并纯化的经纯化的gpcr/gα蛋白复合体。根据本发明的“抗体”可为哺乳动物来源(例如人或小鼠或骆驼科)的抗体、人源化的抗体、嵌合的抗体、重组的抗体。优选为使用本领域技术人员熟知的技术通过基因修饰的细胞重组产生的单克隆抗体。抗体可为任何同种型，例如igg、igm、iga、igd或ige。例如，根据本发明的“抗体片段”可选自片段fv、片段fab、片段fab'、片段fab'-sh、片段f(ab')2、双抗体、单结构域抗体、单链抗体(例如scfv)。术语“单结构域抗体”和“sdab”可互换，是指通过单个可变结构域进行抗原结合的抗体。sdab可为i)包含能够结合抗原的重链可变结构域(hv)或其片段的抗体，或由能够结合抗原的重链可变结构域或其片段组成的抗体，所述重链可变结构域或其片段独立于任何其它可变结构域而结合至抗原；ii)包含能够结合抗原的轻链可变结构域(lv)或其片段的抗体，或由能够结合抗原的轻链可变结构域或其片段组成的抗体，所述轻链的可变结构域或其片段独立于任何其它可变结构域而结合至抗原；或ii)包含能够结合抗原的vhh型(vhh)的重链可变结构域或其片段的抗体，或由能够结合抗原的vhh型的重链可变结构域或其片段组成的抗体，所述vhh型的重链可变结构域或其片段独立于任何其它可变结构域而结合至抗原。在本发明的意义中，术语“能够特异性结合空形式的配体”以及“能够特异性结合全形式的配体”分别是指能够优先结合g蛋白的空形式或全形式的配体。也就是说，分别相对于g蛋白的全形式或空形式而言，对于g蛋白的空形式或全形式具有更好的亲和力(即较小的kd)的配体。例如，选择系数(针对优先识别的形式的kd与针对另一形式的kd之比)至少为系数2。在本发明的意义中，术语“能够组合地特异性结合空gα蛋白的配体”以及“能够组合地特异性结合全gα蛋白的配体”分别意为：1)能够优先结合至gα蛋白的空形式的配体的对，即其中两个配体中的至少一个(单独地或与第二配体组合地)相对于gα蛋白的全形式而言对gα蛋白的空形式具有更好的亲和力(即较小的kd)的配体的对。例如，选择系数(针对空形式的kd与针对全形式的kd之比)至少为系数2。2)能够优先结合至gα蛋白的全形式的配体的对，即其中两个配体中的至少一个(单独地或与第二配体组合地)相对于gα蛋白的空形式而言对gα蛋白的全形式具有更好的亲和力(即较小的kd)的配体的对。例如，选择系数(针对全形式的kd与针对空形式的kd之比)至少为系数2。也可为针对gα蛋白的一种形式能够生成比gα蛋白的另一形式更高的ret信号的配体的对。例如，ret信号比(针对优先识别形式的ret信号与针对其它形式的ret信号之比)至少为系数1.3。在本发明的意义中，术语“能够调控gpcr活化的分子”是指能够激活或抑制gpcr，从而诱导转导或阻止信号经由gpcr从细胞外转导至细胞内的分子。所述分子可为激动剂、拮抗剂、反向激动剂、正变构调节剂或负变构调节剂。在本发明的意义中，术语“测试分子”为能够调控gpcr活化的分子。在本说明书中，术语“分子”在无进一步阐明的情况下既指“能够调控gpcr活化的分子”也指“测试分子”。术语“ret”是指共振能量转移。术语“fret”是指荧光共振能量转移。fret被定义为由供体和能量接受体之间的偶极-偶极相互作用产生的非辐射能量转移。此物理现象要求这些分子之间的能量相容性。这意味着供体的发射谱必须至少部分覆盖受体的吸收谱。根据理论，fret是取决于两种分子(供体和接受体)之间的距离的过程：当这些分子彼此靠近时，将发出fret信号。术语“bret”是指生物发光共振能量转移。在本发明的意义中，术语“配体”是指能够特异性地以及可逆地结合靶分子的分子。在本发明的上下文中，靶分子为空gα蛋白或全gα蛋白。配体可为蛋白性质(例如蛋白或肽)或核苷酸性质(例如dna或rna)的配体。在本发明的上下文中，各种配体有利地选自抗体、抗体片段、肽或适体。在本发明的意义中，配体标记有ret伴侣对的成员。例如如下所述，配体可通过技术人员熟知的方法直接或间接进行标记，但优选地，通过与ret伴侣对的成员共价键合来直接标记配体。术语“ret伴侣对”是指由能量供体化合物(以下称为“供体化合物”)和能量接受体化合物(以下称为“接受体化合物”)组成的对；当它们彼此接近并在供体化合物的激发波长处被激发时，这些化合物发射ret信号。已知对于成为ret伴侣的两种化合物，供体化合物的发射谱必须部分覆盖接受体化合物的激发谱。例如，当使用荧光供体化合物和接受体化合物时使用“fret伴侣对”，或在使用供体生物发光化合物和接受体化合物时使用“bret伴侣对”。术语“ret信号”是指代表供体化合物和接受体化合物之间的ret的任何可测量的信号。例如，fret信号因此可为荧光供体化合物或接受体化合物(当后者为荧光时)的发光强度或发光寿命的变化。术语“容器”是指用于将膜制剂与实施根据本发明的方法所需的试剂混合的试管、板的孔或其它合适的容器。方法根据第一方面，本发明涉及对分子调控g蛋白偶联受体(gpcr)的活化的能力进行测定的方法，所述方法包括以下步骤：a)将以下物质引入第一容器：-携带一种或多种gpcr以及一种或多种g蛋白的膜制剂，-gdp源或gtp源，-用ret伴侣对的第一成员标记的g蛋白α亚基(gα蛋白)的第一配体，以及用ret伴侣对的第二成员标记的gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空gα蛋白或全gα蛋白；b)对第一容器中发射的ret信号进行测量；c)(i)将测试分子以及与步骤a)中相同的试剂引入第二容器中，或(ii)将测试分子引入所述第一容器中；d)对步骤c)中获得的第一容器中或第二容器中发射的ret信号进行测量；e)对步骤b)和步骤d)中获得的信号进行比较；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr反向激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr反向激动剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr反向激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr反向激动剂。根据第二方面，本发明涉及对分子调控g蛋白偶联受体(gpcr)的活化的能力进行测定的方法，所述方法包括以下步骤：a)将以下物质引入第一容器：-携带一种或多种gpcr以及一种或多种g蛋白的膜制剂，-gdp源或gtp源，-用ret伴侣对的第一成员标记的g蛋白α亚基(gα蛋白)的第一配体，以及用ret伴侣对的第二成员标记的gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空gα蛋白或全gα蛋白；-gpcr激动剂；b)对第一容器中发射的ret信号进行测量；c)将测试分子以及与步骤a)中相同的试剂引入第二容器中；d)对步骤c)中获得的第二容器中发射的ret信号进行测量；e)对步骤b)和步骤d)中获得的信号进行比较；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂。本说明书还涉及用于对g蛋白偶联受体(gpcr)的活化进行测量的方法，所述方法包括以下步骤：a)将以下物质引入第一容器：-携带一种或多种gpcr以及一种或多种g蛋白的膜制剂，-gdp源或gtp源，-用ret伴侣对的第一成员标记的g蛋白α亚基(gα蛋白)的第一配体，以及用ret伴侣对的第二成员标记的gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空gα蛋白或全gα蛋白；b)对第一容器中发射的ret信号进行测量；c)(i)将能够调控gpcr活化的分子以及与步骤a)中相同的试剂引入第二容器中，或(ii)将能够调控gpcr活化的分子引入第一容器中；d)对步骤c)中获得的第一容器中或第二容器中发射的ret信号进行测量；e)对步骤b)和步骤d)中获得的信号进行比较，与在步骤b)中获得的信号相比，步骤d)中获得的信号增加或降低表明gpcr活化的调控。