检测炎症的方法与流程

本发明涉及检测炎症的方法，更具体地，涉及通过测量对象血液中淀粉样蛋白的水平检测早期炎症的方法。

背景技术：

全球疾病负担正在从传染病(communicabledisease)转移到非传染病，例如糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、心血管疾病和癌症，所有的这些疾病都与慢性低级别炎症有关。此外，目前死于这些疾病的人中有约80％生活在发展中国家，这对资源匮乏和勉强维持的发展中国家的卫生系统构成了特别的威胁。因此，有必要研究将炎症与这些疾病联系起来的标志物以及开发低成本的早期检测方法。

淀粉样蛋白是一类与许多炎性病症有关的标志物。这些病症称为淀粉样变性疾病(amyloidogenicdisease)，其特征在于体内形成淀粉样斑块或淀粉样沉积物。术语淀粉样蛋白是指由于正常可溶性蛋白质通过自缔合过程聚集而形成的高度有序且不可溶的蛋白质。在体内，该过程与确保有效蛋白质合成和折叠的系统故障有关。淀粉样沉积物可以是脑的(例如阿尔茨海默病和亨廷顿病)，或外周的(例如轻链淀粉样变性和2型糖尿病)。淀粉样蛋白可影响任何器官或组织，但是肾、胰腺、肝、脾、神经组织和心脏构成了患有外周淀粉样变性的患者中主要的沉积部位。

几种促炎基因产物已经被确定为淀粉样蛋白形成的诱导物，一个例子是血清淀粉样蛋白a(serumamyloida，saa)。saa是由肝脏合成的急性期蛋白质家族的总称，其主要受炎症相关的细胞因子-肽激素信号调节。由癌症、心血管疾病、类风湿性关节炎、细菌感染和组织损伤引起的炎症可导致saa水平升高1000倍。因此，测量saa水平以确定对象中的炎症程度是有利的。当前，可以使用酶联免疫吸附测定(elisa)和质谱法(ms)检测saa水平。但是，这些方法灵敏度差、极其昂贵且耗时，这可能限制其应用，尤其是在资源不足的临床环境中。此外，由于其灵敏度低，这些方法可能仅能够在saa水平大幅升高的晚期疾病状态下检测saa水平。因此，存在着与以前可用的方法相比以更高的灵敏度检测对象中saa水平的新方法的空间。

在淀粉样蛋白相关的和其他炎性疾病的治疗领域中遇到的一个问题是无法在疾病进展的早期阶段检测或量化淀粉样蛋白。迄今为止，尚未开发出可以在患有淀粉样蛋白相关病症的患者中快速、定量地检测低水平的淀粉样蛋白的令人满意的方法。因此，难以准确地监测患者对治疗的响应。需要一种可以在这样的患者中检测低水平炎症的方法。

前面对本发明背景的讨论仅旨在促进对本发明的理解。应当理解，该讨论并不承认或认可所涉及的任何材料在本申请的优先日时是本领域公知常识的一部分。

技术实现要素：

根据本发明的第一方面，提供了一种检测对象中的炎症的方法，所述方法包括在获自对象的血液样品中测定存在于纤维蛋白(原)(fibrin(ogen))中的淀粉样蛋白的量，以及基于测定的纤维蛋白(原)淀粉样蛋白的量指定对象中的炎症水平。

可以如下测定纤维蛋白(原)淀粉样蛋白的量：使血液样品与结合淀粉样蛋白的荧光标志物接触，使样品中的淀粉样蛋白与标志物结合，测量淀粉样蛋白与标志物结合后发出的荧光，以及基于测得的荧光确定淀粉样蛋白的量。

可以通过将测得的荧光与参考进行比较来确定淀粉样蛋白的量。参考可以是一个或更多个预定值、图表或图。

当血液样品中的纤维蛋白(原)淀粉样蛋白的量大于阈值的情况下，可以诊断该对象患有炎症。纤维蛋白(原)淀粉样蛋白阈值水平可以比健康对象的纤维蛋白(原)淀粉样蛋白的血液水平大2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300，400、500、600、700、800、900或1000倍。

