用于诊断和评估创伤性脑损伤的新型生物标志物和方法与流程
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年12月29日提交的美国临时申请号62/611,778和于2018年2月14日提交的美国临时申请号62/630,704的优先权，所有这些申请均通过引用整体并入本文。
本公开涉及用于诊断和评估已遭受或可能已遭受头部损伤(例如创伤性脑损伤(tbi))的受试者的方法。特别地，本公开鉴定了各种生物标志物，其检测和/或差异表达可以用于评估受试者中tbi的存在或不存在，并且可以用作诊断受试者为患有特定类型的tbi(例如重度tbi或轻度tbi的亚类)的基础。各种tbi生物标志物可以单独或组合检测，并且可以用作重要的诊断、预后和/或tbi风险分层工具，作为评估受试者tbi状态的一部分。
背景技术：
仅在美国，每年发生超过500万的轻度创伤性脑损伤(mtbi)。当前，没有简单、客观、准确的测量可用于帮助患者评估。实际上，许多tbi评估和诊断都基于主观数据。不幸的是，诸如头颅ct和格拉斯哥昏迷评分(gcs)的客观测量在评估轻度tbi时并不十分全面或敏感。此外，对于mtbi，头部ct绝大部分时间都无法显示，价格昂贵，并且使患者暴露于不必要的辐射之下。另外，阴性头部ct也并不意味着该患者已免于脑震荡；相反，它可能只是表明不对某些干预措施(例如手术)必要。临床医生和患者需要客观、可靠的信息来准确评估这种情况，以促进适当的分类和恢复。迄今为止，仅有有限的数据可用于使用生物标志物来帮助患者诊断、评估和管理。
tbi的大多数是轻度的；但是，诊断和治疗mtbi的能力不足，主要是因为缺乏准确表征不同tbi疾病状态或“疾病表征”的能力。这种不足通常源于与解释临床上出现的模棱两可的症状和无效的成像技术有关的挑战。因此，研究人员已开始探索基于细胞和分子的方法来改善诊断和预后。这已经遇到了许多挑战，包括将生物学标志物与当前临床症状相关联、以及克服我们对mtbi病理生理学缺乏基本了解的困难。但是，最近采用的诸如高通量技术和计算生物学等技术为更准确地确定和表征tbi疾病状态提供了手段。
由于尚未确定tbi的基本病理生理学，因此目前尚无有效且效力的诊断、预后、风险分层和/或治疗工具，尤其是在临床环境中。研究人员已开始在细胞和分子水平上研究tbi，因为当前的大脑成像技术的缺陷和有缺陷的临床诊断方法已增加了利用外周血来识别大脑与外周之间免疫和损伤相关信号的吸引力。这种方法的最终目标是发现单个tbi生物标志物或生物标志物组，以帮助早期发现和诊断，从而有效区分各种tbi疾病状态(例如mtbi与重度tbi或stbi)，并帮助预测患者预后。此外，这些方法可能有助于阐明潜在的生物学机制，并提供对治疗策略的更深入了解。
技术实现要素：
本公开的实施方式包括一种测量或检测至少一种生物标志物的方法。根据这些实施方式，该方法包括从实际或疑似头部损伤后的受试者获得样品；以及测量或检测样品中选自由al9a1、atpg、c1rl、cand1、epipl、glo2、igha2、pzp、sytc、syyc或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段；和/或测量或检测样品中选自由abheb、al9a1、dnm1l、fcn2、inf2、k22e、m3k5、ncor1、sbsn、syep、tpp2或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段。在一些实施方式中，至少一种生物标志物的测量或检测表明该受试者已遭受或可能已遭受创伤性脑损伤(tbi)。
本公开的实施方式还包括一种测量或检测至少一种生物标志物的方法，该方法包括从实际或疑似头部损伤后的受试者获得样品；以及测量或检测样品中选自由1433g、ack1、acy1、aka12、argi1、cadh5、clh1、copg2、dpod2、dsg2、hv307、iqga2、k1c14、k1c19、kv105、lamc1、mdhm、nqo2、perm、plst、pncb、ptprc、sept7、syrc、trxr2、txnl1、uggg1、wdr1或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段。在一些实施方式中，至少一种生物标志物的测量或检测表明受试者已遭受或可能已遭受轻度创伤性脑损伤(mtbi)。
本公开的实施方式还包括用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组。根据这些实施方式，该组包括以下生物标志物中的至少一种：tpp2、cand1、ncor1、k22e、al9a1、abheb、dnm1l、inf2或其任何组合；其中，至少一种生物标志物的测量或检测表明该受试者已遭受或可能已遭受亚类4的轻度tbi。
本公开的实施方式还包括用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，其包括以下生物标志物中的至少一种：tpp2、ncor1、hv103、inf2、ighd、ck054、m3k5、abheb、al9a1、dnm1l或其任何组合；其中，至少一种生物标志物的测量或检测表明该受试者已遭受或可能已遭受亚类3的轻度tbi。
本公开的实施方式还包括用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，其包括以下生物标志物中的至少一种：ncor1、tpp2、k22e、abheb、inf2、sbsn、al9a1、ma2b2或其任何组合；其中，至少一种生物标志物的测量或检测表明该受试者已遭受或可能已遭受亚类2的轻度tbi。
本公开的实施方式还包括用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，其包括以下生物标志物中的至少一种：k22e、dnm1l、diap1、abheb、plod1、syep、kv133、al9a1、ephb4或其任何组合；其中，至少一种生物标志物的测量或检测表明该受试者已遭受或可能已遭受亚类1的轻度tbi。
本公开的实施方式还包括用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，其包括以下生物标志物中的至少一种：cand1、ncor1、k22e、abheb、dnm1l、sbsn、glo2、syep或其任何组合；其中，与健康受试者中至少一种生物标志物的水平相比，受试者中至少一种生物标志物的更高水平的测量或检测表明该受试者已遭受或可能已遭受亚类4的轻度tbi。
本公开的实施方式还包括用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，其包括以下生物标志物中的至少一种：ncor1、hv103、ighd、abheb、dnm1l、albu、thim、igha2、kv139和/或其任何组合；其中，与健康受试者中至少一种生物标志物的水平相比，受试者中至少一种生物标志物的更高水平的测量或检测表明该受试者已遭受或可能已遭受亚类3的轻度tbi。
本公开的实施方式还包括用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，其包括以下生物标志物中的至少一种：ncor1、k22e、abheb、sbsn、dnm1l、diap1、dyl1、psa、ephb4或其任何组合；其中，与健康受试者中至少一种生物标志物的水平相比，受试者中至少一种生物标志物的更高水平的测量或检测表明该受试者已遭受或可能已遭受亚类2的轻度tbi。
本公开的实施方式还包括用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，其包括以下生物标志物中的至少一种：k22e、dnm1l、diap1、abheb、plod1、syep、ephb4、fbln3或其任何组合；其中，与健康受试者中至少一种生物标志物的水平相比，受试者中至少一种生物标志物的更高水平的测量或检测表明该受试者已遭受或可能已遭受亚类1的轻度tbi。
本公开的实施方式还包括用于确定受试者未遭受创伤性脑损伤(tbi)的生物标志物组，其包括以下生物标志物中的至少一种：actbl、aldh2、anxa5、camp、cpne3、crac1、cytc、dnpep、eif3i、gshb、icam1、hv323、hnrpd、kvd33、fa9、fhr4、frpd1、hs90b、ma2a1、pcyox、pnph、proc、rl3、sh3l3、srrm2、tbb1、tena、trap1或其任何组合；其中，受试者中至少一种生物标志物的测量或检测表明该受试者尚未遭受tbi。
附图说明
图1a-1c包括从定量质谱发现蛋白质组学数据的无监督聚类分析中获得的代表性图，这些数据来自于根据临床生理信息被分类为健康或轻度tbi的受试者的血浆样品，以及来自重度(即ct阳性)受试者的合并血浆。所有数据点根据它们在图1a中的聚类位置进行标记。图1a是从整个蛋白质组图谱数据的无监督聚类分析得出的代表性系统学图，显示了两个主要聚类(对照聚类)和tbi聚类(tbi亚类1＝tbi-1；tbi亚类2＝tbi-2；tbi亚类3＝tbi-3；tbi亚类4＝复合tbi)，以及事后提取的相关患者和样本特征，包括年龄；性别；归一化的gfapms峰面积(使用基于靶向质谱的gfap测定法，基于单个蛋白原型肽的定量)；ct扫描(正/负；灰色表示无数据)；以及基于elisa的gfap生物标志物得分(阳性/阴性；灰色表示无数据)。轻度tbi亚类的主要病理聚类包括亚类1(tbi-1)、亚类2(tbi-2)、亚类3(tbi-3)和亚类4(复合tbi，在本文中也称为“复杂性轻度tbi”)。图1b包括整个蛋白质组图谱的主成分分析结果。图1c包括描绘为星座图的代表性系统学聚类。
图2a-2c包括基于无监督分析的样品聚类之间共享和/或独特的蛋白质的代表性聚类。轻度tbi亚类的主要病理聚类包括亚类1(tbi-1)、亚类2(tbi-2)，亚类3(tbi-3)和亚类4或复杂性轻度tbi(复合tbi)；还显示了健康的对照聚类(对照)。来自无监督聚类分析的五个主要样本亚类中的每个都具有最少五个独特表达的蛋白质。图2a是代表性的维恩图，其包括五个鉴定的亚组聚类之间的共享和/或独特的蛋白质。图3b包括在每个亚组聚类中定量的总蛋白质和/或独特蛋白质的数值计数。图3c包括uniprotid和每个亚组聚类中定量的独特蛋白质的简称。