本说明书还涉及用于对g蛋白偶联受体制剂(gpcr)中空g蛋白或全g蛋白的出现或消失进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：a)将以下物质引入第一容器：-携带一种或多种gpcr以及一种或多种gα蛋白的膜制剂，-gdp源或gtp源，-用ret伴侣对的第一成员标记的g蛋白α亚基(gα蛋白)的第一配体，以及用ret伴侣对的第二成员标记的gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空gα蛋白或全gα蛋白；b)对第一容器中发射的ret信号进行测量；c)(i)将能够调控gpcr活化的分子以及与步骤a)中相同的试剂引入第二容器中，或者(ii)将能够调控gpcr活化的分子引入第一容器中；d)对步骤c)中获得的第一容器或第二容器中发射的ret信号进行测量；e)对步骤b)和步骤d)中获得的信号进行比较，与步骤b)中获得的信号相比，步骤d)中获得的信号增加或降低表明空g蛋白或全g蛋白的出现或消失。本说明书还涉及对分子调控g蛋白偶联受体(gpcr)的活化的能力进行测定的方法，所述方法包括以下步骤：a)将以下物质引入第一容器：-携带一种或多种gpcr以及一种或多种g蛋白的膜制剂，-gdp源和gtp源，-用ret伴侣对的第一成员标记的g蛋白α亚基(gα蛋白)的第一配体，以及用ret伴侣对的第二成员标记的gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空gα蛋白或全gα蛋白；b)对第一容器中发射的ret信号进行测量；c)(i)将测试分子以及与步骤a)中相同的试剂引入第二容器中，或者(ii)将测试分子引入第一容器中；d)对步骤c)中获得的第一容器中或第二容器中发射的ret信号进行测量；e)对步骤b)和步骤d)中获得的信号进行比较；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr反向激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr反向激动剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr反向激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr反向激动剂。本说明书还涉及对分子调控g蛋白偶联受体(gpcr)的活化的能力进行测定的方法，所述方法包括以下步骤：a)将以下物质引入第一容器：-携带一种或多种gpcr以及一种或多种g蛋白的膜制剂，-gdp源和gtp源，-用ret伴侣对的第一成员标记的g蛋白α亚基(gα蛋白)的第一配体，以及用ret伴侣对的第二成员标记的gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空gα蛋白或全gα蛋白；-gpcr激动剂；b)对第一容器中发射的ret信号进行测量；c)将测试分子以及与步骤a)中相同的试剂引入第二容器中；d)对步骤c)中获得的第二容器中发射的ret信号进行测量；e)对步骤b)和步骤d)中获得的信号进行比较；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂。步骤a)根据本发明的第一方面，步骤a)包括将以下3个要素引入第一容器中：-携带一种或多种gpcr以及一种或多种g蛋白的膜制剂，-gdp源或gtp源，-用ret伴侣对的第一成员标记的g蛋白α亚基(gα蛋白)的第一配体，以及用ret伴侣对的第二成员标记的gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空gα蛋白或全gα蛋白。在第一方面的实施方式中，在步骤a)中，第一容器不包含测试分子。所述第一容器用于测量ret信号的基础水平和/或ret信号的背景噪声。根据本发明的第二方面，步骤a)包括在第一容器中引入以下四个要素：-携带一种或多种gpcr以及一种或多种g蛋白的膜制剂，-gdp源或gtp源，-用ret伴侣对的第一成员标记的g蛋白α亚基(gα蛋白)的第一配体，以及用ret伴侣对的第二成员标记的gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空gα蛋白或全gα蛋白；-gpcr激动剂。在优选的实施方式中，gtp源为不可水解的gtp或可缓慢水解的gtp的来源，优选选自gtpgammas(gtpγs)、gppnhp和gppcp，优选gtpgammas(gtpγs)。在优选的实施方式中，gdp源为gdp。应该理解的是，根据本发明的方法不提供gtp源和gdp源的同时引入。可以以任何次序顺序地或同时地或几乎同时地将不同要素引入容器中。要素的混合使得能够获得适于ret实施的反应溶液。可向容器中添加其它要素，以使溶液适于ret的实施。例如，可添加腔肠素h(苄基腔肠素)或双脱氧腔肠素(deepbluectm)或二氢腔肠素(didhydrocoelenterazine，腔肠素400a)或d-荧光素。配体能够单独地或组合地特异性结合空gα蛋白或全gα蛋白。在第一实施方式中，两种配体中的每一种可特异性地且单独地结合至空gα蛋白或全gα蛋白，即一种配体可在其它配体存在或不存在的情况下特异性结合至空gα蛋白或全gα蛋白。在第二具体实施方式中，两种配体可组合地特异性结合至空gα蛋白或全gα蛋白，即两种配体中的至少一种可仅在另一配体存在的情况下特异性结合至空gα蛋白或全gα蛋白。在具体实施方式中，使用能够单独地或组合地特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源。该实施方式使得能够区分空gα蛋白与结合至gdp的全gα蛋白。在另一具体实施方式中，使用能够单独地或组合地特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源。该实施方式使得能够区分结合至gdp的全gα蛋白与空gα蛋白。在另一具体实施方式中，使用能够单独地或组合地特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源。该实施方式使得能够区分空gα蛋白与结合至gtp和/或不可水解/可缓慢水解的gtp的全gα蛋白。在另一具体实施方式中，使用能够单独地或组合地特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源。该实施方式使得能够区分结合至gtp和/或不可水解/可缓慢水解的gtp的全gα蛋白与空gα蛋白。有利地，gα蛋白选自以下蛋白：gαi1蛋白、gαi2蛋白、gαi3蛋白、gαo1蛋白、gαo2蛋白、gαq蛋白、gα12蛋白、gα13蛋白、gαs蛋白、gαz蛋白、gαt1蛋白、gαt2蛋白、gα11蛋白、gα14蛋白、gα15蛋白、gα16蛋白和gαgus蛋白，优选选自gαi1蛋白、gαi2蛋白和gαi3蛋白。在具体实施方式中，第一配体为肽，第二配体为抗体或抗体片段。例如，第一配体为具有序列ser-ser-arg-gly-tyr-tyr-his-gly-ile-trp-val-gly-glu-glu-gly-arg-leu-ser-arg(seqidno：1)的肽(肽kb1753，其特异性识别与gtp结合的全gα蛋白)，第二配体为抗gαi抗体。例如，抗gαi抗体为来自供应商santacruzbiotechnologies产品#sc13533的抗体(克隆r4，其识别g蛋白的空形式和全形式)。在另一具体实施方式中，第一配体和第二配体为抗体或抗体片段。在具体实施方式中，用于实施根据本发明的方法的抗体选自dsv36s、dsv3s、dsv39s、dsv26s(可根据要求从cisbiobioassays获得dsv抗体)、以及#sc13533。在另一具体实施方式中，第一配体为选自seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8或seqidno：9的序列的sdab，第二配体为抗gαi抗体，例如抗体#sc13533或抗体dsv36s。当然，当第一配体和第二配体结合至gα蛋白时，它们不应该竞争，例如，第一配体和第二配体不结合gα蛋白上的相同表位。本领域技术人员例如根据所选择的激动剂、测试分子和/或根据期望的特性将在调整gpcr激动剂的浓度和测试分子的浓度方面不具有困难。步骤b)根据本发明的三个方面，步骤b)包括测量在第一容器(即在步骤a)中获得的容器)中发射的ret信号。