纤维蛋白(原)淀粉样蛋白的量可与血液样品中血清淀粉样蛋白a(saa)、失调的细胞因子和/或炎症原(inflammogen)的水平相关联，并且这些分子的水平(浓度)可与对象中的炎症水平相对应。

当血液样品中的saa水平大于阈值时，可以诊断出该对象患有炎症。阈值可以比健康对象中saa血液水平大2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000倍，其可以是30至30,000微克/ml之间的任意值，例如30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000或30000微克/ml。

炎症可以是早期炎症，并且可以指示对象中的疾病状态或疾病前状态。所述疾病可以选自高凝状态(hypercoagulation)、癌症、阿尔茨海默病、帕金森病、糖尿病(i型或ii型)、亨廷顿病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、淀粉样变性、家族性淀粉样多发性神经病、家族性肾淀粉样变性、血液透析有关的淀粉样变性、脑淀粉样血管病、淀粉样蛋白轻链(al)淀粉样变性、包涵体肌炎、巨细胞关节炎、冠心病、白塞病(behcet’sdisease)、镰状细胞贫血、免疫性血小板减少性紫癜(immunethrombocytopaenicpurpura)、人类免疫缺陷病毒(hiv)、卒中、先兆子痫、炎症相关的血栓形成、炎性肠病和克罗恩病。

所述疾病可以是癌症，并且所述癌症可以是癌前或早期癌症。

对象可以没有炎症或疾病的症状。

荧光标志物可以选自硫黄素t(thiofiavint)、niad-4、发光缀合低聚噻吩(luminescentconjugatedoligothiophene，lco)和刚果红。

荧光可以通过分光光度计、二极管阵列检测器或荧光检测器来测量。荧光可以通过共聚焦显微镜测量并且通过图像处理软件定量。可以将检测到的荧光与参考荧光值进行比较以确定样品中纤维蛋白(原)淀粉样蛋白的水平。

血液样品可以是全血或血浆。

根据本发明的第二方面，提供了检测对象中的炎症的方法，所述方法包括通过在获自所述对象的血液样品中测定存在于纤维蛋白(原)中的淀粉样蛋白的量来确定所述血液样品中的血清淀粉样蛋白a(saa)的量，以及基于saa的量指定所述对象中的炎症水平。

可以如下测量淀粉样蛋白的量：使所述血液样品与结合淀粉样蛋白的荧光标志物接触，使所述样品中的淀粉样蛋白与所述标志物结合，测量所述淀粉样蛋白与所述标志物结合后发出的荧光，以及基于所测得的荧光指定淀粉样蛋白的量。

可以通过将淀粉样蛋白的量与参考进行比较来确定saa的量。参考可以是一个或更多个预定值、图表或图。

炎症可以是早期炎症。当血液样品中saa的量为30至30,000微克/ml的情况下，则可以诊断所述对象患有早期炎症。

早期炎症可指示对象中的疾病状态或疾病前状态。所述疾病可以选自：高凝状态、癌症、阿尔茨海默病、帕金森病、糖尿病(i型或ii型)、亨廷顿病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、淀粉样变性、家族性淀粉样多发性神经病、家族性肾淀粉样变性、血液透析有关的淀粉样变性、脑淀粉样血管病、淀粉样蛋白轻链(al)淀粉样变性、包涵体肌炎、巨细胞关节炎、冠心病、白塞病、镰状细胞贫血、免疫性血小板减少性紫癜、人类免疫缺陷病毒(hiv)、卒中、先兆子痫、炎症相关的血栓形成、炎性肠病和克罗恩病。