图3a-3b包括在健康(左圆圈)和tbi患者样本(包括合并的重度样本；右圆圈)之间共享或独特的代表性蛋白质维恩图。该分析仅包括在每组的所有样品中检测到的蛋白质(图3a)。图3b列出了在所有tbi样品中独特表达的8种蛋白质，包括其uniprotid和蛋白质名称。al9a1和sytc在大脑中表达，而fa5与凝血相关(两者均基于uniprot(uniprot.org)的注释信息)。
图4a-4e包括bootstrap森林分析的代表性示意图，作为传统的定量独立采集质谱(dia-ms)数据监督分析的替代方法。在满足预测模型标准的五个单独的决策树中分析并总结了单个蛋白质的贡献(图4a-4e)。该分析归因于给定蛋白质作为能够将tbi患者与健康同伴区别开的生物标志物的能力的定量界限，以及相关的诊断概率。在单个蛋白质不足以进行区分的情况下，将识别并定义多种蛋白质的组合。
具体实施方式
本公开涉及用于诊断和评估已遭受或可能已遭受头部损伤(例如创伤性脑损伤(tbi))的受试者的方法。特别地，本公开鉴定了各种生物标志物，其检测和/或差异表达可以用于评估受试者中tbi的存在或不存在，并且可以用作诊断受试者为患有特定类型的tbi(例如重度tbi或mtbi的亚类)的基础。各种tbi生物标志物可以单独或组合检测，并可以用作评估受试者的tbi状态的重要诊断和治疗工具。
如本部分和本文的整个公开中所使用的部分标题仅出于组织目的，而不意图是限制性的。
1.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。当发生冲突时，以本文件(包括定义)为准。虽然在本公开的实践或测试中可以使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述了优选的方法和材料。本文提及的所有公开、专利申请、专利以及其它参考文献以引用的方式整体并入本文。本文公开的材料、方法和实施例仅是示例性的并且不旨在是限制性的。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“有”、“可以”、“含有”以及其变化形式旨在不排除另外行为或结构的可能性的开放式连接词、术语或字词。除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用。本公开还涵盖“包括本文所呈现的实施方式或要素”、“由本文所呈现的实施方式或要素组成”以及“主要由本文所呈现的实施方式或要素组成”的其它实施方式，无论是否明确地阐述。
对于本文数值范围的叙述来说，明确地涵盖具有相同精确度的介于其间的每个中间数字。例如，对于范围6-9，除6和9之外还涵盖数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
如本文所用的“绝对量”是指在不同时间点所采集或采样的至少两个测定结果之间的变化或差异的绝对值，并且其类似于参考水平，在本文已被链接或关联。具有各种临床参数(例如疾病的存在、疾病的阶段、疾病的严重程度、疾病的进展、未进展或改善等)。本文使用的“绝对值”是指不考虑其符号的实数大小(例如，两个比较水平(例如在第一时间点采集的水平和在第二时间点采集的水平)之间的差)，即不管它是正还是负。
本公开提供示例性参考水平和绝对量(例如通过比较不同时间点的参考水平来计算)。但是，众所周知，参考水平和绝对量可以根据免疫测定法的性质(例如所用抗体、反应条件、样品纯度等)而变化，并且可以对测定进行比较和标准化。基于本公开提供的描述，将本文的公开适合于其他免疫测定法来获得那些其他免疫测定法的免疫测定特异性参考水平和绝对量也完全在本领域普通技术人员的能力范围内。尽管在测定之间参考水平和绝对量的精确值可能会有所不同，但本文所述的发现应普遍适用，并能够推断到其他测定中。
“亲和力成熟抗体”在本文中用于指在一个或多个cdr中具有一个或多个变化的抗体，所述变化导致所述抗体与不具有所述变化的亲本抗体相比对于靶抗原的亲和力(即kd、kd或ka)提高。示例性亲和力成熟抗体将对于靶抗原具有纳摩尔浓度或甚至皮摩尔浓度的亲和力。用于产生亲和力成熟抗体的多种程序在本领域中是已知的，包括对使用生物展示制备的组合抗体库的筛选。例如，marks等人,biotechnology10:779-783(1992)描述了通过vh和vl结构域改组进行的亲和力成熟。对cdr和/或框架残基的随机诱变由以下描述：barbas等人,proc.nat.acad.sci.usa,91:3809-3813(1994)；schier等人,gene,169:147-155(1995)；yelton等人,j.immunol.,155:1994-2004(1995)；jackson等人,j.immunol.,154(7):3310-3319(1995)；和hawkins等人,j.mol.biol.,226:889-896(1992)。在选择性诱变位置和在接触或超突变位置由活性增强氨基酸残基进行的选择性突变描述于美国专利号6,914,128b1。
如本文所用的“一种抗体”和“多种抗体”是指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体(完全或部分人源化的)、动物抗体诸如但不限于鸟(例如鸭或鹅)、鲨鱼、鲸鱼和哺乳动物(包括非灵长类动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠等)或非人灵长类动物(例如猴子、黑猩猩等))、重组抗体、嵌合抗体、单链fv(“scfv”)、单链抗体、单结构域抗体、fab片段、f(ab')片段、f(ab')2片段、二硫键连接的fv(“sdfv”)和抗独特型(“抗id”)抗体、双结构域抗体、双可变结构域(dvd)或三可变结构域(tvd)抗体(双可变结构域免疫球蛋白及其制备方法描述于wu,c等人,naturebiotechnology,25(11):1290-1297(2007)和pct国际申请wo2001/058956，每个文献的内容通过引用并入本文)或结构域抗体(dabs)(例如，如holt等人，(2014)trendsinbiotechnology21:484-490中所述)，并且包括天然存在的单结构域抗体sdab，例如在软骨鱼和骆驼科动物中，或者是合成的，例如纳米抗体、vhh或其他结构域结构)，以及以上任一个的功能活性表位结合片段。特别地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包含分析物结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如igg1、igg2、igg3、igg3、igg4、iga1和iga2)、分类(例如igg、ige、igm、igd、iga和igy)。
如本文所用的“抗体片段”是指包含抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分。所述部分不包括完整抗体fc区的恒定重链结构域(即ch2、ch3或ch4，取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括但不限于fab片段、fab'片段、fab'-sh片段、f(ab')2片段、fd片段、fv片段、双抗体、单链fv(scfv)分子、仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽、含有轻链可变结构域的三个cdr的单链多肽、仅含有一个重链可变区的单链多肽、以及含有重链可变区的三个cdr的单链多肽。
“珠粒”和“颗粒”在本文中可互换使用，并且是指基本上球形的固体支持物。珠粒或颗粒的一个实例是微粒。可用于本文的微粒可以是本领域中已知的任何类型。例如，珠粒或颗粒可以是磁珠或磁性颗粒。磁性珠粒/颗粒可以是铁磁性的、亚铁磁性的、顺磁性的、超顺磁性的或铁磁流体的。示例性铁磁材料包括fe、co、ni、gd、dy、cro2、mnas、mnbi、euo以及nio/fe。亚铁磁材料的实例包括nife2o4、cofe2o4、fe3o4(或feo·fe2o3)。珠粒可以具有磁性的实心核心部分并且被一个或多个非磁性层包围。可选地，磁性部分可以是围绕非磁性核心的层。微粒可具有在本文所述方法中起作用的任何尺寸，例如约0.75至约5nm、或约1至约5nm、或约1至约3nm。
“结合蛋白”在本文中用于指与结合配偶体结合并与其形成复合物的单体或多聚体蛋白质，例如像多肽、抗原、化学化合物或其它分子、或任何种类的底物。结合蛋白特异性结合结合配偶体。结合蛋白包括抗体，以及其抗原结合片段和其本领域中已知的和下文所述的其它各种形式和衍生物，以及包含一个或多个结合抗原分子或抗原分子上的特定位点(表位)的抗原结合结构域的其它分子。因此，结合蛋白包括但不限于抗体、四聚体免疫球蛋白、igg分子、igg1分子、单克隆抗体、嵌合抗体、cdr嫁接抗体、人源化抗体、亲和力成熟抗体、和任何此类抗体的保留结合抗原的能力的片段。
“双特异性抗体”在本文中用于指通过以下技术产生的全长抗体：四源杂交瘤技术(参见milstein等人,nature,305(5934):537-540(1983))；通过两个不同单克隆抗体的化学缀合(参见staerz等人,nature,314(6012):628-631(1985))；或通过在fc区中引入突变的钮-入-孔法或类似方法(参见holliger等人,proc.natl.acad.sci.usa,90(14):6444-6448(1993))，所述方法产生多种不同免疫球蛋白物质，其中仅一者是功能性双特异性抗体。双特异性抗体在其两个结合臂的一者(一对hc/lc)上结合一种抗原(或表位)，且其第二臂(另一对hc/lc)上结合不同的抗原(或表位)。根据这个定义，双特异性抗体具有两个不同抗原结合臂(在特异性和cdr序列两方面)，并且对于其结合的各抗原而言是单价的。