测量的信号对应于在测试分子不存在的情况下在容器中获得的信号。测量可通过本领域技术人员熟知的常规方法进行，并且不存在任何特殊问题。通常使用例如具有tr-fret或生物发光读取模式的pherastarfs酶标仪(bmglabtech)的设备来检测和测量ret信号。步骤c)根据本发明的第一方面：-在实施方式中，步骤c)包括将与步骤a)中相同的试剂和测试分子引入第二容器。有利地，第二容器以与第一容器相同的方式制备，唯一的区别为在第二容器中存在测试分子。该实施方式是有利的，因为它允许同时测量第一容器和第二容器中发射的ret信号。该实施方式还允许同时测量一个或多个第二容器中发射的ret信号。因此，该实施方式特别有利，因为它允许平行测试若干个不同的分子。-在另一实施方式中，步骤c)包括将测试分子引入第一容器。该实施方式具有仅使用一个容器来实施根据本发明的方法的优点。在具体实施方式中，以逐渐增加的浓度引入测试分子以改变信号降低或增加的幅度。根据本发明的第二方面，步骤c)包括将与步骤a)中相同的试剂和测试分子引入第二容器。有利地，第二容器以与第一容器相同的方式制备，唯一的区别为在第二容器中存在测试分子。因此，同时进行第一容器和第二容器中发射的ret信号的测量。这也允许同时测量一个或多个第二容器中发射的ret信号。这允许平行测试若干个不同的分子。在具体实施方式中，以逐渐增加的浓度引入测试分子或gpcr激动剂以改变信号降低或增加的幅度。步骤d)根据本发明的三个方面，步骤d)包括对步骤c)中获得的第一容器或第二容器中发射的ret信号进行测量。测量的信号对应于在测试分子存在的情况下容器中获得的信号(对于第二方面为±激动剂)。如在步骤b)中一样，测量可通过本领域技术人员熟知的常规方法进行，并且不存在任何特殊问题。通常使用例如具有tr-fret或生物发光读取模式的pherastarfs酶标仪(bmglabtech)的设备来检测和测量ret信号。步骤e)根据本发明的三个方面，步骤e)包括对步骤b)和步骤d)中获得的信号进行比较。技术人员可容易地比较步骤b)和步骤d)中的信号，并定义阈值以允许其限定增加或降低，例如信号之间的差异大于5％、大于10％、大于15％、大于20％或大于25％。例如，可计算步骤b)和步骤d)中的信号之间的比。通常，对于给定的配体对，信号之间的差异越大，信号之间的比将越大，gpcr活化的调控(例如激活或抑制)越强。然而，信号之间的差异可根据用于实施根据本发明的方法的配体对而变化。gpcr活化的调控水平使得能够在一定程度上鉴别激动剂、拮抗剂、反向激动剂、正变构调节剂或负变构调节剂分子。根据第一方面：-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr反向激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr反向激动剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr反向激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr反向激动剂。根据第二方面：-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr激动剂或正变构调节剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gdp源时，信号降低表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gdp源时，信号增加表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂；-当使用能够特异性结合空gα蛋白的配体以及gtp源时，信号降低表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂；-当使用能够特异性结合全gα蛋白的配体以及gtp源时，信号增加表明所述分子为gpcr拮抗剂或负变构调节剂。用ret伴侣对的成员标记配体可直接或间接标记配体。用ret伴侣对的成员(例如当使用fret时为荧光化合物)对配体进行的直接标记通过本领域技术人员已知的常规方法，基于所述配体上存在的反应基团而进行。例如，当配体为抗体或抗体片段时，可使用以下反应基团：氨基末端基团、天冬氨酸的羧基基团和谷氨酸的羧基基团、赖氨酸的氨基基团、精氨酸的胍基基团、半胱氨酸的巯基基团、酪氨酸的酚基基团、色氨酸的吲哚环、蛋氨酸的硫醚基团、组氨酸的咪唑基团。反应基团能够与ret伴侣对的成员携带的反应基团形成共价键。ret伴侣对的成员携带的合适的反应基团是技术人员熟知的，例如，用马来酰亚胺基团官能化的供体化合物或接受体化合物将例如能够与蛋白或肽(例如抗体或抗体片段)携带的半胱氨酸所携带的巯基基团共价结合。类似地，带有n-羟基琥珀酰亚胺酯的供体/接接受体化合物将能够共价结合至蛋白或肽中含有的胺基。也可用荧光化合物或生物发光化合物间接标记配体，例如，通过向测量介质中引入自身共价结合至接受体/供体化合物的抗体或抗体片段，该第二抗体或抗体片段特异性识别所述配体。另一种非常经典的间接标记方法包括：将生物素连接至待标记的配体上，然后在标记有接受体/供体化合物的链霉亲和素存在的情况下孵育这一生物素化的配体。合适的生物素化的配体可通过技术人员熟知的技术制备；例如，cisbiobioassays以商品名“d2”出售的荧光团标记的链霉亲和素(项目610sadla)。在本发明的上下文中，第一配体和第二配体各自标记有ret伴侣对的成员，所述对的一个成员为荧光供体化合物或发光供体化合物，所述对的另一成员为荧光接受体化合物或非荧光接受体化合物(猝灭剂)。用于fret实施标记在具体实施方式中，第一配体和第二配体各自标记有fret伴侣对的成员(即，荧光供体化合物或荧光能量接受化合物)。选择fret伴侣对来获得fret信号在技术人员的能力范围内。例如，可用于研究fret现象的供体-接受体对在josephr.lakowicz的工作(principlesoffluorescencespectroscopy，第二版，338)中描述，技术人员可以加以参考。荧光供体化合物长寿命(>0.1ms，优选0.5ms-6ms)的能量供体荧光化合物、尤其是稀土螯合物(chelates)或穴状化合物(cryptates)是有利的，因为它们允许时间分辨的fret而无需处理测量介质发出的大部分背景噪声。由于此原因，通常优选所述能量供体荧光化合物来实施根据本发明的方法。有利地，这些化合物为镧系元素配合物(complexes)。这些配合物(例如螯合物或穴状化合物)特别适于作为能量供体fret对的成员。铕(eu3+)、铽(tb3+)、镝(dy3+)、钐(sm3+)、钕(nd3+)、镱(yb3+)或铒(er3+)的配合物也是适于本发明的稀土配合物，其中特别优选铕(eu3+)和铽(tb3+)配合物。已描述了大量稀土配合物，数种稀土配合物目前正由perkinelmer、invitrogen和cisbiobioassays销售。适于本发明的目的的稀土螯合物或穴状化合物的实例为：·包含一个或多个吡啶单元的镧系元素穴状化合物。此类稀土穴状化合物描述于例如专利ep0180492、ep0321353、ep0601113和国际申请wo01/96877中。铽(tb3+)穴状化合物和铕(eu3+)穴状化合物特别适合于本发明的目的。镧系元素穴状化合物由cisbiobioassays销售。此类化合物的实例是下式的铕穴状化合物(可通过反应基团将其偶联至待标记的化合物，在此情况下，反应基团例如为nh2基团)，但不限于此：·专利us4,761,481、us5,032,677、us5,055,578、us5,106,957、us5,116,989、us4,761,481、us4,801,722、us4,794,191、us4,637,988、us4,670,572、us4,837,169、us4,859,777中具体描述的镧系元素螯合物。专利ep0403593、us5,324,825、us5,202,423、us5,316,909中描述了由九齿(nonadentate)配体(例如三联吡啶)组成的螯合物。镧系元素螯合物由perkinelmer销售。