疾病、荧光标志物和荧光测量可以如上文所定义。

可以将检测到的荧光与具有相关saa水平的预定荧光值的标准曲线进行比较，以确定样品中saa的水平。

根据本发明的第三方面，提供了确定治疗性处理对于对象的效果的方法，所述方法包括：在治疗性处理之前根据上述方法检测对象中的炎症以获得治疗前炎症水平；在治疗性处理之后根据上述方法检测对象中的炎症以获得治疗后炎症水平；以及将治疗前和治疗后炎症水平进行比较以确定所述治疗的效果。

所述方法还可包括获得多个治疗后炎症水平，其每一个可以在治疗后以间隔开的时间间隔获得，以随时间监测所述治疗的效果。

如果治疗后炎症水平低于治疗前炎症水平，则可以确定所述治疗是成功的。

附图说明

图1是在硫黄素t(tht)、480和680的存在下，凝结的贫血小板血浆(ppp)的一系列共聚焦图像：第一列-480；第二列-680；第三列-tht。a至c：健康血液；d至f：炎症血液。

图2是来自480的共聚焦凝块图像中像素强度的变异系数(cv)分布的箱图(中值变异系数和std在图上方显示)。炎症的淀粉样源性血液(amyloidogenicblood)的数据与健康对照的显著不同(p＜0.0001)。

图3是来自680的共聚焦凝块图像中像素强度的变异系数(cv)分布的箱图(中值变异系数和std在图上方显示)。炎症的淀粉样源性血液的数据与健康对照的显著不同(p＜0.0001)。

图4是来自tht的共聚焦凝块图像中像素强度的变异系数(cv)分布的箱图(中值变异系数和std在图上方显示)。炎症的淀粉样源性血液的数据与健康对照的显著不同(p＜0.0001)。

图5显示了来自bmi为23的健康个体的血浆在暴露于癌细胞之前和之后的代表性的共聚焦显微图，其使用了3种淀粉样蛋白标志物。a)初始(naive)健康全血；b)暴露于培养的癌细胞后的同一个体的血浆。

图6显示了来自bmi为27.1的健康个体的血浆在暴露于癌细胞之前和之后的代表性共聚焦显微图，其使用了3种淀粉样蛋白标志物。a)初始健康全血；b)暴露于培养的癌细胞后的同一个体的血浆。

图7是用480获得的初始细胞(nc)和与癌细胞接触的细胞(细胞)的变异系数(cv)的图。垂直线表示标准偏差。

图8是用680获得的初始细胞(nc)和与癌细胞接触的细胞(细胞)的变异系数(cv)的图。垂直线表示标准偏差。

图9是用tht获得的初始细胞(nc)和与癌细胞接触的细胞(细胞)的变异系数(cv)的图。垂直线表示标准偏差。

具体实施方式

本发明提供了监测对象中的炎症，特别是早期炎症的方便、非侵入性的方法。本发明还提供了监测炎性疾病的消退、进展或治疗以及评估治疗剂和治疗方案的效果的手段。

方法包括在获自对象的血液样品中测定存在于纤维蛋白(原)中的淀粉样蛋白的量，以及基于测定的纤维蛋白(原)淀粉样蛋白的量确定对象中的炎症水平。与健康个体中的纤维蛋白(原)结构相比，所有炎性病症中纤维蛋白(原)淀粉样蛋白结构显著上调。纤维蛋白(原)淀粉样蛋白包括折叠不正确或以其他方式处于异常状态的纤维蛋白(原)，其折叠不正确或处于异常状态。作为淀粉样蛋白存在的纤维蛋白(原)的比例可以与对象中的炎症程度相关。高水平的炎症对应于高水平的淀粉样蛋白，而低水平的炎症对应于低水平的淀粉样蛋白。

本发明的方法可以辅助早期检测与炎性疾病相关的炎症的存在，有助于确定预后，明确治疗选择方案，并能够合理地评估治疗反应，因为降低炎症将使得循环系统中失调的炎症标志物降低，而后者是导致纤维蛋白(原)中异常淀粉样蛋白形成的这些蛋白质变化的原因。

