本发明涉及展示通过洗衣洗涤剂组合物从经洗涤的衣物除去皮脂的方法。
背景技术：
衣物可含有一系列人眼看不见的有机染污物质，这些看不见的污渍包括食品组分、污染物和人皮脂。由于污渍的复杂性质，评价洗衣产品除去各种看不见的污渍的功效是一项挑战性的任务。
人皮脂是包括多种多样的游离脂肪酸、甘油二酯和甘油三酯、蜡酯、胆固醇酯和角鲨烯的组分的复杂混合物。所述组分中的许多是智人特有的，例如顺-6-十六碳烯酸(sapienicacid)是人类特有的，其是皮脂中的主要脂肪酸。当衣物紧贴皮肤穿着时，大量皮脂转移到衣物。转移量取决于衣物类型、天气和穿衣物的人。除去该皮脂是洗衣洗涤剂产品的主要功能。在早期，残留皮脂是肉眼看不见的，经过多个洗涤-穿着循环，其随时间导致衣物变黄和有气味。
bey在fette,seifen,anstrichmittel，1963，第65卷，第611页通过以下分析来自穿过的衣物的皮脂的组成：对穿过的衬衫进行溶剂提取，然后经由与ir光谱、具有火焰电离检测器的气相色谱法和与标准品比较结合的组分的色谱法分析进行分析。
powe(powe,w.c.&marple,w.l.jamoilchemsoc(1960)37:136.)使用以下分析来自穿过的衣物的皮脂的脂肪酸组成：采用各种有机溶剂进行索氏提取(soxhletextraction)，然后碱性水解甘油酯，接着是酯化和气相色谱法分析以及与已知标准品比较。不清楚在该程序中是否也提取了蜡酯和胆固醇酯并包括在脂肪酸分析中。
signemunk等(journalofsurfactantsanddetergents，第3卷，第4期，2000年10月1日)已经使用气相色谱法和具有电子碰撞或化学电离的质谱法测量了洗衣之后的汗水/皮脂的有气味的物质。该文件检测了挥发性化合物，并且该方法不可以检测皮脂中非挥发性的化合物中的大多数。这是由d1的结果说明，其中脂肪酶显示对于结果有很小影响。该文件不是用于测量皮脂组分中的大多数的有效方法。
需要允许化学识别和定量衣物上的皮脂污渍组分，并且进一步比较从衣物除去皮脂的洗衣产品功效的更简单的方法。
技术实现要素：
本发明涉及一种展示通过一种或多种洗衣洗涤剂组合物从经洗涤的衣物除去皮脂的方法，所述方法包括：
a)人类受试者穿着紧贴皮肤的衣物，优选穿着5至100小时的时间，更优选所述衣物穿在身体的上半部分；
b)将穿过的衣物分成2个或更多个相等部分；
c)使用不同的洗衣洗涤剂组合物分别洗涤衣物部分，以使得能够进行比较；
d)将所述衣物部分干燥并储存，优选储存在低于293k的温度下最多96小时；
e)使用选自以下的溶剂对每个衣物部分或其相等部分进行溶剂提取：醇、酮、醚、co2、氯化有机溶剂，优选地，所述溶剂为丙酮或氯仿；
f)取溶剂提取物，并且选择选自以下的方法：
(i)原样使用；除去所有溶剂，然后再溶于溶剂混合物中，该溶剂混合物优选选自醚/醇混合物、氯化有机溶剂/醇、或氯化有机溶剂/醚/醇混合物，最优选地，所述醚为叔丁基甲基醚，所述氯化有机溶剂为氯仿，并且所述醇选自甲醇、乙醇和丙-2-醇；或
(ii)减少溶剂体积以浓缩样品，优选加入叔丁基甲基醚或氯仿以防止沉淀；
g)使用具有高分辨率精确质谱仪的lc-ms测量提取物，优选在提取的0至24小时之内；
h)经由精确质量测定和/或与已知标准品比较，识别所述提取物中存在的化合物；
i)比较每个所述衣物部分的所述溶剂提取物中发现的所识别化合物的浓度，以使得能够在每种测试的洗衣洗涤剂组合物的皮脂去除作用之间进行比较。
在方法步骤c)中，优选地，所述洗衣洗涤剂组合物中的至少一种包含选自烷基醚羧酸盐或脂质酯酶的成分。
优选地，脂质酯酶选自三酰基甘油酯酶(e.c.3.1.1.3)；羧酸酯水解酶(e.c.3.1.1.1)；角质酶(e.c.3.1.1.74)；甾醇酯酶(e.c.3.1.1.13)；蜡酯水解酶(e.c.3.1.1.50)，优选地，脂质酯酶为三酰基甘油酯酶(e.c.3.1.1.3)。