“cdr”在本文中用于指抗体可变结构序列内的“互补决定区”。在重链和轻链的每个可变区中存在三个cdr。对于每个可变区，从重链或轻链的n末端开始，这些区域分别表示为“cdr1”、“cdr2”和“cdr3”。如本文所用的术语“cdr组”是指存在于单一可变区中的结合抗原的一组三个cdr。因此，抗原结合位点可以包括六个cdr，其包含来自重链和轻链可变区中的每一个的cdr组。包含单个cdr(例如cdr1、cdr2或cdr3)的多肽可以称为“分子识别单元”抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证明cdr的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链cdr3。因此，分子识别单元可能主要负责抗原结合位点的特异性。总体上，cdr残基直接地并且最实质性地涉及影响抗原结合。
这些cdr的精确边界已根据不同系统加以不同界定。由kabat(kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987)和(1991))所述的系统不仅提供可适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且也提供界定三个cdr的精确残基边界。这些cdr可称为“kabatcdr”。chothia和同事(chothia和lesk,j.mol.biol.,196:901-917(1987)以及chothia等人,nature342:877-883(1989))发现尽管在氨基酸序列的层面上具有巨大多样性，但kabatcdr内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象。这些子部分被指定为“l1”、“l2”和“l3”或“h1”、“h2”和“h3”，其中“l”和“h”分别表示轻链区和重链区。这些区域可称为“chothiacdr”，其具有与kabatcdr重叠的边界。界定与kabatcdr重叠的cdr的其它边界已由padlan,fasebj.,9:133-139(1995)和maccallum,j.mol.biol,262(5):732-745(1996)描述。其它cdr边界定义可能不严格遵循本文中系统之一，但将仍然与kabatcdr重叠，但鉴于特定残基或残基群组或甚至整个cdr不会显著影响抗原结合的预测或实验发现而可将它们缩短或延长。本文所用的方法可利用根据这些系统中的任一个定义的cdr，但某些实施方式使用kabat或chothia定义的cdr。
“变异系数”(cv)、也称为“相对变异性”等于分布的标准偏差除以其均值。
“组分”，“多个组分”或“至少一种组分”通常指可以包括在用于根据本文所述的方法和本领域中已知的其它方法测定测试样品(诸如患者尿液、全血、血清或血浆样品)的试剂盒中的捕获抗体、检测物或缀合物、校准物、对照、敏感性组、容器、缓冲液、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、底物(例如，作为溶液)、终止液等。一些组分可以在溶液中或被冻干以进行重构用于在测定中使用。
如本文所用，“对照”通常是指一种试剂，其目的是评估测量系统的性能，以确保其继续在允许的边界内产生结果(例如边界范围为在一端适合于研究用途分析的测量到在另一端通过质量规格确定的分析界限进行商业化分析)。为了做到这一点，对照应该指示患者的结果，并且可选地应该以某种方式评估误差对测量的影响(例如由于试剂稳定性、校准物可变性、仪器可变性等引起的误差)。如本文所用，“对照受试者”涉及未遭受创伤性脑损伤(tbi)的一个或多个受试者。如本文所用，“骨科对照”涉及(例如基于)已遭受骨科损伤但未遭受明显tbi的受试者的样品或信息。如本文所用，“骨科对照对象”涉及一个或多个遭受骨科损伤但没有遭受明显tbi的受试者。在某些情况下，“骨科对照受试者”是成年的骨科患者，由于其四肢和/或骨盆损伤和/或肋骨骨折，其简短损伤评分≤4(不威胁生命)。如本文所用，“健康对照”涉及(例如基于)来自一个或多个被认为健康并且没有遭受明显tbi或骨科损伤的受试者的样品或信息。如本文所用，“健康对照受试者”涉及被认为是健康的并且没有遭受明显的tbi或骨科损伤的受试者。如本文所用，本文所用的“tbi对照”涉及(例如基于)来自一个或多个患有头部损伤但尚未患有明显tbi的受试者的样品或信息。如本文所用，“tbi对照受试者”涉及一个或多个遭受头部损伤但没有遭受明显的tbi的受试者。
如本文所用，“与...相关”是指与...相比。
如本文所用的“ct扫描”是指计算机断层(ct)扫描。ct扫描组合了从不同角度拍摄的一系列x射线图像，并且使用计算机处理来创建您体内骨骼、血管和软组织的横截面图像或切片。ct扫描可以使用x射线ct、正电子发射断层扫描(pet)、单光子发射计算机断层扫描(spect)、计算机轴向断层扫描(cat扫描)或计算机辅助断层扫描。ct扫描可以是常规ct扫描或螺旋式/螺旋型ct扫描。在常规的ct扫描中，逐个切片地进行扫描，并且在每个切片之后扫描停止并向下移动到下一个切片，例如，从腹部的顶部向下移动到骨盆。常规的ct扫描要求患者屏住呼吸以避免运动伪影。螺旋式/螺旋型ct扫描是连续扫描，其以螺旋方式拍摄，并且是其中扫描图像是连续的更快过程。
如本文所用的抗体的“衍生物”可以是指与真正或亲本抗体相比具有对其氨基酸序列的一个或多个修饰的抗体并且表现出修饰的结构域结构。衍生物仍然可以能够采用天然抗体中发现的典型结构域配置，以及能够特异性结合靶标(抗原)的氨基酸序列。抗体衍生物的典型实例是与其它多肽偶联的抗体、重排的抗体结构域、或抗体片段。衍生物还可以包含至少一种其它化合物，例如蛋白质结构域，所述蛋白质结构域通过共价或非共价键连接。根据本领域中已知的方法，连接可以基于遗传融合。存在于包含抗体的融合蛋白中的另外的结构域可优选地通过柔性接头、有利地是肽接头连接，其中所述肽接头包含多个亲水的肽键合的氨基酸，其长度足以跨越另外的蛋白质结构域的c末端与抗体的n末端之间的距离，反之亦然。抗体可以与效应分子连接，所述效应分子具有适于生物活性或选择性结合例如固体支持物、生物活性物质(例如细胞因子或生长激素)、化学试剂、肽、蛋白质或药物的构象。
在本文中，“dia-ms”或“数据独立采集质谱”是指分子结构确定的方法，其中在串联质谱的第二阶段中将选定的m/z范围内的所有离子裂解并分析。通常，将复合蛋白质混合物(例如血浆样品)消化成肽，并在质谱仪中分析肽。通常，通过裂解在给定时间进入质谱仪的所有离子(即dia-ms)或通过依序分离和裂解m/z的范围(即数据依赖采集-ms或dda-ms)在每个肽上获得串联质谱。dia-ms是dda-ms的替代产品，其中通过串联质谱选择并分析固定数量的前体离子，但大多数情况下可以提供相同的蛋白质信息。蛋白质型肽(特定蛋白质鉴定所特有的肽)用于定量每种蛋白质(参见holewinski,rj等人，methodsmolbiol.2016；1410:165-279；kirk,ja等人，scitranslmed.2015dec.23；7(319):319ra；和parker,sj等人，proteomics.2016aug；16(15-16):2221-2237)。
双重特异性抗体”在本文中用于指可在其两个结合臂(一对hc/lc)的每一个中结合两种不同抗原(或表位)的全长抗体(参见pct公开wo02/02773)。因此，双重特异性结合蛋白具有两个具备相同特异性和相同cdr序列的相同抗原结合臂，且对于其结合的每种抗原而言是二价的。
“双可变结构域”在本文中用于指结合蛋白上的两个或更多个结合位点，所述结合蛋白可以为二价的(两个抗原结合位点)、四价的(四个抗原结合位点)或多价结合蛋白。dvd可以为单特异性的，即能够结合一种抗原(或一个特异性表位)、或多特异性的，即能够结合两种或更多种抗原(即相同抗原分子的两个或更多个表位或不同靶抗原的两个或更多个表位)优选的dvd结合蛋白包含两条重链dvd多肽和两条轻链dvd多肽并且被称为“dvd免疫球蛋白”或“dvd-ig”。这样的dvd-ig结合蛋白因此是四聚体的并且类似于igg分子，但提供比igg分子更多的抗原结合位点。因此，四聚体dvd-ig分子的每一半都类似于igg分子的一半，并且包含重链dvd多肽和轻链dvd多肽，但与igg分子的提供单抗原结合结构域的一对重链和轻链不同，dvd-ig的一对重链和轻链提供两个或更多个抗原结合位点。
dvd-ig结合蛋白的每个抗原结合位点可以源自供体(“亲本”)单克隆抗体，因此包含具有每个抗原结合位点均参与抗原结合的总共六个cdr的重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)。因此，结合两个不同表位的dvd-ig结合蛋白(即两个不同抗原分子的两个不同表位或相同抗原分子的两个不同表位)包含源自第一亲本单克隆抗体的抗原结合位点和第二亲本单克隆抗体的抗原结合位点。
在pct公开号wo2007/024715、美国专利号7,612,181和wu等人,naturebiotech.,25:1290-1297(2007)中提供了对dvd-ig结合分子的设计、表达和表征的描述。此类dvd-ig分子的优选实例包含含有结构式vd1-(x1)n-vd2-c-(x2)n的重链，其中vd1是第一重链可变结构域，vd2是第二重链可变结构域，c是重链恒定结构域，x1是接头(前提条件是它不是ch1，x2是fc区)，且n是0或1，但优选1；和含有vd1-(x1)n-vd2-c-(x2)n的轻链，其中vd1是第一轻链可变结构域，vd2是第二轻链可变结构域，c是轻链恒定结构域，x1是接头(前提条件是它不是ch1，且x2不包含fc区)；且n是0或1，但优选1。这种dvd-ig可以包含两条这样的重链和两条这样的轻链，其中每条链包含串联连接的可变结构域，而在可变区之间没有干预的恒定区，其中重链和轻链缔合形成串联功能性抗原结合位点，并且一对重链和轻链可以与另一对重链和轻链缔合形成具有四个功能性抗原结合位点的四聚体结合蛋白。在另一个实例中，dvd-ig分子可以包含这样的重链和轻链，每个所述重链和轻链包含串联连接的三个可变结构域(vd1、vd2、vd3)，而在可变结构域之间没有干预的恒定区，其中一对重链和轻链可以缔合形成三个抗原结合位点，并且其中一对重链和轻链可以与另一对重链和轻链缔合形成具有六个抗原结合位点的四聚体结合蛋白。