本文所用的术语“纤维蛋白(原)”应理解为是指“纤维蛋白原和/或纤维蛋白”，如本领域通常已知的。

可以如下测定纤维蛋白(原)淀粉样蛋白的量：使血液样品与结合淀粉样蛋白的荧光标志物接触，使样品中的淀粉样蛋白与标志物结合，测量淀粉样蛋白与标志物结合后发出的荧光，以及基于测得的荧光确定淀粉样蛋白的量。将凝血酶添加到样品中以诱导纤维蛋白(原)形成和血液凝结。

可以通过将荧光与参考进行比较来确定淀粉样蛋白的量。参考可以是一个或更多个预定值，例如先前从所述对象或从其他对象获得的荧光值。每个预定值可以与淀粉样蛋白的量相关联，通过该方法可以从其推导出淀粉样蛋白的量。或者，参考可以是图表或图，其包含荧光或炎症的水平(或从其推导的值)以及相关淀粉样蛋白量，或荧光量，通过该方法从其推导出淀粉样蛋白的量。在一个示例性实施方案中，参考可以是将荧光的量与淀粉样蛋白的量相关联的标准曲线上的预定值。

当血液样品中淀粉样蛋白的量大于阈值水平的情况下，可以诊断出该对象患有炎症。阈值纤维蛋白(原)淀粉样蛋白的水平可以比健康对象中纤维蛋白(原)淀粉样蛋白的血液水平大2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000倍。

纤维蛋白(原)淀粉样蛋白的量可与血液样品中的血清淀粉样蛋白a(saa)、失调的细胞因子和/或源自细菌细胞壁或膜成分的循环炎症原的水平相关联，并且saa的水平也可对应于对象中的炎症水平。通过淀粉样蛋白的量与saa或其他合适的炎症标志物的水平相关联，可量化对象中的炎症程度。同样，可以由所测淀粉样蛋白的量来确定样品中saa的量，例如，通过将淀粉样蛋白的量与参考进行比较。参考可以是预定值、图表或图。可以基于saa的量来指定对象中的炎症水平。

当血液样品中saa的量大于阈值水平时，可以诊断出该对象患有炎症。阈值saa水平可以比健康对象中saa的血液水平大2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000倍。健康对象中血液saa水平通常为5至30微克/ml，并且阈值水平可以是30至30,000微克/ml之间的任意值，例如30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000或30000微克/ml的saa。阈值水平可以提供为30至30,000μg/ml之间的值的范围，例如30-1000μg/ml、50-1000μg/ml、100-1000μg/ml、500-1000μg/ml、1000-2000μg/ml、2000-3000μg/ml、3000-4000μg/ml、4000-5000μg/ml、5000-6000μg/ml、6000-7000μg/ml、7000-8000μg/ml、8000-9000μg/ml、9000-10000μg/ml、10000-11000μg/ml、11000-12000μg/ml、12000-13000μg/ml、13000-14000μg/ml、14000-15000μg/ml、15000一16000μg/ml、16000-17000μg/ml、17000-18000μg/ml、18000-19000μg/ml、19000-20000μg/ml、20000-21000μg/ml、21000-22000μg/ml、22000-23000μg/ml、23000-24000μg/ml、24000-25000μg/m1、25000-26000μg/ml、26000-27000μg/ml、27000-28000μg/ml、28000-29000μg/ml、29000-30000μg/ml、1000-5000μg/ml、5000-10000μg/ml、10000-15000μg/ml、15000-20000μg/ml、20000-25000μg/ml或25000-30,000μg/ml。

炎症可以是早期炎症，可以指示对象中的疾病状态或疾病前状态。该疾病可以选自：高凝状态、癌症、阿尔茨海默病、帕金森病、糖尿病(i型或ii型)、亨廷顿病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、淀粉样变性、家族性淀粉样多发性神经病、家族性肾淀粉样变性、血液透析有关的淀粉样变性、脑淀粉样血管病、淀粉样蛋白轻链(al)淀粉样变性、包涵体肌炎、巨细胞关节炎、冠心病、白塞病、镰状细胞贫血、免疫性血小板减少性紫癜、人类免疫缺陷病毒(hiv)、卒中、先兆子痫、炎症相关的血栓形成、炎性肠病和克罗恩病。疾病可以是癌症，该癌症可以是癌前或早期癌症。