优选地，烷基醚羧酸盐为：
r-(och2ch2)n-och2cooh；
其中r为直链或支链的烷基链，优选c8至c24，且可以为饱和的或不饱和的；
和n为5至30，最优选9至20。
在方法步骤c)中，优选地，使用2种不同的洗衣洗涤剂组合物洗涤衣物部分。
优选地，在方法步骤b)中，将衣物分成2个部分，其为彼此的左/右镜像。
优选地，在方法步骤a)之后，将衣物储存0至400小时，优选在低于313k，更优选253至303k，最优选283至298k的温度下。
优选地，方法步骤e)的溶剂提取具有10:1至100:1，更优选20:1至40:1的溶剂与衣物重量比，且优选地，所述提取进行至少1小时。
优选地，方法步骤e)的溶剂提取是经由索氏提取或超临界co2提取。
优选地，方法步骤(g)的lc-ms使用具有电喷雾电离和四极杆飞行时间质谱法检测的高分辨率精确质谱仪进行。
优选地，通过已知量稀释提取物并且再测量以确保光谱仪对于分析物浓度的响应是线性的。
对于方法步骤(h)的化合物，优选地是脂肪酸以负模式进行分析，和甘油酯、蜡酯、胆固醇酯和角鲨烯以正模式进行分析。
优选地，在该方法中使用的洗衣洗涤剂组合物包含阴离子表面活性剂，更优选以1至50重量％的含量。
本文所述的任何优选主题内容旨在可以与任何其它主题内容组合，特别是组合两种或更多种优选主题内容。
具体实施方式
衣物
优选的衣物穿在身体的上半部分，并且优选选自t恤、背心、衬衫和女式衬衫(blouse)。衣物优选从纤维素纤维、聚酯、丙烯酸、氨纶及其混合物，更优选棉花、聚酯和氨纶构成。纤维素纤维包括粘胶纤维(viscose)、莫德尔纤维(modal)和天丝(tencel)。
优选地，衣物为白色。
优选地，衣物是对称的，使得左半部和右半部是彼此的镜像。
优选地，衣物优选地在无磷酸盐参比洗涤剂产品，如sdce参比洗涤剂4中洗涤，之后穿着，或者更优选地用优选co2进行溶剂提取以从衣物的表面除去任何有机物质。无磷酸盐参比洗涤剂含有小于1重量％的含磷成分。
洗涤方法
衣物可以通过任何家庭洗涤习惯洗涤，优选手洗，在顶装式自动洗衣机中洗涤或在前装式自动洗衣机中洗涤。
优选地，使用具有6至48度法国硬度的水洗涤和漂洗，液体与衣物的比率在2:1至40:1，优选5:1至30:1的范围内。
最高洗涤水温优选为278至320k，更优选285至303k。
漂洗水温优选为环境的。
洗衣洗涤剂组合物
用于试验的洗衣洗涤剂组合物可以优选为粉末洗涤剂或液体洗涤剂。洗涤剂可以为单位剂量的形式，例如液体单位剂量。
优选地，比较两种不同的洗衣洗涤剂组合物。
索氏提取
索氏提取在harwood,l.m.；moody,c.j.experimentalorganicchemistry:principlesandpractice(illustrateded.).wiley-blackwell.1989中描述。
溶剂提取中使用的溶剂选自醇、酮、醚、氯化有机溶剂。优选地，溶剂为丙酮或氯仿。
超临界co2提取在taylor,larryt(1996).supercriticalfluidextraction.techniquesinanalyticalchemistry.johnwileyandsons,inc.中讨论。
色谱法
超高效合相液相色谱法(uplc)和高效液相色谱法(hplc)是优选的。这样的系统可获自agilent、waters、thermo-fisher。hplc方法在serbanmoldoveanu和victordavid的essentialsinmodernhplcseparations(elsevier2012)中描述。
质谱仪