如本文所用的“动态范围”是指测定读数与被分析样品中的靶分子或分析物的量成比例的范围。动态范围可以是标准曲线的线性范围。
“表位”或“多个表位”或“目标表位”是指任何分子上被识别并且可以结合其特异性结合配偶体上的互补位点的位点。分子和特异性结合配偶体是特异性结合对的一部分。例如，表位可以是在多肽、蛋白质、半抗原、糖类抗原(诸如但不限于糖脂、糖蛋白或脂多糖)或多糖。其特异性结合配偶体可以是但不限于抗体。
如本文所用，“片段”、“生物标志物片段”或“生物标志物肽”包括本文鉴定和描述的任何tbi生物标志物的任何鉴定片段。“片段”包括本文中鉴定和描述的任何tbi生物标志物的肽、原型肽、蛋白水解肽、同工型(包括snp或翻译后修饰的形式)以及任何内源或外源诱导形式。生物标志物肽可用于表示dia-ms、dda-ms、多反应监测(mrm，也称为选择性反应监测或srm)质谱分析或平行反应监测(prm)质谱中其代表性蛋白质的数量分析。蛋白水解肽可以单独或与内标一起用于ms定量分析(参见fu,q.等人，jproteomeres.2017nov(doi:10.1021/acs.jproteome.7b00623)；fu,q.等人，methodsmolbiol.2016；1410:249-264；和liu,x.等人，methods.2013june15；61(3):304-312)。
如本文所用的“框架”(fr)或“框架序列”可以意指可变区减去cdr的剩余序列。因为cdr序列的精确界定可通过不同系统(例如参见上文)来确定，所以框架序列的含义易受相应不同解释。六个cdr(轻链的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3以及重链的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3)也将轻链和重链上的框架区分成各链上的四个子区域(fr1、fr2、fr3和fr4)，其中cdr1位于fr1与fr2之间，cdr2位于fr2与fr3之间，并且cdr3位于fr3与fr4之间。在不将特定子区指定为fr1、fr2、fr3或fr4的情况下，如其它所提及的框架区表示单一天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合fr。如本文所用，fr表示四个子区域中的一个，并且fr表示构成框架区的四个子区域中的两个或更多个。
人重链和轻链fr序列在本领域是已知的，其可被用作重链和轻链“接受者”框架序列(或者简单的说是“接受者”序列)以通过使用本领域中已知的技术来人源化非人抗体。在一个实施方式中，人重链和轻链接受者序列选自在公众可获得的数据库诸如v-base(hypertexttransferprotocol://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或国际
如本文所用的“功能性抗原结合位点”可以意指结合蛋白(例如抗体)上能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力可以不如与抗原结合位点所源自的亲本结合蛋白，例如亲本抗体一样强，但结合抗原的能力必须是可使用已知用于评价蛋白质，例如抗体与抗原结合的多种方法中的任一者测量。此外，本文中的多价蛋白质，例如多价抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力无需在数量上相同。
“gfap”在本文中用于描述神经胶质原纤维酸性蛋白。gfap是由人中的gfap基因编码的蛋白质，并且它可被生产(例如通过重组方式，在其它物种中)。“gfap状态”可以表示在某个时间点传递的gfap水平或量(例如使用单一的gfap度量)，与监测相关的gfap水平或量(例如通过对受试者的重复测试确定gfap量的增加或减少)，与创伤性脑损伤(无论是原发性脑损伤和/或继发性脑损伤)的治疗相关的gfap的水平或量，或其组合。通过elisa和通过靶向质谱法对对gfap特有的特定肽测量gfap。
如本文所用的“格拉斯哥昏迷量表”或“gcs”是指用于基于总体社交能力或对其它的依赖来估计和分类脑损伤结果的15分量表。所述测试使用以下值测量运动反应、言语反应和睁眼反应：i、运动反应(6-完全服从命令；5-损伤性刺激时定位；4-从损伤性刺激缩回；3-异常屈曲，即去皮层状态；2-伸展反应，即去脑状态；和1-无反应)；ii、言语反应(5-警觉且定向；4-说话混乱，但连贯；3-字词不恰当且由字词组成的短语混乱；2-难以理解的声音；和1-没有声音；和iii、睁眼(4-自发睁眼；3-说话时睁眼；2-疼痛时睁眼；1-不睁眼)。通过添加i+ii+iii的值来确定最终评分。最终评分可分为四个可能的生存水平，较低的数字指示更严重的损伤和更差的预后：轻度(13-15)；中度失能(9-12)(意识丧失超过30分钟；可能或可能消退的身体或认知障碍：并从康复中获益)；重度失能(3-8)(昏迷：无意识状态。没有有意义的反应，没有自愿活动)；和植物状态(小于3)(睡醒周期；觉醒，但没有与环境的相互作用；对疼痛没有定位反应)。中度脑损伤定义为导致意识丧失20分钟至6小时且格拉斯哥昏迷量表为9至12分的脑损伤。重度脑损伤定义为导致意识丧失大于6小时且格拉斯哥昏迷量表为3至8的脑损伤。
如本文所用，“格拉斯哥结局量表”是指用于功能性结局的全球量表，其将患者状态评定为以下五个类别之一：死亡、植物人状态、重度失能、中度失能或恢复良好。
本文中可互换使用的“扩展的格拉斯哥结局量表”或“gose”通过将重度失能、中度失能和良好恢复的类别细分为低级类别和高级类别来提供更详细的八种分类，如表1中所示。
表1
术语“人源化抗体”在本文中用于描述包含来自非人物种(例如小鼠)的重链和轻链可变区序列但其中vh和/或vl序列中的至少一部分已变得更“类人”，即与人生殖系可变序列更相似的抗体。“人源化抗体”为抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其免疫特异性地结合目标抗原且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(fr)区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(cdr)。如本文所用，在cdr的背景下的术语“基本上”是指氨基酸序列与非人抗体cdr的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的cdr。人源化抗体包含基本上全部的至少一个且通常两个可变结构域(fab、fab'、f(ab')2、fabc、fv)，其中全部或基本上全部cdr区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的那些cdr区并且全部或基本上全部框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一个实施方式中，人源化抗体也包含免疫球蛋白恒定区(fc)(通常人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。在一些实施方式中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。抗体也可以包括重链的ch1、铰链、ch2、ch3和ch4区。在一些实施方式中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方式中，人源化抗体仅含有人源化重链。在特定实施方式中，人源化抗体仅含有轻链和/或人源化重链的人源化可变结构域。
人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何类别，包括igm、igg、igd、iga和ige，以及任何同种型，包括但不限于igg1、igg2、igg3和igg4。人源化抗体可以包含来自多于一种类别或同种型的序列，并且可以使用本领域中熟知的技术选择特定的恒定结构域以优化所需的效应子功能。
人源化抗体的框架区和cdr无需精确对应于亲本序列，例如可以通过取代、插入或/或缺失至少一个氨基酸残基来对供体抗体cdr或共有框架进行诱变以使该位点处的cdr或框架残基不对应于供体抗体或共有框架。然而，在优选的实施方式中，此类突变将不是广泛的。通常，至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、且最优选至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本fr和cdr序列的那些。如本文所用，术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所用，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如winnaker,fromgenestoclones(verlagsgesellschaft,weinheim,1987))。因此，“共有免疫球蛋白序列”可以包含“共有框架区”和/或“共有cdr”。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置由家族中最常出现在那个位置的氨基酸占据。如果两个氨基酸同等频繁地出现，那么共有序列中可包括任一者。
如本文在两种或更多种多肽或多核苷酸序列的背景下所使用的“相同的”或“同一性”可意指氨基酸或核苷酸序列在指定区域上具有指定百分比的相同残基。可通过以下来计算所述百分比：最佳地比对两个序列、在指定区域比较两个序列、确定在两个序列中相同的残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端并且比较的指定区域仅包含单个序列的情况下，单个序列的残基包括于计算的分母而不是分子中。
如本文所用，“成像程序”是指允许检查身体内部以诊断、治疗和监测健康状况的医学测试。成像过程可以是非侵入性过程，其可以允许诊断疾病和损伤而不会造成干扰。成像程序的示例包括mri、ct扫描、x射线、正电子发射断层扫描(pet)扫描、单光子发射计算机断层扫描(spect)和扩散张量成像(dti)扫描。