样品中淀粉样蛋白的量与saa的浓度的关联可用于诊断对象中的炎症的阶段。低于30μg/ml的saa水平被认为是健康和正常的；高于30μg/ml但低于10,000μg/ml的saa水平表明早期炎症；高于10,000μg/ml的saa水平表明存在晚期炎症，其可包括存在脓毒症。早期炎症可以指示可以为癌前或早期癌症的癌症。大于或等于20,000μg/ml的saa水平可表明晚期癌症，5,000至20,000μg/ml的saa水平可表明早期癌症，而低于5000μg/ml的saa水平则可以表明癌前。也可以通过将淀粉样蛋白的量与指示炎症阶段或癌症阶段的参考进行比较来确定炎症和/或癌症的阶段。

癌前是指与癌症风险升高有关的细胞形态紊乱的状态。其也被称为0期癌症或原位癌，是尚未进展成攻击性、侵袭性阶段的非侵袭性癌症。这些类型的癌症位于其起源位置并且尚未扩散到其他组织。早期癌症是指1期癌症，其与尚未深入生长到附近组织中的小肿瘤有关。其通常没有扩散到淋巴结或身体的其他部位。可以通过所述方法检测的其他癌症阶段包括2期和3期，其特征是已经深入生长到附近组织中并且可能已经扩散到淋巴结但没有扩散到身体的其他部位的较大癌症或肿瘤，以及4期，其中癌症已经扩散到其他器官或身体其他部位。4期也称为晚期或转移性癌症。

该方法适合在没有炎症或疾病症状的对象中检测早期炎症。特别地，所述对象可能没有可检测的脓毒症或感染，并且在癌症的情况下，可能没有可检测的肿瘤。

术语“癌症”是指皮肤组织、器官、血液和血管的疾病，包括但不限于：膀胱癌、骨癌、血癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、胸癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头癌、肾癌、肝癌、淋巴结癌、肺癌、口腔癌、颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、睾丸癌、喉癌和子宫癌。特定癌症包括但不限于：晚期恶性肿瘤、淀粉样变性、成神经细胞瘤、脑膜瘤、血管外皮细胞瘤、多发性脑转移癌(multiplebrainmetastase)、多形性胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforms)、胶质母细胞瘤、脑干胶质瘤、预后不良的恶性脑肿瘤、恶性胶质瘤、复发性恶性胶质瘤、间变性星形细胞瘤、间变性少突胶质细胞瘤(anaplasticoligodendroglioma)、神经内分泌肿瘤、直肠腺癌、dukesc和d结直肠癌、不可切除的结直肠癌、转移性肝细胞癌、卡波西肉瘤(kaposi′ssarcoma)、karo型急性髓细胞白血病(karotypeacutemyeloblasticleukemia)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、皮肤b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、低级滤泡性淋巴瘤、恶性黑色素瘤、恶性间皮瘤、恶性胸腔积液间皮瘤综合征(malignantpleuraleffusionmesotheliomasyndrome)、腹膜癌、乳头状浆液性癌、妇科肉瘤、软组织肉瘤、硬皮病、皮肤血管炎、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(langerhanscellhistiocytosis)、平滑肌肉瘤、纤维增生骨化进展(fibrodysplasiaossificansprogressive)、激素难治性前列腺癌、切除的高风险软组织肉瘤、不可切除的肝细胞癌、瓦氏巨球蛋白血症(waldenstrom′smacroglobulinemia)、郁积性骨髓瘤(smolderingmyeloma)、惰性骨髓瘤(indolentmyeloma)、输卵管癌、雄激素非依赖性前列腺癌，雄激素依赖性iv期非转移性前列腺癌、激素不敏感性前列腺癌、化疗不敏感性前列腺癌、乳头状甲状腺癌、滤泡性甲状腺癌、甲状腺髓样癌和平滑肌瘤。术语“癌症”包括实体瘤和血源性肿瘤二者。