·也可使用由螯合剂(如四氮杂环十二烷)形成的镧系元素配合物，所述配合物用具有芳环的发色团取代(如pooler.等在biomol.chem，2005，3，1013-1024“synthesisandcharacterisationofhighlyemissiveandkineticallystablelanthanidecomplexessuitableforusageincellulo”中所描述的配合物)。还可使用申请wo2009/10580中描述的配合物。·还可使用在专利ep1154991和ep1154990中描述的镧系元素穴状化合物。·下式的铽穴状化合物(可通过反应基团将其偶联至待标记的化合物，在该情况下，反应基团例如为nh2基团)：其合成在国际申请wo2008/063721中有描述(化合物6a，第89页)。·来自于lumiphore的铽穴状化合物lumi4-tb，由cisbiobioassays出售。·下式的来自于researchorganics的量子染料(可通过反应基团将其偶联至待标记的化合物，在该情况下，反应基团为ncs)：·钌螯合物，特别是由钌离子及若干个联吡啶组成的配合物，例如三(2,2'-联吡啶)钌(ii)。·下式的铽螯合物dtpa-cs124tb，由lifetechnologies出售(可通过反应基团r将其偶联至待标记的化合物)，其合成在专利us5,622,821中有描述。·下式的铽螯合物，其由latva等(journalofluminescence1997，75(2)：149-169)描述：有利地，荧光供体化合物是选自以下化合物的fret伴侣：铕穴状化合物、铕螯合物、铽螯合物、铕穴状化合物、钌螯合物、量子点、别藻蓝蛋白、罗丹明、花青素(cyanins)、方酸菁(squarains)、香豆素、原黄素(proflavins)、吖啶、荧光素(fluoresceins)、硼-二吡咯亚甲基衍生物和硝基苯并噁二唑。特别有利地，荧光供体化合物为选自以下化合物的fret伴侣：铕穴状化合物、铕螯合物、铽螯合物、铽穴状化合物、钌螯合物和量子点；特别优选铕螯合物和铕穴状化合物以及铽螯合物和铽穴状化合物。荧光接受体化合物荧光接受体化合物可选自以下组：别藻蓝蛋白，尤其是已知的商品名为xl665的别藻蓝蛋白；发光有机分子，例如罗丹明、花青素(例如cy5)、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硼-二吡咯亚甲基衍生物(以“bodipy”出售)、被称为“atto”的荧光团、被称为“dy”的荧光团、被称为“alexa”的化合物、和硝基苯并噁二唑。有利地，荧光接受体化合物选自于别藻蓝蛋白、罗丹明、花青素、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硼-二吡咯亚甲基衍生物和硝基苯并噁二唑术语“花青素”和“罗丹明”分别应理解为“花青素衍生物”和“罗丹明衍生物”。技术人员熟悉可商购的这些不同的荧光团。“alexa”化合物由invitrogen出售；“atto”化合物由attotec出售；“dy”化合物由dyomics出售；“cy”化合物由amershambiosciences出售；其它化合物由多个化学试剂供应商(如sigma、aldrich或acros)出售。可将以下荧光蛋白用作荧光接受体化合物：cya荧光蛋白(amcyan1、midori-ishicyan、mtfp1)，绿色荧光蛋白(egfp、acgfp、turbogfp、emerald、azamigreen、zsgreen)，黄色荧光蛋白(eyfp、topaz、venus、mcitrine、ypet、phiyfp、zsyellow1、mbanana)，橙色和红色荧光蛋白(orangekusibari、morange、tdtomato、dsred、dsred2、dsred-express、dsred-monomer、mtangerine、asred2、mrfp1、jred、mcherry、mstrawberry、hcred1、mraspberry、hcred-tandem、mplim、aq143)，远红外荧光蛋白(mkate、mkate2、tdkatushka2)。有利地，荧光接受体化合物为选自以下化合物的fret伴侣：别藻蓝蛋白，罗丹明，花青素，方酸菁，香豆素，原黄素，吖啶，荧光素，硼-二吡咯亚甲基衍生物，硝基苯并噁二唑和量子点；gfp，选自gfp10、gfp2和egfp的gfp变体；yfp，选自eyfp、yfptopaz、yfpcitrine、yfpvenus和ypet的yfp变体；morange；dsred。用于bret的实施的标签在具体实施方式中，第一配体和第二配体各自标记有bret伴侣对的成员(即，发光供体化合物或荧光能量接受化合物)。可直接或间接标记配体。用发光供体化合物或蛋白型荧光接受体化合物(bret伴侣对的成员)对配体进行的直接标记可通过技术人员已知的经典方法，特别是在tarikissad和ralfjockers的文章(bioluminescenceresonanceenergytransfertomonitorprotein-proteininteractions,transmembranesignalingprotocolspp195-209，methodsinmolecularbiologytm书系列mimb的部分，第332卷)中所描述的方法进行。用有机分子型荧光受体化合物(bret伴侣对的成员)对配体进行的直接标记可通过技术人员已知的经典方法，基于上述配体上的反应基团的存在而进行。例如，当配体为抗体或抗体片段时，可使用以下反应基团：氨基末端基团、天冬氨酸的羧基基团和谷氨酸的羧基基团、赖氨酸的氨基基团、精氨酸的胍基基团、半胱氨酸的巯基基团、酪氨酸的酚基基团、色氨酸的吲哚环、蛋氨酸的硫醚基团、组氨酸的咪唑基团。反应基团能够与bret伴侣对的成员携带的反应基团形成共价键。bret伴侣对的成员携带的合适的反应基团是技术人员熟知的，例如，用马来酰亚胺基团官能化的接受体化合物将能够与蛋白或肽(例如抗体或抗体片段)携带的半胱氨酸所携带的巯基基团共价结合。类似地，带有n-羟基琥珀酰亚胺酯的受体化合物将能够共价结合至蛋白或肽中含有的胺基。也可用生物发光化合物或荧光化合物间接标记配体，例如，通过向测量介质中引入自身共价结合至接受体/供体化合物的抗体或抗体片段，该第二抗体或抗体片段特异性识别所述配体。另一种非常经典的间接标记方法包括：将生物素连接至待标记的配体上，然后在标记有受体/供体化合物的链霉亲和素存在的情况下孵育这一生物素化的配体。合适的生物素化的配体可通过技术人员熟知的技术制备；例如，cisbiobioassays以商品名“d2”出售的荧光团标记的链霉亲和素(项目610sadla)。选择bret伴侣对来获得bret信号在技术人员的能力范围内。例如，可用于研究bret现象的供体-受体对在dasielo.borroto-escuela的文章(bioluminescenceresonanceenergytransfer(bret)methodstostudygprotein-coupledreceptor-receptortyrosinekinaseheteroreceptorcomplexes，cellbiol.2013；117：141-164)中特别描述，技术人员可以加以参考。发光供体化合物在具体实施方式中，发光供体化合物为选自以下化合物的bret伴侣：荧光素酶(luc)、海肾荧光素酶(renillaluciferase，rluc)、海肾荧光素酶的变体(rluc8)以及萤火虫荧光素酶。荧光接受体化合物在具体实施方式中，荧光接受体化合物为选自以下化合物的bret伴侣：别藻蓝蛋白，罗丹明，花青素，方酸菁，香豆素，原黄素，吖啶，荧光素，硼-二吡咯亚甲基衍生物，硝基苯并噁二唑，量子点；gfp，gfp变体(gfp10、gfp2和egfp)；yfp，yfp变体(eyfp、yfptopaz、yfpcitrine、fpvenus、ypet)、morange、dsred。试剂盒本发明还涉及用于实施根据本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：-用ret伴侣对的第一成员标记的g蛋白α亚基(gα蛋白)的第一配体，以及用ret伴侣对的第二成员标记的gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空gα蛋白或全gα蛋白；-一套说明书。