如本文中可互换使用的“对头部的损伤”或“头部损伤”是指对头皮、颅骨或大脑的任何创伤。此类损伤可能包括颅骨上的仅轻微的撞击或可能是严重的脑损伤。此类损伤包括大脑的原发性损伤和/或大脑的继发性损伤。原发性脑损伤发生在最初的侵害期间，并且由大脑的物理结构的移位引起。更具体地，原发性脑损伤是在创伤事件期间发生的对实质(组织、血管)的物理损伤，导致对周围脑组织的剪切和压迫。继发性脑损伤发生在原发性损伤之后，并且可能涉及一系列细胞过程。更具体地，继发性脑损伤是指在原发性脑损伤后的一段时间(从数小时到数天)内发展出的变化。它包括促成进一步破坏脑组织的大脑中细胞、化学、组织或血管变化的整个级联。
对头部的损伤可以是闭合性的或开放性的(穿透性的)。闭合性头部损伤是指其中颅骨没有被撞击物体穿透的头皮、颅骨或大脑的创伤。开放性头部损伤是指其中颅骨被撞击物体穿透的头皮、颅骨或大脑的创伤。头部损伤可以是由人的身体摇动、由导致闭合性或开放性头部创伤的外部机械或其它力(例如，诸如汽车、飞机、火车等情况下的交通事故；诸如用棒球棒或来自枪械的头部猛击)产生的钝性冲击、脑血管意外(例如中风)、一次或多次跌倒(例如，如运动或其它活动)、爆炸或冲击波(统称为“冲击波伤”)以及由其它类型的钝力创伤引起的。可选地，对头部的损伤可能由摄入和/或暴露于化学物质、毒素或化学物质和毒素的组合引起。此类化学物质和/或毒素的实例包括火、霉菌、石棉、杀虫剂和杀昆虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体(诸如一氧化碳、硫化氢和氰化物)、有机金属(诸如甲基汞、四乙基铅和有机锡)和/或一种或多种滥用药物。可选地，对头部的损伤可能是由于受试者罹患自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、一种或多种病毒、脑膜炎、脑积水、缺氧或其任何组合引起的。在一些情况下，无法确定是否发生过任何此类事件或损伤。例如，患者或受试者可能没有病史，受试者可能无法说话，受试者可能意识到他们所暴露于的事件等。此类情况在本文中描述为受试者“可能已遭受头部损伤”。在本文的某些实施方式中，闭合性头部损伤不包括并且特别地排除脑血管意外，诸如中风。
如本文所用，“颅内病变”是指脑内的损伤区域。颅内病变可以是在成像程序或脑成像测试(例如mri或ct扫描)中看到的异常。在ct或mri扫描中，脑部病变可能表现为看起来不像正常脑组织的暗点或亮点。
如本文所用的“分离的多核苷酸”可以意指多核苷酸(例如基因组、cdna或合成来源或其组合的多核苷酸)，根据其来源，所述多核苷酸不与“分离的聚核苷酸”见于自然界中所处的多核苷酸的全部或一部分缔合；可操作地连接至其在自然界中不连接的多核苷酸；或不作为较大序列的一部分存在于自然界中。
如本文所用的“标记”和“可检测标记”是指附接至抗体或分析物以使抗体与分析物之间的反应可检测的部分，并且如此标记的抗体或分析物被称为“可检测地标记的”。标记可以产生可通过视觉或仪器手段检测到的信号。各种标记包括产生信号的物质，诸如发色团、荧光化合物、化学发光化合物、放射性化合物等。标记的代表性实例包括产生光的部分例如吖啶鎓化合物，以及产生荧光的部分例如荧光素。本文描述了其它标记。在这方面，所述部分本身可以是不可检测的，但在与另一部分反应时可以变得可检测。使用术语“可检测地标记的”旨在涵盖这种标记。
可使用如在本领域中已知的任何适合可检测标记。例如，可检测标记可为放射性标记(诸如3h、14c、32p、33p、35s、90y、99tc、111in、125i、131i、177lu、166ho和153sm)、酶标记(诸如辣根过氧化酶、碱性过氧化酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶等)、化学发光标记(诸如吖啶酯、硫酯或磺酰胺；鲁米诺、异鲁米诺、菲啶鎓酯等)、荧光标记(诸如荧光素(例如5-荧光素、6-羧基荧光素、3'6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等))、若丹明、藻胆蛋白、r-藻红素、量子点(例如硫化锌封盖的硒化镉)、测温标记或免疫聚合酶链反应标记。标记、标记程序和标记检测的绪论见于polak和vannoorden,introductiontoimmunocytochemistry,第2版,springerverlag,n.y.(1997)；和haugland,handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals(1996)(其是由molecularprobes,inc.,eugene,oregon出版的组合手册和目录)中。荧光标记可用于fpia中(参见例如美国专利号5,593,896、5,573,904、5,496,925、5,359,093和5,352,803，其通过引用整体并入本文)。吖啶化合物可在均质化学发光测定法中用作可检测标记(参见例如adamczyk等人,bioorg.medghem.lett.16:1324-1328(2006)；adamczyk等人,bioorg.medchem.lett.4:2313-2317(2004)；adamczyk等人,biorg.medchem.lett.14:3917-3921(2004)；和adamczyk等人,org.lett.5:3779-3782(2003))。
在一个方面，吖啶化合物是吖啶-9-甲酰胺。用于制备吖啶9-甲酰胺的方法描述于mattingly,j.biolumin.chemilumin.6:107-114(1991)；adamczyk等人,j.org.chem.63:5636-5639(1998)；adamczyk等人,tetrahedron55:10899-10914(1999)；adamczyk等人,org.lett.1:779-781(1999)；adamczyk等人,bioconjugatechem.11:714-724(2000)；mattingly等人,inluminescencebiotechnology:instrumentsandapplications；dyke,k.v.编辑；crcpress:bocaraton,第77-105页(2002)；adamczyk等人,org.lett.5:3779-3782(2003)；和美国专利号5,468,646、5,543,524和5,783,699(其各自通过引用整体并入本文用于其在关于该方面的教导)。
吖啶化合物的另一个实例是吖啶-9-羧酸芳基酯。具有式ii的吖啶-9-羧酸芳基酯的一实例是10-甲基-9-(苯氧基羰基)吖啶氟磺酸酯(可购自caymanchemical,annarbor,mi)。用于制备吖啶-9-羧酸芳基酯的方法描述于mccapra等人,photochem.photobiol.4:1111-21(1965)；razavi等人,luminescence15:245-249(2000)；razavi等人,luminescence15:239-244(2000)；和美国专利号5,241,070(其各自通过引用整体并入本文用于其在关于该方面的教导)中。此类吖啶-9-羧酸芳基酯是针对在由至少一种氧化酶氧化分析物中产生的过氧化氢在信号强度和/或信号迅速度方面均高效的化学发光指示剂。吖啶-9-羧酸芳基酯的化学发光发射过程迅速完成，即在1秒内完成，而吖啶-9-甲酰胺化学发光发射延续到2秒。然而，吖啶-9-羧酸芳基酯在蛋白质存在下失去其化学发光特性。因此，其使用需要在信号生成和检测期间不存在蛋白质。用于分离或去除样品中蛋白质的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于超滤、提取、沉淀、透析、色谱法和/或消化(参见例如wells,highthroughputbioanalyticalsamplepreparation.methodsandautomationstrategies,elsevier(2003))。从测试样品中去除或分离的蛋白质的量可以是约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。关于吖啶-9-羧酸芳基酯及其用途的更多细节阐述于2007年4月9日提交的美国专利号11/697,835中。吖啶-9-羧酸芳基酯可以溶解在任何合适的溶剂中，诸如脱气的无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)或含水胆酸钠。
如本文所用的“空白限(lob)”是指当测试不含分析物的空白样品的重复样品时预期发现的最高表观分析物浓度。
如本文所用的“检测限(lod)”是指可以在指定的置信度下检测到的被测物的最低浓度(即意欲测量的量)。置信度通常为95％，出现错误负值的可能性为5％。lod是可能与lob可靠地区分开的最低分析物浓度，并且在此浓度下可行。lod可以通过利用测得的lob和已知含有低浓度分析物的样品的测试重复样品来确定。本文中使用的lod术语是基于临床和实验室标准协会(clsi)协议ep17-a2的定义(“确定检测限和定量限的协议；批准的指南-第二版”，jamesf.pierson-perry等人的ep17a2e，clinicalandlaboratorystandardsinstitute，2012年6月1日)。
如本文所用的“定量限(loq)”是指最低浓度，在该最低浓度下不仅可以可靠地检测到分析物，而且可以满足偏置和不精确的一些预定目标。loq可能等同于lod，或者可能处于更高的浓度。
“线性度”是指在指定操作范围内该方法或测定的实际性能近似于一条直线的程度。可以根据与理想直线的偏差或非线性来测量线性。“线性偏差”可以用满量程的百分比表示。在本文公开的一些方法中，在测定的动态范围内实现了线性偏差(dl)小于10％。“线性”是指对于所列举的示例性范围或值具有小于或等于约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％或约8％的变化。