质谱法在massspectrometrythirdedition:principlesandapplications(hoffmanne.wiley-interscience,2007)；massspectrometry:atextbook(grossj.h.springer2017)；electrosprayandmaldimassspectrometry:fundamentals,instrumentation,practicalities和biologicalapplications:fundamentals,instrumentation,andapplications(cole,r.b.ed,wileyblackwell2010)中讨论。
可以使用任何高分辨率精确质谱仪。
高分辨率精确质谱法是其中每个离子的m/z被解析和测量至几个小数位，优选4个小数位的质谱法。这可用于区分具有相同标称质量(nominalmasses)的分子式。质量以统一质量单位测量，也称为道尔顿。
软电离方法是优选的，优选选自激光解吸电离(ldi)、大气压化学电离(apci)和电喷雾电离(esi)，最优选电喷雾电离(esi)。
ldi优选选自基质辅助激光解吸电离(maldi)和表面辅助激光解吸电离(saldi)。对于maldi，基质优选选自在喷雾沉积之后具有5至20微米的晶体大小的2,5-二羟基苯甲酸和α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)。
高分辨率检测器优选选自傅里叶变换离子回旋共振质量分析仪(fouriertransformioncyclotronresonancemassanalyzers)、三重四极杆(triplequadruple)(qqq)质量分析仪和四极杆飞行时间分析仪(quadrupole-timeofflightsanalyzers)(q-tof)。具有q-tof的esi是最优选的。
三重四极杆仪器含有用于质量过滤的两个四极杆，其在充当碰撞室的第三个的两侧。在ms模式中，四极杆扫描跨越m/z范围，相继地传递每个m/z值以产生ms谱；在ms/ms模式中，其起到选择性离子过滤器的作用。在四极杆-tof(q-tof)仪器中，四极杆(和碰撞室)与飞行时间分析器匹配，同时地允许所有离子的高分辨率、高质量精确分析。
四极杆质量过滤器由四个平行的、其上施加有固定直流电压和交替射频电压的金属棒组成，其根据施加的电压，允许选择性过滤除了具有指定质荷比(m/z)的那些之外的所有离子。
质谱仪可以购自供应商，如：sciex、agilent和waters。
合适的质谱仪的实例为：
xevog2-xsqtofquadrupoletime-of-flightmassspectrometry(waters)
vionimsqtofionmobilityquadrupoletime-of-flightmassspectrometry(waters)
synaptg2-simassspectrometry(waters)
6545q-toflc/ms(agilent)
质谱分析
应当分析所采集的质谱的蜡酯、胆固醇酯、甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯、角鲨烯和游离脂肪酸。
通过质谱分析皮脂脂质在camerae.等，journaloflipidresearch，第51卷，2010，第3377至3388页和其中的参考文献中描述。
蜡酯具有式r1-coo-r2，其中r1和r2为烷基，优选c11至c24直链烷基链，其为饱和的或单不饱和的。
胆固醇酯具有式：胆固醇-coo-r3，其中r3烷基优选为c12至c24直链烷基链，其为饱和的或单不饱和的。
甘油三酯具有式
游离脂肪酸具有式r7-cooh，其中r7为烷基，优选c12至c24直链烷基链，其为饱和的或单不饱和的。
可以存在痕量的其它次要皮脂和皮肤组分，如磷脂、蛋白、蛋白片段、多不饱和脂质。