在具体实施方式中，试剂盒进一步包含gdp源或gtp源。在具体实施方式中，试剂盒进一步包含gα蛋白和/或携带一种或多种gpcr以及一种或多种g蛋白的膜制剂。试剂盒还可包含用于试剂的稀释缓冲液。实施例用于获得抗gαi1蛋白抗体的方案重组tst-gαi1蛋白(经由tev接头在n末端标签有twinstreptag(tst)标签(iba)的uniprot序列p63096-1的gαi1蛋白)在sf9昆虫细胞(感染有编码所述蛋白的杆状病毒)中产生，然后经由twinstreptag(tst)标签在亲和柱(strep-tactinsuperflow高容量树脂(iba，目录：2-1208-002))上进行纯化。通过注射在含有gtpgs的缓冲液(hepes20mmph8、nacl100mm、mgcl23mm、chaps11mm、gtpgs100μm)中预先稀释的tst-gαi1蛋白，对balb/c小鼠进行免疫。第一次注射后以一个月的间隔给予三个加强剂量(boosters)。每次注射后15天，对小鼠进行血液穿刺以检查免疫应答的存在。为此目的，建立了elisa测试。tst-gαi1蛋白经由twinstreptag标签吸附在含有(iba，目录：2-4101-001)的96孔板上，所述tst-gαi1蛋白在含有gtpgs的缓冲液(trishcl20mmph8.5、nacl140mm、edta2mm、mgcl210mm、bsa0.1％、gtpgs1μm)中被预先稀释至20μg/ml。为此，在每孔中加入100μl蛋白，并在37℃下孵育2h，然后在缓冲液(pbs1×，0.05％tween20)中洗涤3次。然后，以100μl/孔加入倍数为10-1亿的血液穿刺连续稀释液，并在37℃下孵育2小时。通过在1×pbs，0.05％tween20缓冲液中的3个洗涤步骤，去除未结合蛋白的抗体，然后使用结合至hrp(辣根过氧化物酶)的鼠抗fc二抗(sigma#a0168，在pbs(0.1％bsa)中1/10,000稀释)进行结合的抗体的检测。在37℃下孵育1小时并然后在1×pbs，0.05％tween20缓冲液中洗涤3次后，在室温搅拌下将hrp与其tmb底物(3,3',5,5,5'-四甲基联苯胺，sigma#t0440)孵育20分钟后，通过比色分析在450nm处测定hrp。为了确保通过elisa测试检测到的抗体为针对gαi1蛋白而非针对twinstreptag，在与过量的标记有twinstreptag(snaptag-twinstrpetag)的另一正交蛋白预孵育后，用elisa测试对相同的穿刺进行了测试。从而，抗标签抗体结合至标记的正交蛋白，因此不结合至附着至孔的底部的gαi1蛋白，在此情况下未检测到hrp信号或hrp信号下降。选择在抗标签对照的情况下具有最佳抗体滴度和最低信号下降的小鼠用于下一步淋巴细胞杂交(也称为融合)。回收小鼠的脾，并在聚乙二醇型细胞融合催化剂的存在下，将来自该脾的淋巴细胞和浆细胞的混合物与骨髓瘤细胞系体外融合。使用缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hgprt)这一酶的突变型骨髓瘤细胞系以允许杂交细胞(称为杂交瘤)的选择。将这些细胞在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤(甲氨蝶呤)和胸腺嘧啶的培养基(hat培养基)中进行培养以允许未融合的骨髓瘤细胞的消除，从而选择感兴趣的杂交瘤。未融合的脾细胞死亡，因它们无法在体外增殖。从而，仅杂交瘤存活。然后使这些杂交瘤在培养板中生长。然后测试这些杂交瘤的上清液以评估其产生抗gαi1蛋白抗体的能力。为此目的，进行了如上所述的elisa测试。为评价抗体在gαi1蛋白的不同形式(结合gdp的全形式、结合gtpgs的全形式、空形式)之间的选择性，在含有1μmgdp、1μmgtpgs或无核苷酸的缓冲液中预孵育的tst-gαi1蛋白条件下平行进行测试。然后用有限的稀释步骤克隆最佳的杂交瘤以获得杂交瘤克隆。然后将感兴趣的杂交瘤克隆注射进中小鼠(腹腔注射)以允许在腹水中大量产生抗体。然后用含有蛋白a的树脂通过柱上的亲和色谱对抗体进行纯化。将由此获得的单克隆抗体用例如如上所述的荧光探针进行标记以用于本发明的方法。材料-表达所研究的受体和gαi蛋白的细胞膜购自perkinelmer。下表列出了使用的不同样品的项目编号和细胞系：受体细胞系供应商项目编号δ阿片hek293perkinelmer6110549400uaδ阿片cho-k1perkinelmerrbhodm400ua甘丙肽r1(galr1)hek293perkinelmer6110537400uanop(orl-1)hek293perkinelmerrbhorlm400ua5ht1ahek293-ebnaperkinelmerrbhs1am400ua-抗gαi抗体sc13533购自santacruzbiotechnology(目录号sc13533)。该抗体并不特异性结合gα蛋白的三种形式(空gα蛋白、结合至gdp的全gα蛋白以及结合至gtp或不可水解或可缓慢水解的gtp的全gα蛋白)。-dsv36s抗体、dsv3s抗体、dsv39s抗体、dsv26s抗体由cisbiobioassays生成，并可根据需求从cisbiobioassays获得(以相应的产品编号dsv36s、dsv3s、dsv39s、dsv26s)。用兼容的荧光探针标记抗体以用于tr-fret检测(red-d2受体或lumi4tb供体)。生物素化的肽kb1753由cisbiobioassays生成。·相对于gdp和空gα蛋白的形式，dsv36s抗体特异性结合gαgtp蛋白或不可水解或可缓慢水解的gtpgα蛋白的形式。·相对于gdp和gtp或非可水解或可缓慢水解的gtp的形式，dsv3s抗体特异性结合空gα蛋白的形式。·相对于gdp和gtp或非可水解或可缓慢水解的gtp的形式，dsv26s抗体特异性结合空gα蛋白的形式。·dsv39s抗体并不特异性结合gα蛋白的三种形式(空gα蛋白、结合至gdp的全gα蛋白以及结合至gtp或不可水解或可缓慢水解的gtp的全gα蛋白)。·相对于gdp和空gα蛋白的形式，肽kb1753特异性结合gαgtp蛋白或不可水解或可缓慢水解的gtpgα蛋白的形式。·相对于gdp和空gα蛋白的形式，配体对肽kb1753/抗gαi抗体sc13533特异性结合gαgtp蛋白或不可水解或可缓慢水解的gtpgα蛋白的形式。·相对于gdp和空gα蛋白的形式，配体对抗gαi抗体dsv36s/抗gαi抗体sc13533特异性结合gαgtp蛋白或不可水解或可缓慢水解的gtpgα蛋白的形式。·相对于gdp和空gα蛋白的形式，配体对抗gαi抗体dsv39s/抗gαi抗体sc13533特异性结合gαgtp蛋白或不可水解或可缓慢水解的gtpgα蛋白的形式。·相对于gdp和空gα蛋白的形式，配体对抗gαi抗体dsv3s/抗gαi抗体dsv36s特异性结合gαgtp蛋白或不可水解或可缓慢水解的gtpgα蛋白的形式。·相对于gαgdp蛋白以及gαgtp蛋白或不可水解或可缓慢水解的gtpgα蛋白的形式，配体对抗gαi抗体dsv39s/抗gαi抗体dsv26s特异性结合空gα蛋白的形式。-用红色受体xl665标记的链霉亲和素由cisbiobioassays生成(目录号610saxlb)。-gtp、gdp和gtpγs核苷酸购自sigmaaldrich(目录号分别为g8877、g7127和g8634)。-gpcrδ阿片激动剂snc162以及gpcrδ阿片拮抗剂纳曲吲哚购自tocris(目录号分别为1529和0740)。-384孔小容量白色板(具有白色背景)购自greinerbioone(目录号784075)。方法-试剂的制备：将所有试剂在trishcl50mmph7.4、mgcl210mm、nacl10mm，bsa0.1％缓冲液中稀释。将膜制备为4×以分配为1μg/孔(其它规格除外)。将gdp、gtp或gtpγs核苷酸与测试化合物(激动剂或拮抗剂)预先混合并制备为4×以获得图表中提到的孔中的最终浓度。