“连接序列”或“连接肽序列”是指与一种或多种目标多肽序列(例如全长、片段等)连接的天然或人工多肽序列。术语“连接的”是指连接序列与目标多肽序列的接合。此类多肽序列优选地通过一个或多个肽键接合。连接序列可以具有约4至约50个氨基酸的长度。优选地，连接序列的长度为约6至约30个氨基酸。可以通过氨基酸取代、添加或缺失来修饰天然连接序列以产生人工连接序列。连接序列可用于许多目的，包括用于重组fab中。示例性连接序列包括但不限于：(i)组氨酸(his)标签，诸如6xhis标签，其具有hhhhhh(seqidno：4)的氨基酸序列，可用作连接序列以有利于分离和纯化目标多肽和抗体；(ii)肠激酶裂解位点，如his标签，用于分离和纯化目标蛋白质和抗体。常常，将肠激酶裂解位点与his标签一起用于分离和纯化目标蛋白质和抗体。各种肠激酶裂解位点在本领域中是已知的。肠激酶裂解位点的实例包括但不限于ddddk(seqidno：5)的氨基酸序列及其衍生物(例如addddk(seqidno：6)等)；(iii)杂项序列可用于链接或连接单链可变区片段的轻链和/或重链可变区。其它连接序列的实例可见于bird等人,science242:423-426(1988)；huston等人,pnasusa85:5879-5883(1988)；和mccafferty等人,nature348:552-554(1990)中。还可以修饰连接序列以用于另外的功能，诸如药物的附接或附接于固体支持物。在本公开的上下文中，单克隆抗体例如可以含有连接序列，诸如his标签、肠激酶裂解位点或两者。
在本文中可互换使用的“磁共振成像”或“mri”是指在放射学中使用的医学成像技术，以形成人体在健康和疾病中的解剖结构和生理过程的图片。mri是医学成像的一种形式，可测量人体组织的原子核在强磁场中时对高频无线电波的响应，并产生内部器官的图像。基于核磁共振(nmr)科学的mri扫描仪使用强磁场、无线电波和场梯度来生成人体内部图像。
如本文所用的“单克隆抗体”是指从基本上均质抗体的群体获得的抗体，即除可以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成所述群体的个别抗体是相同的。单克隆抗体针对单一抗原具有高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。本文的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性。
“多价结合蛋白”在本文中用于指包含两个或更多个抗原结合位点(在本文中也称为“抗原结合结构域”)的结合蛋白。多价结合蛋白优选地被工程化以具有三个或更多个抗原结合位点，并且通常不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”是指可以结合两个或更多个相关或不相关靶标的结合蛋白，包括能够结合相同靶分子的两个或更多个不同表位的结合蛋白。
“定点照护装置”是指用于在定点照护处或附近(即在实验室外)、在患者护理的时间和地方(诸如在医院、医师办公室、紧急或其它医疗护理机构、患者家、养老院和/或长期护理和/或临终关怀设施中)提供医学诊断测试的装置。定点照护装置的实例包括由abbottlaboratories(abbottpark，il)生产的装置(例如i-stat和i-statalinity，普适的生物传感器(rowville，australia)(参见us2006/0134713)、axis-shieldpocas(oslo，norway)和临床实验室产品(losangeles，usa)。
在本文所述的免疫测定法和试剂盒的背景下的“质量控制试剂”包括但不限于校准物、对照物和敏感性组。通常使用“校准物”或“标准物”(例如一种或多种，诸如复数种)来建立校正(标准)曲线以内插分析物(诸如抗体或分析物)的浓度。可选地，可以使用接近参考水平或对照水平(例如“低”、“中等”或“高”水平)的单一校准物。可联合使用多种校准物(即多于一种的校准物或不同量的校准物)以构成“敏感性组”。
“重组抗体”和“多种重组抗体”是指通过一个或多个步骤制备的抗体，包括通过重组技术将编码一种或多种单克隆抗体的全部或部分的核酸序列克隆到适当的表达载体中，并随后在适当的宿主细胞中表达抗体。所述术语包括但不限于重组产生的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体(全部或部分人源化)、由抗体片段形成的多特性或多价结构、双功能抗体、异型缀合ab、
如本文所用的“参考水平”是指用于评估诊断、预后或治疗功效的测定截止值，并且在本文中已与各种临床参数(例如疾病的存在、疾病的阶段、疾病的严重程度、疾病的进展、未进展或改善等)链接或关联。本公开提供示例性的参考水平。然而，众所周知，参考水平可以根据免疫测定法的性质(例如所用抗体、反应条件、样品纯度等)而变化，并且可以对测定进行比较和标准化。基于本公开提供的描述，将本文的公开适合于其他免疫测定法来获得那些其他免疫测定法的免疫测定特异性参考水平也完全在本领域普通技术人员的能力范围内。尽管在测定之间参考水平的精确值可能会有所不同，但本文所述的发现应普遍适用，并能够推断到其他测定中。
如本文所用的对受试者(例如患者)的“风险评估”、“风险分类”、“风险鉴定”或“风险分层”是指评价包括生物标志物的因素，以预测包括疾病发作或疾病进展的未来事件发生的风险，以便可以在更加知情的基础上做出关于受试者的治疗决策。
“样品”、“测试样品”、“样本”、“生物样品”、“来自受试者的样品”和“患者样品”可以在本文中交换使用并且可以是血液样品(诸如全血)、组织、尿、血清、血浆、羊水、脑脊髓液、胎盘细胞或组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞。样品可以如从患者获得地直接使用，或者可预处理，诸如通过过滤、稀释、提取、浓缩、离心、对干扰组分进行灭活、添加试剂等，从而以本文中讨论的或其它本领域已知的一些方式来修饰样品的特征。
可以利用多种细胞类型、组织或体液来获得样品。此类细胞类型、组织和流体可以包括组织切片，诸如活检和尸检样品、取得用于组织学目的的冷冻切片、血液(例如全血)、血浆、血清、红细胞、血小板、间质液、脑脊髓液等。细胞类型和组织还可以包括淋巴液、脑脊髓液、由组织或细胞类型收集的流体可以通过从人类和非人动物中除去细胞样品来提供，但也可以通过使用先前分离的细胞(例如通过其它人分离的、在其它时间、和/或用于其它目的)来完成。以及通过来自个人的ipsc或ipsc衍生的细胞类型(例如运动神经元)。也可以使用归档组织，例如具有治疗或结局史的那些。可能不需要蛋白质或核苷酸分离和/或纯化。
如本文中可互换使用的“固相”或“固体支持物”是指可用于附接和/或吸引且固定化(1)一种或多种捕获剂或捕获特异性结合配偶体，或(2)一种或多种检测剂或检测特异性结合配偶体的任何材料。固相可以就其吸引和固定化捕获剂的固有能力进行选择。可选地，固相可以具有在其上粘附的连接剂，所述连接剂具有吸引和固定化(1)捕获剂或捕获特异性结合配偶体，或(2)检测剂或检测特异性结合配偶体。例如，连接剂可包括带电物质，其相对于捕获剂(例如捕获特异性结合配偶体)或检测剂(例如检测特异性结合配偶体)本身或相对于与(1)捕获剂或捕获特异性结合配偶体，或(2)检测剂或检测特异性结合配偶体缀合的带电物质是带相反电荷的。通常，连接剂可以是任何结合配偶体(优选是异性的)，其固定化在(附接至)固相上并且具有通过结合反应来固定化(1)捕获剂或捕获特异性结合配偶体，或(2)检测剂或检测特异性结合配偶体的能力。连接剂使得捕获剂在性能测定之前或性能测定期间间接地与固相材料结合。例如，固相可以是塑料、衍生塑料、磁性或非磁性金属、玻璃或硅，包括例如试管、微量滴定孔、薄片、珠粒、微粒、芯片和本领域普通技术人员已知的其它构造。
如本文所用的“特异性结合”或“特异性地结合”可以是指抗体、蛋白质或者肽与第二化学物质的相互作用，其中相互作用依赖于化学物质上具体结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是广泛结合蛋白质。如果抗体对表位“a”是特异性的，则在含被标记的“a”和抗体的反应中，含表位a的分子(或者游离的未标记a)的存在将会降低与抗体结合的被标记的a的量。
“特异性结合配偶体”是特异性结合对的成员。特异性结合对包含两个不同分子，其通过化学或物理方式彼此特异性结合。因此，除常见免疫测定法的抗原与抗体特异性结合对之外，其它特异性结合对可包括生物素与抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)；碳水化合物与凝集素；互补核苷酸序列；效应分子与受体分子；辅因子与酶；酶和酶抑制剂；以及适体(例如rna和dna适体)等。此外，特异性结合对可包括是原始特异性结合成员的类似物的成员，例如分析物-类似物。免疫反应性特异性结合成员包括分离的或重组产生的抗原、抗原片段和抗体，包括单克隆和多克隆抗体以及其复合物和片段。
如本文所用的“受试者”和“患者”可互换地是指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物和人。在一些实施方式中，受试者可以是人或非人。受试者或患者可以正在接受其他形式的治疗。在一些实施方式中，当受试者是人时，该受试者不包括遭受脑血管意外(例如中风)的任何人。在一些实施方式中，受试者疑似已遭受头部损伤。在一些实施方式中，受试者已知已遭受头部损伤。在一些实施方式中，受试者疑似患有轻度、中度或重度tbi。在一些实施方式中，受试者疑似患有轻度tbi。在一些实施方式中，受试者疑似患有中度tbi。在一些实施方式中，受试者疑似患有重度tbi。
如本文所用的“哺乳动物”是指哺乳动物类别的任何成员，包括但不限于人和非人的灵长类，例如黑猩猩和其他猿类和猴类；牲畜，例如牛、绵羊、猪、山羊、美洲驼、骆驼和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠、兔子和豚鼠等。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，无论是男性还是女性，打算将成年和新生儿受试者以及胎儿都包括在该术语的范围内。