方法中使用的荧光标志物可以选自硫黄素t、niad-4[化学名称：2-((5′-(4-羟基苯基)-2，2′-联噻吩-5-基)亚甲基)丙二腈]、发光缀合低聚噻吩(lco)和刚果红[化学名称：4-氨基-3-[4-(4-(1-氨基-4-磺酰基-萘-2-基)二氮烯基苯基]苯基]二氮烯基-萘-1-磺酸二钠]。lco可以选自下表1中提供的结构或其盐或游离酸。

表1：所选lco的化学结构

lco可以是激发范围为405-458nm且检测范围为470-550nm的480，激发为458nm或488nm且检测范围为500-650nm的515，激发为458nm或488nm且检测范围为500-650nm的545，或激发范围为530-565nm且检测范围为600-800nm的680。

荧光可以通过分光光度计、二极管阵列检测器或荧光检测器来测量。在一些实施方案中，荧光可以使用共聚焦显微镜测量并通过图像处理软件定量。在一个典型的实施方案中，使血液样品与荧光标志物接触，并使标志物与样品中的淀粉样蛋白结合并形成缀合物。使样品暴露于合适波长的激光激发以诱导标志物-淀粉样蛋白缀合物发荧光。获取图像并通过合适的软件(例如zeisszen或imagej(fiji)软件)对图像中的荧光进行定量。

血液样品可以是全血或血浆。在一些实施方案中，可以通过离心来将全血澄清化，并将所得贫血小板血浆用于所述方法。在另一些实施方案中，无需澄清即可使用全血。

本发明延伸至确定治疗性处理对于对象的效果的方法，所述方法包括：在治疗性处理之前根据上述方法检测对象中的炎症以获得治疗前炎症水平；在治疗性处理之后根据上述方法检测对象中的炎症以获得治疗后炎症水平；以及将治疗前和治疗后炎症水平进行比较以确定所述治疗对于所述对象的效果。

所述方法还可包括确定多个治疗后炎症水平，其每一个可以在治疗后以间隔开的时间间隔获得，以随时间监测所述治疗的效果。

如果治疗后炎症水平低于治疗前炎症水平，或者如果治疗后炎症水平高于治疗前炎症水平但是低于在不进行治疗的情况下所预期的水平，则可以确定治疗是成功的。本发明的这方面可用于监测涉及淀粉样蛋白上调的疾病的消退、进展或治疗，以及评估治疗剂和治疗方案对炎症的效果。治疗性处理可以是适合该疾病的任何适当的治疗。在对象患有由癌症引起的炎症的一些实施方案中，治疗性处理可以是放射疗法、化学疗法、免疫疗法、靶向疗法、激素疗法或干细胞移植。

在一些实施方案中，炎症的水平可以在量表上评分并给出定性值。在一些替代实施方案中，可以基于对象血液中淀粉样蛋白的量，通常是浓度、浓度范围或淀粉样蛋白形成的速率，为炎症水平指定定量值。在一些实施方案中，炎症量表可以是癌症的不同期的量表，例如可以为0至4期癌症分配不同水平的淀粉样蛋白。

重要的是，本发明的方法利用血液测试而不是活检来确定炎症。这样可以回避与活检相关的风险、不适和不便。与用于检测炎症和相关疾病的现有方法相比，本发明还更便宜、更快速并且具有更高的灵敏度。此外，使用纤维蛋白(原)淀粉样蛋白作为检测早期炎症的生物标志物可以对许多可能潜在威胁生命的炎性疾病进行敏感的早期诊断，从而增加成功治疗的前景。