将用于检测的所有抗gαi试剂制备为4×以靶向以下孔中的以下最终浓度：sdab-d2(50nm)、抗体sc13533-d2(0.1nm)、抗体sc13533-lumi4tb(0.25nm)、抗体dsv36s-d2(0.1nm)、抗体dsv36s-lumi4tb(0.25nm)、抗体dsv3s-d2(10nm)、抗体dsv39s-d2(10nm)、抗体dsv26s-lumi4tb(0.25nm)、与链霉亲和素-xl665(sa-xl)(25nm)组合的肽kb1753-生物素(50nm)(在板中分配前在室温下预孵育30分钟)。-384孔板中试剂的分配：表达gpcr和g蛋白的膜：5μl核苷酸(gdp或gtp或gtpγs)±测试化合物(激动剂和/或拮抗剂)：5μl抗gαi接受体配体(d2或xl665)：5μl抗gαi供体配体(lumi4tb)：5μl用仅含有两种检测试剂(用供体和接受体标记)的孔测量非特异性信号(背景荧光噪声)，其它组分由它们的稀释缓冲液替代。-读取htrf信号：将平板在21℃孵育3h或20h，然后用以下配置在pherastar读取器(bmglabtech)上测量htrf信号：模块：htrf(激发337nm、发射665nm和620nm)激发：激光，40次闪烁读取窗口：延迟：60μs-积分：400μs-信号处理：来自665nm和620nm处的原始信号，根据以下公式计算htrf比：htrf比＝665nm处的信号/620nm处的信号*10,000测试形式图3a说明了空gα蛋白形式与结合gdp的全gα蛋白形式之间的区分(形式1a)。在通过gpcr激动剂激活gpcr和gα蛋白后，使用标记有ret伴侣的两种配体特异性检测空gα蛋白形式比例的增加。gpcr的活化导致ret信号增加。图3b说明了结合gdp的全gα蛋白形式与空gα蛋白形式的区分(形式1b)。在通过gpcr激动剂激活gpcr和gα蛋白后，使用标记有ret伴侣的两种配体特异性检测结合gdp的全gα蛋白形式比例的降低(由于空gα蛋白的比例增加)。gpcr的活化导致ret信号减少。图3c说明了空gα蛋白形式与结合至gtp或结合至gtpγs的全gα蛋白形式的区分(形式2a)。在通过gpcr激动剂激活gpcr和gα蛋白后，使用标记有ret伴侣的两种配体特异性检测空gα蛋白形式比例的降低。gpcr的活化导致ret信号增加。图3d说明了结合至gtp或结合至gtpγs的全gα蛋白形式与空gα蛋白形式的区分(形式2b)。在通过gpcr激动剂激活gpcr和gα蛋白后，使用标记有ret伴侣的两种配体特异性检测结合至gtp或结合至gtpγs的全gα蛋白形式比例的降低(由于空gα蛋白形式的比例增加)。gpcr的活化导致ret信号降低。实施例1至实施例4-根据形式2b的活化测试：用标记有tr-fret伴侣的检测配体对区分gtp或gtpγs形式与空形式区分首先，使用表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的hek293细胞膜对检测配体对特异性检测结合至gtp或结合至gtpγs的全gα蛋白与空gα蛋白的能力进行证明。用过量的gtpγs(10μm)孵育膜以允许向g蛋白加载核苷酸(结合至gtpγs的全gα蛋白形式)或仅加载缓冲液(空gα蛋白形式)。观察到的这两个条件之间的tr-fret信号(htrf比)的差异表明，使用的4种检测配体对(肽kb1753-生物素/sa-xl/抗gαi抗体sc13533-lumi4tb-实施例1/图4a、抗gαi抗体dsv36s-d2/抗gαi抗体sc13533-lumi4tb-实施例2/图5a、抗gαi抗体dsv39s-d2/抗gαi抗体sc13533-lumi4tb-实施例3/图6a、抗gαi抗体dsv3s-d2/抗gαi抗体dsv36s-lumi4tb-实施例4/图7a)可区分结合至gtpγs的gα蛋白形式和空gα蛋白形式。在第二步中，用相同的膜和检测配体对测试了gpcr激动剂调控处于空形式的gα蛋白的比例的能力。将表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的hek293细胞膜与浓度逐渐增加的gpcr激动剂(snc162)以及gtpγs(10nm)一起孵育。通过用激动剂刺激而引起的tr-fret信号(htrf比)降低意味着空gα蛋白形式的比例增加。因此，由其激动剂激活的gpcr受体导致gtpgs离开g蛋白，然后g蛋白变为空形式并引起tr-fret信号降低。在第二条件下，用固定浓度的gpcr激动剂snc162(10nm)引起的活化被浓度逐渐增加的gpcr拮抗剂(纳曲吲哚)抑制。通过tr-fret信号(htrf比)的增加观测到这种活化抑制。图4b(实施例1)、图5b(实施例2)、图6b(实施例3)和图7b(实施例4，其中未实施第二条件)示出了这些结果。实施例5-根据形式1a的活化测试：用标记有tr-fret伴侣的检测配体对区分空gα蛋白形式与结合至gdp的全gα蛋白形式首先，使用表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的hek293细胞膜对检测配体对特异性检测空gα蛋白形式与结合gdp的全gα蛋白形式的能力进行证实。用过量的gdp(10μm)孵育膜以允许向g蛋白加载核苷酸(结合至gdp的全gα蛋白形式)或仅加载缓冲液(空gα蛋白形式)。观测到的这两个条件之间的tr-fret信号(htrf比)的差异表明，使用的检测配体对(抗gαi抗体dsv39s-d2+抗gαi抗体dsv26s-lumi4tb-图8a)使得能够区分空gα蛋白形式与结合至gdp的全gα蛋白形式。在第二步中，用相同的膜和相同的检测配体对测试了gpcr激动剂调控处于空形式的g蛋白的比例的能力。将表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的hek293细胞膜与浓度逐渐增加的gpcr激动剂(snc162)以及gdp(10μm)一起孵育。通过用激动剂刺激而产生的tr-fret信号(htrf比)的增加意味着处于空形式的g蛋白的比例增加。因此，由其激动剂活化的gpcr受体使得g蛋白的gdp离开g蛋白，然后g蛋白变为空形式并增加tr-fret信号。在第二条件下，用固定浓度的gpcr激动剂snc162(10nm)引起的活化被浓度逐渐增加的gpcr拮抗剂(纳曲吲哚)抑制。通过tr-fret信号(htrf比)的降低观测到这种活化抑制。图8b中示出了这些结果。实施例6-根据形式2a的活化测试：用标记有tr-fret伴侣的检测配体对区分空形式与gtp或gtpγs形式首先，使用表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的hek293细胞膜对检测配体对特异性检测空gα蛋白形式与结合至gtp或结合至gtpγs的全gα蛋白形式的能力进行证实。用过量的gtpγs(10μm)孵育膜以允许向g蛋白加载核苷酸(结合至gtpγs的全gα蛋白形式)或仅加载缓冲液(空gα蛋白形式)。观测到的这两个条件之间的tr-fret信号(htrf比)的差异表明，使用的检测配体对(抗gαi抗体dsv39s-d2+抗gαi抗体dsv26s-lumi4tb-图9a)使得能够区分空gα蛋白形式与结合至gtpγs的全gα蛋白形式。在第二步中，用相同的膜和相同的检测配体对测试了gpcr激动剂调控处于空形式的g蛋白的比例的能力。将表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的hek293细胞膜与浓度逐渐增加的gpcr激动剂(snc162)以及gtpγs(10nm)一起孵育。通过用激动剂刺激而产生的tr-fret信号(htrf比)的增加意味着处于空形式的g蛋白的比例增加。因此，由其激动剂活化的gpcr受体使得gtpgs离开g蛋白，然后g蛋白变为空形式并导致tr-fret信号增加。在第二条件下，用固定浓度的激动剂snc162(10nm)引起的活化被浓度逐渐增加的gpcr拮抗剂(纳曲吲哚)抑制。通过tr-fret信号(htrf比)的降低观测到这种活化抑制。图9b中示出了这些结果。实施例7-在不同的gpcr和细胞系上的活化测试的验证(形式2b：用标记有tr-fret伴侣(肽kb1753-biotine/sa-xl/抗gαi抗体sc13533-lumi4tb)的检测配体对区分结合至gtp或结合至gtpγs的全gα蛋白形式与空gα蛋白形式)在四种不同的gpcr(δ阿片、甘丙肽r1、nop、5ht1a)以及两种不同的细胞系(hek293和cho-k1)上验证了活化检测的原理。