“治疗(treat/treating/treatment)”各自在本文中可互换用于描述逆转、减轻或抑制这种术语所适用的疾病和/或损伤的进展，或这种疾病的一种或多种症状。根据受试者的病状，该术语还是指预防疾病，并且包括预防疾病的发作或预防与疾病相关的症状。治疗可以以急性或慢性方式进行。所述术语还是指在受疾病折磨之前降低与这种疾病相关的疾病或症状的严重性。在折磨之前的这种预防疾病或降低疾病严重性是指不在受疾病折磨的施用时间将药物组合物施用至受试者。“预防”还是指预防疾病或与这种疾病相关的一种或多种症状的复发。“治疗”和“治疗性地”是指治疗的行为，正如“治疗”如上所定义的。
如本文所用，术语“单分子检测”是指以非常低的浓度水平(例如pg/ml或飞克/ml水平)检测和/或测量测试样品中分析物的单个分子。许多不同的单分子分析仪或设备是本领域已知的，包括纳米孔和纳米井设备。纳米孔装置的实例在国际专利公开号wo2016/161402中描述，其通过引用整体并入本文。纳米井装置的实例在国际专利公开号wo2016/161400中描述，其通过引用整体并入本文。
如本文可互换使用的“创伤性脑损伤”或“tbi”是指具有广谱症状和失能的复杂损伤。tbi很多时候是类似于其它损伤的急性事件。tbi可分为“轻度”、“中度”或“重度”。当在本文中仅被称为“tbi”时，通常是指任何类别的tbi(例如轻度、中度或重度)。tbi的原因是多种多样的，并且包括例如人的身体摇动、车祸、枪械损伤、脑血管意外(例如中风)、跌倒、爆炸或冲击波以及其它类型的钝力创伤。tbi的其它原因包括摄入和/或暴露于一种或多种化学品或毒素(诸如火、霉菌、石棉、杀虫剂和杀昆虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体(诸如一氧化碳、硫化氢和氰化物)、有机金属(诸如甲基汞、四乙基铅和有机锡)、一种或多种滥用药物或其组合)。可选地，tbi可能在罹患自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、一种或多种病毒、脑膜炎、脑积水、缺氧或其任何组合的受试者中发生。青年人和老年人是tbi风险最高的年龄组。在本文的某些实施方式中，创伤性脑损伤或tbi不包括并且特别地排除脑血管意外，诸如中风。
如本文所用的“轻度tbi”是指脑损伤，其中意识丧失是短暂的并且通常是几秒或几分钟并且/或者混乱和定向障碍短于1小时。轻度tbi也被称为脑震荡、轻微头部创伤、轻微tbi、轻微脑损伤和轻微头部损伤。虽然mri和ct扫描常常是正常的，但患有轻度tbi的个体可能具有认知问题，诸如头痛、思维困难、记忆问题、注意力缺陷、情绪波动和沮丧。
轻度tbi是最普遍的tbi，并且在初始损伤时常常被遗漏。通常，受试者具有在13-15之间(诸如13-15或14-15)的格拉斯哥昏迷量表数。百分之十五(15％)的轻度tbi患者的症状持续3个月或更长时间。轻度tbi定义为头部的强力运动或导致不到30分钟的精神状态短暂变化(混乱、定向障碍或记忆丧失)或意识丧失的冲击力的结果。轻度tbi的常见症状包括疲劳、头痛、视力障碍、记忆力丧失、注意力/集中力差、睡眠障碍、头晕/失去平衡、应激性情绪障碍、抑郁情感和癫痫。与轻度tbi相关的其它症状包括恶心、嗅觉丧失、对光和声音的敏感性、情绪变化、迷茫或混乱、和/或思维迟钝。
“轻度tbi亚类1”(tbi-1)是指被分类为患有轻度tbi并且还表现出与对照(例如健康对照或尚未遭受tbi的对照)不同，与患有中度至重度tbi的受试者不同，并且与患有亚类2、3或4的轻度tbi的受试者不同的血浆蛋白质组表征的受试者。
“轻度tbi亚类2”(tbi-2)是指被分类为患有轻度tbi并且还表现出与对照(例如健康对照或尚未遭受tbi的对照)不同，与患有中度至重度tbi的受试者不同，并且与患有亚类1、3或4的轻度tbi的受试者不同的血浆蛋白质组表征的受试者。
“轻度tbi亚类3”(tbi-3)是指被分类为患有轻度tbi并且还表现出与对照(例如健康对照或尚未遭受tbi的对照)不同，与患有中度至重度tbi的受试者不同，并且与患有亚类1、2或4的轻度tbi的受试者不同的血浆蛋白质组表征的受试者。
“轻度tbi亚类4”(复合tbi，在本文中也称为“复杂性轻度tbi”)是指被分类为患有轻度tbi并且还表现出与对照(例如健康对照或尚未遭受tbi的对照)不同，与患有中度至重度tbi的受试者不同，并且与患有亚类1、2或3的轻度tbi的受试者不同的血浆蛋白质组表征的受试者。此外，患有轻度tbi亚类4的受试者表现出与从患有重度tbi的受试者的合并样本中获得的蛋白质组表征相似的蛋白质组表征。在本文公开的数据中，轻度tbi亚类4聚类包含数量最多的具有升高gfap水平(根据基于elisa的gfap测定法和gfap质谱法)的受试者，以及仅有的ct扫描呈阳性的受试者。
如本文所用，“重度tbi”是指脑损伤，其中意识丧失和/或混乱和定向障碍在1至24小时之间并且受试者具有9-12之间的格拉斯哥昏迷量表数。患有中度tbi的个体具有异常的脑成像结果。如本文所用的“重度tbi”是指脑损伤，其中意识丧失超过24小时并且在损伤或穿透性颅骨损伤后记忆丧失长过24小时并且受试者具有3-8之间的格拉斯哥昏迷量表数。缺陷的范围为从较高水平的认知功能损害到昏迷状态。幸存者可能具有有限的手臂或腿部功能、言语或语言异常、思维能力丧失或情绪问题。具有重度损伤的个体可能会长期处于无反应状态。对于许多患有重度tbi的人来说，通常需要长期康复以最大限度地发挥功能和独立性。
中度至重度tbi的常见症状包括认知缺陷，包括注意力、集中力、注意力分散性、记忆力、运算速度方面的困难、混乱、持续言语、冲动、语言处理和/或“执行功能”、不理解口语词(感觉性失语症)、说话和被理解困难(表达性失语症)、言语不清、说话速度很快或很慢、阅读问题、写作问题、解释触摸、温度、运动、肢体位置和精细辨别困难、将感觉印象整合或模式化成对心理有意义的数据、部分或全部视力丧失、眼肌无力和双视(复视)、视力模糊、判断距离的问题、不自主的眼球运动(眼球震颤)、不耐受光(畏光)、听力(诸如听力减弱或丧失、耳中有鸣声(耳鸣)、对声音的敏感度增加)、嗅觉丧失或减弱(嗅觉缺失症)、味觉丧失或减弱、与癫痫相关的惊厥，所述惊厥可能是几种类型并且可能涉及意识、感官知觉或运动肌移动、对肠和膀胱的控制中断、失眠、耐力丧失、食欲改变、体温调节、月经困难、依赖行为、情绪化能力、缺乏动力、易怒、攻击性、抑郁、去抑制或拒绝/缺乏意识。
“变体”在本文中用于描述因氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列方面不同，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“snp”是指为单核苷酸多态性的变体。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫应答的能力。变体还在本文中用于描述具有与参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，所述参考蛋白质具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被公认为通常涉及微小变化。如本领域中所理解的，这些微小变化可以部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来鉴定。kyte等人,j.mol.biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域中已知的是相似的疏水性指数的氨基酸可被取代并仍然保留蛋白质功能。在一个方面，疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于揭示将产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的背景下考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽最大的局部平均亲水性，其是一种已经被报道与抗原性和免疫原性良好关联的有用量度。美国专利号4,554,101以引用的方式全部并入本文。如本领域中所了解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用具有彼此在±2内的亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者都受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察结果一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸、并且特别是那些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其它特性所揭示的。
“载体”在本文中用于描述可以转运其已连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，所述质粒是指可以将额外的dna区段连接到其中的环状双链dna环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的dna区段可以被连接到病毒基因组中。某些载体可以在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如包含细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞中之后整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们所可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，适用于重组dna技术中的表达载体常常呈质粒形式。“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，可以使用起等同功能的其它形式的表达载体，诸如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。就这方面而言，载体的rna型式(包括rna病毒载体)也可以用于本公开的上下文中。