现在将通过以下非限制性实施例更详细地描述本发明。

实施例

实施例1

在柠檬酸盐管中制备了二十份健康的全血(wholeblood，wb)样品和二十种具有低级别炎症的淀粉样源性血液样品。贫血小板血浆(plateletpoorplasma，ppp)用于共聚焦和超分辨率分析。通过将wb在3000xg下离心15分钟来制备贫血小板血浆(ppp)。将硫黄素t(tht)、480或680二种荧光标志物之一添加到ppp中来检测淀粉样蛋白的形成。将管孵育30分钟，tht的终浓度为5μm和和680(100μlppp中0.1μl)。

允许形成凝块，并在共聚焦显微镜下观察。在共聚焦显微镜上观察凝块之前，按1∶2的比例添加凝血酶(5μl凝血酶：10μlppp)并且形成了广泛的纤维蛋白网。凝血酶由南非国家血液管理局(southafricannaionalbloodservice)提供，凝血酶溶液的浓度为20u/ml，并且由含有0.2％人血清白蛋白的生物缓冲液制备。将盖玻片放在制备的凝块上，并使用具有plan-apochromat63x/1.4oildic物镜的zeisslsm510meta共聚焦显微镜观察样品。对于tht，使用的激发激光为488nm，并且在508nm至570nm测量发射；对于480，使用405nm激光并且在478nm至539nm测量发射；并且对于680，使用561nm激光并且在597nm至695nm测量发射。捕获制备的凝块的选择的显微图。在zeisszen软件中将三种荧光标志物各自的荧光信号捕获为composite.czi文件，并使用imagej(fiji)分割通道。使用imagej(fiji)中的直方图函数评估了三种荧光标志物中每种的(黑色)背景和荧光像素之间的差异(二进制比较)。将得到的变异系数(cv)(作为sd/平均值)计算为十进制，以量化和区分健康初始ppp凝块和淀粉样源性血液的凝块。使用statsdirect(2.8.0版)软件通过mann-whitneyu检验进行样品分析。

在tht、amytracker^tm480和amytracker^tm680的存在下，对健康凝结的ppp进行共聚焦分析显示了偶尔的小块荧光(见图1a至c)。但是，当用凝血酶处理淀粉样源性血液时，全部三种标志物的荧光都显著增加(图1d至f)。这证明了标志物与纤维蛋白(原)淀粉样蛋白的结合，并表明可以检测到淀粉样蛋白形成。

统计(变异系数，cv)数据如图2-4所示。这些数据提供了对具有低级别炎症对象的淀粉样源性血液中纤维蛋白(原)淀粉样蛋白的定量测量。显示了来自三种不同标志物-480(图2)、680(图3)和tht(图4)的数据。

可以通过在标准曲线上绘制荧光量并读取与该荧光量相对应的淀粉样蛋白浓度来计算淀粉样蛋白的量。通过将淀粉样蛋白的水平与多个预定浓度范围进行比较，其中每个浓度范围具有相关的炎症水平，淀粉样蛋白水平转而又可以与炎症水平正相关。此外，由于saa是淀粉样蛋白形成的诱导物，因此可以根据存在的淀粉样蛋白的量确定血液中saa的水平。然后可以根据血液中存在的saa水平来确定炎症水平。

实施例2

为了证明通过测量来自对象的血液样品中的淀粉样蛋白可检测对象中的癌症，将来自21个个体的初始健康细胞与转移性人乳腺腺癌细胞系mda-mb-231细胞接触。在早期癌症中，随着癌细胞在对象的血液中转移并释放高水平的saa和其他炎症原，癌细胞会诱导健康细胞成为高凝状态或淀粉样蛋白生成状态。saa诱导淀粉样蛋白的形成，而这可以测量。通过用结合淀粉样蛋白的荧光标志物(和凝血酶以诱导纤维蛋白形成)处理血液并测量荧光，可以确定血液中纤维蛋白(原)蛋白质中存在的淀粉样蛋白结构的量。基于存在的淀粉样蛋白的量，可以确定血液中存在的saa的水平。基于存在的淀粉样蛋白或saa的量和检测到的癌症可以确定对象的炎症水平。