一方面，将表达δ阿片gpcr或galr1(甘丙肽受体)或nop(nociceptin受体)或5ht1a以及gαi蛋白的hek293细胞的膜(10μg/孔)仅与gtpγs(100nm)一起孵育，或者将其与gtpγs(100nm)和饱和固定浓度(1μm)的受体激动剂(分别为snc162、甘丙肽、nociceptin和5-羟色胺)组合孵育。对于4种gpcr，通过用受体激动剂刺激而产生的tr-fret信号(htrf比)的降低意味着处于空形式的g蛋白的比例增加。因此，由其激动剂活化的gpcr受体使得gtpgs离开g蛋白，然后g蛋白变为空形式并导致tr-fret信号降低。在仅与gtpγs孵育的膜条件下一个受体与另一受体的信号差异可通过不同膜制剂中gαi蛋白的表达水平的差异来解释。类似地，在不同的gpcr之间观测到的信号调制幅度的差异可能是由于gαi蛋白或gpcr的表达水平的差异。另一方面，将表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的hek293细胞或cho-k1细胞的膜(10μg/孔)仅与gtpγs(100nm)一起孵育或者与gtpγs(100nm)和饱和固定浓度(1μm)的受体激动剂(snc162)的组合一起孵育。对于这两种细胞系，通过用激动剂刺激而产生的tr-fret信号(htrf比)的降低意味着处于空形式的g蛋白的比例增加。因此，由其激动剂活化的gpcr受体转而激活g蛋白，然后g蛋白变为空形式并且导致tr-fret信号降低。图10中示出了这些结果。实施例8-就用检测配体对(抗gαi抗体dsv39s-d2+抗gαi抗体dsv26s-lumi4tb)进行的根据形式2a(区分空gα蛋白形式与结合至gtp或结合至gtpγs的全gα蛋白形式)的活化测试，对gtpγs和gtp进行比较将表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的hek293细胞的膜(1μg/孔)仅与gtpγs或gtp(50nm、1000nm或20000nm)一起孵育，或者与gtpγs或gtp(50nm、1000nm或20000nm)和饱和固定浓度(1μm)的gpcr激动剂(snc162)的组合一起孵育。对于两种核苷酸gtpγs和gtp，通过用激动剂刺激而产生的tr-fret信号(htrf比)的增加意味着处于空形式的g蛋白的比例增加。因此，由其激动剂活化的gpcr受体使得gtp或gtpgs离开g蛋白，然后g蛋白变为空形式并导致tr-fret信号增加。如果两个条件(gtpγs和gtp)对于检测激动剂对gpcr的活化均起作用，用gtpγs观测到的信号调控幅度显著优于用gtp。信号调控幅度的这些差异可通过结合至gtp的全gα蛋白形式的不稳定(即gtp水解为gdp)来解释。图11中示出了这些结果。实施例9-根据形式2b的活化测试：用标记有tr-fret伴侣的抗体对(抗gαi抗体sc13533-d2/抗gαi抗体dsv36s-lumi4tb)区分全gαi形式(gtp或gtpγs)与空gαi形式首先，使用表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的hek293细胞膜对检测配体对特异性检测结合至gtp或结合至gtpγs的全gα蛋白与空gα蛋白的能力进行证实。用过量的gtpγs(10μm)孵育膜以允许向g蛋白加载核苷酸(结合至gtpγs的全gα蛋白形式)或仅加载缓冲液(空gα蛋白形式)。观测到的这两个条件之间的tr-fret信号(htrf比)的差异表明使用的检测配体对(抗gαidsv36s-lumi4tb/抗gαisc13533-d2)可区分结合至gtpγs的gα蛋白形式与空gα蛋白形式(图12a)。在第二步中，用相同的膜和检测配体对测试了gpcr激动剂调控处于空形式的gα蛋白的比例的能力。在第一条件下，将表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的hek293细胞膜与浓度逐渐增加的gpcr激动剂(snc162)以及gtpγs(10nm)一起孵育。通过用激动剂刺激而产生的tr-fret信号(htrf比)的降低意味着空gα蛋白形式的比例增加。因此，由其激动剂活化的gpcr受体导致gtpgs离开g蛋白，然后g蛋白变为其空形式并降低tr-fret信号。在第二条件下，将表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的hek293细胞膜与gtpγs(10nm)、固定浓度的gpcr激动剂snc162(10nm)以及浓度逐渐增加的gpcr拮抗剂(纳曲吲哚)进行孵育。因此，当拮抗剂的浓度增加时，由激动剂引起的活化从而被抑制。通过tr-fret信号(htrf比)的增加观测到这种活化抑制。图12b中示出了结果。实施例10-根据形式2b的活化测试：用tr-fret伴侣标记的配体对由空gαi形式区分全gαi形式(gtp或gtpγs)使用了8对配体：-抗gαisdabf11(seqidno：2)/抗gαi抗体sc13533；-抗gαisdabf4(seqidno：3)/抗gαi抗体sc13533；-抗-gαisdabg6(seqidno：4)/抗-gαi抗体sc13533；-抗gαisdabb11(seqidno：5)/抗gαi抗体sc13533；-抗gαisdabf9(seqidno：6)/抗gαi抗体sc13533；-抗gαisdabg7(seqidno：7)/抗gαi抗体sc13533；-抗gαisdaba10(seqidno：8)/抗gαi抗体dsv36s；-抗gαisdabe2(seqidno：9)/抗gαi抗体sc13533。首先，使用表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的hek293细胞膜对配体对特异性检测结合至gtp或结合至gtpγs的全gαi蛋白与空gαi蛋白的能力进行了证实。用过量的gtpγs(10μm)孵育膜以允许向gα蛋白加载核苷酸(结合至gtpγs的全gα蛋白形式)或仅加载缓冲液(空gα蛋白形式)。观测到的这两个条件之间的tr-fret信号(htrf比)的差异表明使用的8种检测配体对(抗gαisdabf11-d2/抗gαisc13533-lumi4tb抗体–图13a、抗gαisdabf4-d2/抗gαisc13533-lumi4tb抗体–图14a、抗gαisdabg6-d2/抗gαi抗体sc13533-lumi4tb-图15a、抗gαisdabb11-d2/抗gαi抗体sc13533-lumi4tb-图16a、抗gαisdabf9-d2/抗gαi抗体sc13533-lumi4tb-图17a、抗gαisdabg7-d2/抗gαi抗体sc13533-lumi4tb-图18a、抗gαisdaba10-d2/抗gαi抗体dsv36s-lumi4tb-图19a、抗gαisdabe2-d2/抗gαi抗体sc13533-lumi4tb-图20a)使得能够区分结合至gtpγs的全gα蛋白形式与空gα蛋白形式。在第二步中，用表达δ阿片gpcr和gαi蛋白的hek293细胞膜以及上述8种配体对，通过测量处于空形式的gα蛋白的比例对gpcr激动剂调控gpcr的活化的能力进行了测试。在第一条件下，将膜与浓度逐渐增加的gpcr激动剂(snc162)以及gtpγs(10nm)一起孵育。通过用激动剂刺激而产生的tr-fret信号(htrf比)的降低意味着空gα蛋白形式的比例增加。由其激动剂活化的gpcr受体使得gtpgs离开gα蛋白，然后gα蛋白变为其空形式并导致tr-fret信号降低。在第二条件下，将膜与gtpγs(10nm)、固定浓度的gpcr激动剂snc162(10nm)以及浓度逐渐增加的gpcr拮抗剂(纳曲吲哚)进行孵育。因此，当拮抗剂的浓度增加时，由激动剂引起的活化从而被抑制。通过tr-fret信号(htrf比)的增加观测到这种活化抑制。图13b、图14b、图15b、图16b、图17b、图18b和图19b中示出了结果(在图19b中未实施第二条件)。