洗涤剂制剂
所述方法中使用的洗衣洗涤剂组合物可以为任何合适的形式，如液体、粉末、条、单位剂量粉末、单位剂量液体。洗衣洗涤剂组合物可以优选含有表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐、烷基醚硫酸盐、脂肪醇乙氧基化物、烷基硫酸盐、季铵盐(漂洗调理剂活性物)。优选地，洗衣洗涤剂组合物包含阴离子表面活性剂，优选以1至50重量％的含量。
其它常见成分包括：蛋白酶和淀粉酶、螯合剂、助洗剂、抗再沉积聚合物。
在含有阴离子表面活性剂的洗涤剂制剂中，本发明的方法在显示烷基醚羧酸盐和脂质酯酶的优点方面特别好。
烷基醚羧酸盐
烷基醚羧酸盐优选具有形式r-(och2ch2)n-och2cooh。
优选地，烷基醚羧酸盐的r基团为直链或支链的烷基链，优选c8至c24，并且可以为饱和的或不饱和的；优选地，n为5至30，最优选9至20。
它们可以作为盐形式使用，例如钠盐或胺盐。烷基醚羧酸的重量以质子化形式计算。
烷基链r优选为直链的。
烷基链可以为脂肪族的或含有一个顺式或反式双键。
烷基链最优选选自ch3(ch2)11、ch3(ch2)13、ch3(ch2)15、ch3(ch2)17和ch3(ch2)7ch＝ch(ch2)8。
烷基醚羧酸可获自kao
脂质酯酶
清洁性脂质酯酶在janh.vanee、onnomisset和erikj.baas编著的enzymesindetergency(1997marceldekker,newyork)中讨论。
清洁性脂质酯酶优选地在7至11范围的碱性ph下有活性，最优选地它们在8至10.5范围的ph下具有最大活性。
脂质酯酶可选自e.c.分类3.1或3.2或其组合中的脂肪酶。
优选地，清洁性脂质酯酶选自：
(1)三酰甘油酯脂肪酶(e.c.3.1.1.3)
(2)羧酸酯水解酶(e.c.3.1.1.1)
(3)角质酶(e.c.3.1.1.74)
(4)甾醇酯酶(e.c.3.1.1.13)
(5)蜡酯水解酶(e.c.3.1.1.50)
合适的三酰基甘油脂肪酶可以选自绵毛状腐质霉(humicolalanuginosa)(疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyceslanuginosus))脂肪酶的变体。其它合适的三酰基甘油脂肪酶可以选自假单胞菌脂肪酶的变体，例如来自产碱假单胞菌(p.alcaligenes)或假产碱假单胞菌(p.pseudoalcaligenes)(ep218272)、洋葱假单胞菌(p.cepacia)(ep331376)、施氏假单胞菌(p.stutzeri)(gb1,372,034)、荧光假单胞菌(p.fluorescens)、假单胞菌种菌株sd705(wo95/06720和wo96/27002)、威州假单胞菌(p.wisconsinensis)(wo96/12012)；芽孢杆菌脂肪酶的变体，例如来自枯草芽孢杆菌(b.subtilis)(dartois等(1993)，biochemicaetbiophysicaacta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(b.stearothermophilus)(jp64/744992)或短小芽孢杆菌(b.pumilus)(wo91/16422)。
合适的羧酸酯水解酶可以选自对于唐菖蒲伯克霍尔德菌(b.gladioli)，荧光假单胞菌，恶臭假单胞菌，酸热芽孢杆菌(b.acidocaldarius)，枯草芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，金羊毛链霉菌(streptomyceschrysomallus)，淀粉酶产色链霉菌(s.diastatochromogenes)和酿酒酵母为内源性的羧酸酯水解酶的野生型或变体。