根据以下方案，使用共聚焦显微镜测量淀粉样蛋白的形成：对初始全血(wb)和暴露于人乳腺腺癌细胞系mda-mb-231细胞的wb进行离心以获得贫血小板血浆(ppp)。将ppp与荧光标志物一起孵育30分钟，所述荧光标志物为终浓度为5μm的tht，或amytracker^tm480或amytracker^tm680(100μlppp中0.1μl)。在共聚焦显微镜上观察凝块之前，以1∶2的比例添加凝血酶((5μl凝血酶∶10μlppp)以产生广泛的纤维蛋白网。凝血酶溶液的浓度为20u.ml^-1，并在含有0.2％人血清白蛋白的pbs中制备。将盖玻片放在制备的凝块上，并使用具有plan-apochromat63x/1.4oildic物镜的elyraps1共聚焦显微镜的zeisslsm780观察样品。对于tht，使用488nm激发激光，并且在508至570nm测量发射；对于amytracker^tm480，使用405nm激发激光，并且在478至539nm测量发射；并且对于amytracker^tm680，使用561nm激发激光，并且在597至695nm测量发射。捕获制备的凝块的选择的显微图。在所有数据采集期间，增益设置均保持不变，并用于统计分析；但是，为了准备图，对亮度和对比度进行了一些调整。在zeisszen软件中将三种荧光标志物各自的荧光信号捕获为compositelsm文件，然后使用imagej(fiji)来分割和分析rgb通道。

通过评估凝块中三种荧光标志物各自的黑色背景与荧光像素之间的差异(二进制比较)，对每个染色的凝块的荧光进行定量。使用imagej(fiji)中的直方图函数来将不同像素强度的直方图的变异系数(cv)(作为sd/平均值)计算为十进制，以量化和区分健康(年龄控制)初始ppp凝块和通过与癌细胞接触而诱导进入高凝状态的细胞凝块。根据每个直方图中显示的数据计算cv。使用graphpadprism的kruskal-wallis事后检验和dunn多重比较检验进行统计分析。

图5和图6显示了在暴露于癌细胞之前和之后，来自代表性的正常体重指数(bmi)和高bmi个体的血浆中淀粉样蛋白形成的共聚焦显微图。正常和高bmi个体之间没有显著差异，尽管当目视检查显微图像时，高bmi的个体确实显示出略微增加的淀粉样蛋白形成。这可能是由于体重增加引起的潜在全身性炎症。向血浆中添加癌细胞显著增加了纤维蛋白凝块中的淀粉样蛋白区域(这是通过对淀粉样蛋白结构的所有3种荧光标志物的统计分析注意到的)。无论个体的bmi如何，都可以看到所述现象。

变异系数(cv)数据在图7-9中提供，并用于获得表2-4中表示的统计数据。较高的cv值表示较高的淀粉样蛋白形成水平。这些数据提供了与癌细胞接触而引起低级别炎症的血液的淀粉样蛋白形成的量化指标。来自三种不同标志物的数据显示如下：480(表2，图7)，680(表3，图8)和tht(表4，图9)。

表2：经过或未经过处理的初始血液的共聚焦参数的amytracker480结果：nc＝健康的初始对照血液；细胞＝添加了癌细胞的nc血液

表3：经过处理和未经处理的初始血液的共聚焦参数的amytracker680结果：nc＝健康的初始对照血液；细胞＝添加了癌细胞的nc血液

表4：经过处理和未经处理的初始血液的共聚焦参数的tht结果：nc＝健康的初始对照血液；细胞＝添加了癌细胞的nc血液

通过将淀粉样蛋白的水平与多个预定浓度范围进行比较，其中每个浓度范围具有相关的炎症水平，量化的纤维蛋白(原)淀粉样蛋白结构可以与炎症水平正相关。在炎症水平落在针对癌症的预定范围内的情况下，可以检测出癌症。

在整个说明书中，除非内容另外要求，否则词语“包括”或变体诸如“包含”或“含有”将被理解为暗示包括陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。