序列表<110>cisbiobioassaycisbiobioassays<120>用于测量对g蛋白偶联受体活性的调控的方法<130>1h305110-0013<160>9<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>prt<213>人工序列<220><223>肽kb1753<400>1serserargglytyrtyrhisglyiletrpvalglyglugluglyarg151015leuserarg<210>2<211>143<212>prt<213>人工序列<220><223>f11<400>2gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysglualaserglyphealapheseraspthr202530trpmettyrtrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alathrilethrargglyaspglnasnthrtyrtyrthrgluserval505560lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnthrleutyr65707580leuglnmetasnserleulyssergluaspthralavaltyrtyrcys859095alalysgluglyproileglyproproasptyrtrpglyglnglythr100105110glnvalthrvalserseralaalaalagluglnlysleuileserglu115120125gluaspleuasnglyalaalahishishishishishisglyser130135140<210>3<211>143<212>prt<213>人工序列<220><223>f4<400>3gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530tyrmetasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045serseriletyrasnglyaspglyaspthrasptyrseraspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnthrvaltyr65707580leuglumetseraspleulysvalglnaspthralailetyrtyrcys859095asnalatyraspglythrleuleuargasptyrtrpglyglnglythr100105110glnvalthrvalserseralaalaalagluglnlysleuileserglu115120125gluaspleuasnglyalaalahishishishishishisglyser130135140<210>4<211>145<212>prt<213>人工序列<220><223>g6<400>4gluvalglnleuvalgluserglyglyaspleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserthrtyr202530argmetasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alaserileserserargglyilethrthrasptyralahisproval505560lysglyargphethrvalserargaspasnthrlysasnthrleutyr65707580leuglnmetasnserleulysproaspaspalaalavaltyrtyrcys859095alathraspproserthrtrptyrargglythralahistrpglygln100105110glythrglnvalthrvalserseralaalaalagluglnlysleuile115120125serglugluaspleuasnglyalaalahishishishishishisgly130135140ser145<210>5<211>143<212>prt<213>人工序列<220><223>b11<400>5gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheasnasptyr202530trpmettyrtrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045serserileasnthrglyglyserserthrtyrtyrseraspserval505560lysglyargphethrthralaargaspasnalalysasnserleutyr65707580leuglnleuasnserleuargprogluaspthralavaltyrtyrcys859095alalysgluglyprovalglyproproasptyrtrpglyglnglythr100105110glnvalthrvalserseralaalaalagluglnlysleuileserglu115120125gluaspleuasnglyalaalahishishishishishisglyser130135140<210>6<211>145<212>prt<213>人工序列<220><223>f9<400>6gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheaspasptyr202530alametasntrpvalargglnalaalaglylysglyproglutrpval354045alaserileserserargglyilethrthrasptyralahisserval505560lysglyargphethrvalserargaspasnthrlysasnthrleutyr65707580leuglnmetasnserleulysproaspaspalaalavaltyrtyrcys859095alathraspproserthrtrptyrargglythralahistrpglygln100105110glythrglnvalthrvalserseralaalaalagluglnlysleuile115120125serglugluaspleuasnglyalaalahishishishishishisgly130135140ser145<210>7<211>148<212>prt<213>人工序列<220><223>g7<400>7glnvalglnleuglngluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesertrptyr202530glymetsertrpvalargglnalaproglylysglyproglutrpval354045alaserileserserargglyilethrthrasptyralahisserval505560lysglyargphethrvalserargaspasnthrlysasnthrleutyr65707580leuglnmetasnserleulysprogluaspthrglyvaltyrtyrcys859095thrargvalleutrptyraspserglyalatyrserleuasnaspphe100105110trpglyglnglythrglnvalthrvalserseralaalaalaglugln115120125lysleuileserglugluaspleuasnglyalaalahishishishis130135140hishisglyser145<210>8<211>142<212>prt<213>人工序列<220><223>a10<400>8gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuarg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