合适的角质酶可以选自对于以下菌株为内源性的角质酶的野生型或变体：曲霉属的菌株，特别是米曲霉；链格孢属的菌株，特别是芸薹生链格孢(alternariabrassiciola)；镰刀菌属的菌株，特别是腐皮镰刀菌、豌豆腐皮镰刀菌(fusariumsolanipisi)、尖孢镰刀菌、洋葱尖孢镰刀菌(fusariumoxysporumcepa)、大刀粉红镰刀菌或接骨木粉红镰刀菌(fusariumroseumsambucium)；长蠕孢属的菌株，特别是大麦根腐长蠕孢(helminthosporumsativum)；腐质霉属的菌株，特别是特异腐质霉；假单胞菌属的菌株，特别是门多萨假单胞菌或恶臭假单胞菌；丝核菌属的菌株，特别是立枯丝核菌；链霉菌属的菌株，特别是疥疮病链霉菌；鬼伞属的菌株，特别是灰盖鬼伞；高温双岐菌属(thermobifida)的菌株，特别是褐色嗜热裂孢菌(thermobifidafusca)；大毁壳属(magnaporthe)的菌株，特别是灰色大毁壳(magnaporthegrisea)；或细基格孢属的菌株，特别是群生细基格孢(ulocladiumconsortiale)。
在一个优选实施方式中，角质酶选自wo2003/076580(genencor)中描述的门多萨假单胞菌角质酶的变体，例如具有在i178m、f180v和s205g处的三个置换的变体。
在另一个优选实施方式中，角质酶是h.kontkanen等，app.environ.microbiology，2009，第2148-2157页描述的对于灰盖鬼伞为内源性的六种角质酶的野生型或变体。
在另一个优选实施方式中，角质酶是wo2009007510(vtt)中描述的对于里氏木霉为内源性的两种角质酶的野生型或变体。
在最优选的实施方式中，角质酶衍生自特异腐质霉的菌株，特别是特异腐质霉菌株dsm1800。特异腐质霉角质酶在wo96/13580中描述，其通过引用并入本文。角质酶可以是变体，例如wo00/34450和wo01/92502中公开的变体之一。优选的角质酶变体包括wo01/92502的实施例2中列出的变体。优选的商业角质酶包括novozym51032(可获自novozymes，bagsvaerd，丹麦)。
合适的甾醇酯酶可以衍生自长喙壳属(ophiostoma)的菌株，例如云杉长喙壳(ophiostomapiceae)；假单胞菌属的菌株，例如铜绿假单胞菌；或melanocarpus的菌株，例如melanocarpusalbomyces。
在最优选的实施方式中，甾醇酯酶是h.kontkanen等，enzymemicrobtechnol.，39，(2006)，265-273中描述的melanocarpusalbomyces甾醇酯酶。
合适的蜡酯水解酶可以衍生自加州希蒙得木(simmondsiachinensis)。
脂质酯酶最优选选自e.c.分类3.1.1.1或3.1.1.3或其组合中的脂质酶，最优选e.c.3.1.1.3。
ec3.1.1.3脂肪酶的实例包括wipo公布wo00/60063，wo99/42566，wo02/062973，wo97/04078，wo97/04079和us5,869,438中描述的那些。优选的脂肪酶是由以下产生：反射犁头霉(absidiareflexa)，伞枝犁头霉(absidiacorymbefera)，米赫根毛霉(rhizmucormiehei)，rhizopusdeleman，黑曲霉，塔宾曲霉(aspergillustubigensis)，尖孢镰刀菌(
上述脂肪酶可以组合使用(可以使用脂肪酶的任何混合物)。合适的脂肪酶可购自novozymes，bagsvaerd，丹麦；areariopharmaceuticalco.ltd.，名古屋，日本；toyojozoco.，tagata，日本；amershampharmaciabiotech.，piscataway，新泽西，美国；diosynthco.，oss，荷兰；和/或根据本文包括的实施例制备。
如wo2007/087243中所述，具有降低的气味产生潜力和良好的相对性能的脂质酯酶是特别优选的。这些包括
在洗涤和干燥之后，对于衣物上的皮脂的残留脂肪酶活性可通过短暂加热至80℃或立即溶剂提取来减少。将采用以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
由22名志愿者穿着未穿过的、新的棉或聚酯棉(polycotton)t恤1天。在穿着之前，采用下文概述的对照液体制剂将t恤在欧洲前装式洗衣机中以40℃洗涤循环洗涤。
在穿着之后，将t恤切成两半，一半在对照液体制剂(16.7重量％总表面活性剂(las、sles、脂肪醇乙氧基化物)和作为抗泡沫剂的低含量皂)中洗涤，一半在匹配制剂(初始表面活性剂的含量已降低至9.4重量％，并加入4重量％的烷基醚羧酸盐以给出13.4重量％的总表面活性剂)中洗涤。
烷基醚表面活性剂为具有20摩尔乙氧基化的鲸蜡硬脂醇(cetearyl)的na盐。
将所有t恤半部置于欧洲前装式洗衣机中采用35ml的必需产品的40℃循环。在洗涤之后，将它们翻滚干燥，重新匹配左半部和右半部。从衬衫的匹配左半部和右半部的上部中间背部区域取6g织物，精确称重，并置于分开的索氏套筒(soxhletthimbles)。然后在95℃下使用200ml丙酮对衬衫进行2小时索氏提取。在冷却之后，通过将液体挤压到含有丙酮的提取物中而除去棉中的残留溶剂。然后使用旋转蒸发器除去丙酮。一旦除去所有丙酮，向提取物中加入10ml的叔丁基甲基醚和10ml的丙-2-醇。用力振摇并施加涡旋以溶解所有物质。然后将溶剂倾析到小瓶中用于lc-ms分析。
在agilent6530accurate-massq-toflc/ms上进行lc-ms分析，采用以下参数：
脂肪酸的hplc分析
柱：agilentinfinitylabporoshell120ec-c184.6x50mm，2.7微米
流速：0.25ml/分钟，注射体积4微升，柱温箱(columnoven)：40℃
洗脱液：a＝5mm甲酸铵
b＝meoh:丙-2-醇95:5+5mm甲酸铵
时间表：
qtof：
负极性，m/z范围：80–3200
气体温度：300℃，气体流量：7升/min
雾化器：50psig，vcap：4000v
碎裂器：200v，撇渣器(skimmer)：65v
中性组分的hplc分析
柱：thermoscientificmos-1hypersil200mmx2.1mm，5微米
流速：0.25ml/分钟，注射体积4微升，柱温箱：50℃
洗脱液：a＝60:40水:丙-2-醇+25mm甲酸铵
b＝10:10:80水:丙-2-醇:正丁醇+25mm甲酸铵
时间表：
qtof：
正极性，m/z范围：80–3200
气体温度：300℃，气体流量：7升/min
雾化器：50psig，vcap：4000v，碎裂器：175v，撇渣器：65v
所识别的化合物的结果在下表(表1)中给出。
对于甘油三酯(其中多于1种异构体通过脂肪酸对甘油的不同oh基团的取代而是有可能的)，对于所有异构体的总和给出值。
aec制剂(表中显示为aec)比对照(不含aec，表中显示为对照)除去更多皮脂，如人皮脂中识别的化合物的更低信号大小所证实的。该表显示对于对照制剂和含aec制剂两者，在衣物上发现的化合物的含量，以及与经对照处理的衣物相比，经aec处理的衣物中存在的化合物的百分比含量。在所有情形中，所识别化合物的含量在经aec处理的衣物中比对照更低。
这表明，要求保护的方法可以显示洗衣洗涤剂组合物对于人皮脂去除的作用，并且可以展示不同洗衣洗涤剂组合物之间的皮脂去除功效差异。
表1