除非本文另外定义，否则结合本公开使用的科学和技术术语将具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。例如，结合本文中描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质及核酸化学以及杂交使用的任何命名法以及其技术是本领域中熟知并且常用的那些。术语的含义和范围应为清晰的；然而，如果存在任何隐含歧义，则本文中所提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非另外通过上下文要求，否则单数的术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
2.诊断和评估受试者是否遭受创伤性脑损伤
本公开涉及帮助诊断、预后、风险分层和评估受试者是否已遭受头部损伤或可能已遭受头部损伤、包括受试者是否遭受tbi或轻度tbi类型的方法。这些方法可以帮助确定疑似头部损伤的人类受试者中tbi的程度和/或严重性，包括确定受试者是否已遭受轻度tbi(如果是则确定所遭受轻度tbi的亚类)，受试者是否已遭受中度至重度tbi或受试者是否尚未遭受tbi。更具体地，本公开的生物标志物可以用于诊断测试中以确定、鉴定和/或评估个体、受试者或患者的脑损伤状态，例如以诊断tbi。在一些实施方式中，tbi状态可以包括确定患者的亚临床脑损伤状态或sci状态，例如以诊断个体、受试者或患者中的sci。检测或测量本公开的生物标志物可以帮助诊断tbi，并且可以帮助例如针对轻度tbi的亚类帮助生成tbi表征。
确定受试者是否患有轻度tbi(或mtbi的亚类)或中度至重度tbi可包括测量或检测一种或多种tbi生物标志物并将该信息与其他信息(例如临床评估数据)整合，以确定受试者很有可能已遭受tbi，如果是则确定所遭受tbi的类型。该方法可以包括在疑似头部损伤后约24小时内，例如约2小时内，对获自人类受试者的样品进行测定，以测量或检测样品中一种或多种tbi生物标志物的水平，并确定受试者是否已遭受轻度或中度至重度的创伤性脑损伤(stbi)。在一些实施方式中，当样品中一种或多种tbi生物标志物的水平与一种或多种tbi生物标志物的参考水平(例如对照样品中tbi生物标志物的水平)相比改变(例如更高或更低的表达水平)时，将受试者确定为患有tbi和/或轻度tbi的亚类。在其他实施方式中，当检测到样品中一种或多种tbi生物标志物的水平时，将受试者确定为患有tbi和/或轻度tbi的亚类，而无需确定生物标志物水平或与参考或对照样品进行比较。
样品可以是生物样品。本文所用的“样品”可以互换使用(例如样品、测试样品或生物样品)，并且可以是血液样品，例如全血、组织、尿液、血清、血浆、羊水、脑脊髓液、胎盘细胞或组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞。在一些实施方式中，该方法可包括在在受试者疑似损伤后约48小时内从受试者获得样品，并使该样品与用于tbi生物标志物的抗体接触以允许形成抗体和tbi生物标志物的复合物。该方法还包括检测所得的抗体-tbi生物标志物复合物。
在一些实施方式中，在一个或多个时间点确定tbi生物标志物的水平之前或之后，受试者可能已接受格拉斯哥昏迷量表评分。在某些实施方式中，基于格拉斯哥昏迷量表评分，受试者可能疑似患有轻度tbi。在某些实施方式中，基于异常头部ct，受试者可能疑似患有轻度tbi。在一些实施方式中，受试者在进行测定之前或之后已接受ct扫描。在一些实施方式中，受试者具有正常头部ct。在一些实施方式中，tbi生物标志物的参考水平与患有tbi的受试者相关。在一些实施方式中，tbi生物标志物的参考水平与格拉斯哥昏迷量表评分相关。
通常，tbi生物标志物的参考水平也可以用作基准，针对其评估在测定测试样品中的tbi生物标志物时所获得的结果。通常，在进行这种比较时，tbi生物标志物的参考水平是通过在适当的条件下进行足够多次的特定测定，以使分析物的存在、量或浓度与tbi的特定阶段或终点或特定标记可以相联系或关联。通常，通过参考受试者(或受试者群体)的测定获得tbi生物标志物的参考水平。所测量的tbi生物标志物可以包括其片段、其降解产物和/或其酶促裂解产物。在某些实施方式中，参考水平可以与尚未遭受头部损伤的对照受试者相关。
在本文描述的方法中所采用测定的性质不是关键的，并且所述测定可以是本领域已知的任何测定，例如免疫测定、蛋白质免疫沉淀、免疫电泳、蛋白质印迹、或蛋白质免疫染色，或光谱法例如高效液相色谱(hplc)、液相色谱-质谱(lc/ms)、dia-ms、dda-ms、prm-ms或srm/mrm-ms质谱分析，这些可以是直接的或与富集一起(例如，富集可以通过针对靶蛋白的抗体进行)。用于在质谱分析之前用选择性富集候选生物标志物蛋白样品的捕获试剂包括但不限于适体、抗体、核酸探针、嵌合体、小分子、f(ab')2片段、单链抗体片段、fv片段、单链fv片段、核酸、凝集素、配体结合受体、亲和体、纳米抗体、锚蛋白、结构域抗体、替代抗体支架(例如双抗体等)印迹聚合物、高亲和性多聚体、类肽、拟肽、肽核酸、苏糖核酸、激素受体、细胞因子受体和合成受体，以及它们的修饰和片段。通过富集，还可以使用基质辅助的激光解吸/电离飞行时间(maldi-tofms或maldi-tof)。而且，该测定可以以本领域技术人员已知的临床化学形式进行。
3.tbi生物标志物组
本公开的生物标志物可以用于诊断测试中以评估、确定和/或限定(在本文中可互换使用)患者的脑损伤状态，例如tbi状态。短语“脑损伤状态”包括该病的任何明显表现，包括没有脑损伤。例如，脑损伤状态包括但不限于患者中是否存在脑损伤、发生脑损伤的风险、脑损伤的阶段或严重性、脑损伤的进展(例如脑损伤的进展随时间变化)、脑损伤治疗的有效性或反应(例如临床随访和治疗后对脑损伤的监测)、以及脑损伤的类型如tbi或tbi的亚类。基于此状态，可能会指示其他程序，包括其他诊断测试或治疗程序或方案。
诊断测试正确预测状态的能力通常通过测定的敏感性、测定的特异性或接受者操作特征(“roc”)曲线下的面积来测量。敏感性是测试预测为阳性的真实阳性百分比，而特异性是测试预测为阴性的真实阴性百分比。roc曲线提供了测试敏感性与1-特异性的关系。roc曲线下的面积越大，测试的预测值越有效。测试效用的其他有用度量是阳性预测值和阴性预测值。阳性预测值是测试阳性的人实际为阳性的百分比。阴性预测值是测试阴性的人实际为阴性的百分比。
对本公开中描述的数据以及来自tbi和对照患者组的临床数据的分析(导致产生各种tbi生物标志物)可以单独使用、或彼此以各种组合使用、以及与其他生物标志物以组的形式用于诊断和/或评估受试者的脑损伤。tbi生物标志物组可以包括本文公开的任何tbi生物标志物，并且可以包括对应于不同蛋白质的一种以上至多达20种不同生物标志物。tbi生物标志物组还可包括非tbi生物标志物(例如测定对照生物标志物)和先前被鉴定为与tbi相关的生物标志物(例如gfap和/或uch-l1和/或nse)。在一些实施方式中，本公开的生物标志物组可以显示不同tbi状态的统计差异。使用这些生物标志物的诊断测试可以显示roc为至少0.6、至少约0.7、至少约0.8或至少约0.9。
取决于tbi的类型或亚类(例如tbi表征)，可以差异地存在/表达tbi生物标志物，因此，超过一种tbi生物标志物的组可用于帮助确定脑损伤状态。在一些实施方式中，使用本文所述的方法在患者样品中测量生物标志物，并将其与例如预定的生物标志物水平进行比较并与tbi状态相关联。在一些实施方式中，然后可以将测量值与将正tbi状态与负tbi状态区分开的相关诊断量、截止值或多元模型评分进行比较。诊断量表示生物标志物的测量量，高于或低于该量则将患者被分类为具有特定的tbi状态。例如，如果在脑损伤期间与对照受试者(例如未经历tbi的受试者)相比，生物标志物被上调，则在诊断截止值以上的测量量可以提供tbi的诊断。另外，如果生物标志物在脑损伤期间存在并且在对照中不可检测，则任何可检测的测量量都可以提供脑损伤的诊断。可选地，如果在脑损伤期间生物标志物被下调，则在诊断截止值处或诊断截止值以下的测量量可以提供没有脑损伤的诊断。另外，如果生物标志物在脑损伤期间不存在并且在对照中可检测，则任何可检测的测量量都可以提供没有脑损伤的诊断。如本领域中众所周知的，通过调节测定中使用的特定诊断截止值，可以根据诊断医生的偏好来增加诊断测定的敏感性或特异性。在特定的实施方式中，可以例如通过测量统计上显著数量的来自具有不同脑损伤状态的患者的样品中的生物标志物的量，并画出适合所需特异性和敏感性水平的截止值来确定特定的诊断截止值。
确实，如本领域技术人员将理解的，存在许多使用两种或更多种生物标志物的测量值的方法，以改善所研究的诊断问题。在一种非常简单但仍然有效的方法中，如果样品中至少一种所研究的标志物为阳性，则假定为阳性结果。
此外，在某些实施方式中，为生物标志物组的标志物测量的值被数学地组合，并且组合的值与潜在的诊断问题相关。可以通过任何适当的现有技术数学方法来组合生物标志物值。使标志物组合与疾病状态相关联的著名数学方法采用的方法包括判别分析(da)(例如线性、二次、正则da)，判别功能分析(dfa)、内核方法(例如svm)、多维缩放(mds)、非参数方法(例如k-最近邻分类法)、pls(偏最小二乘)、基于树的方法(例如逻辑回归、cart、随机森林方法、增强/分组方法)、通用线性模型(例如逻辑回归)、基于主成分的方法(例如simca)、广义加性模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。技术人员在选择合适的方法以评价本发明的生物标志物组合方面时将没有问题。在一个实施方式中，用于关联本发明的生物标志物组合例如以诊断脑损伤的方法选自da(如线性、二次、正则判别分析)、dfa、内核方法(如svm)、mds、非参数方法(如k-最近邻分类法)、pls(偏最小二乘)、基于树的方法(如逻辑回归、cart、随机森林方法、增强方法)或广义线性模型(如逻辑回归)和主成分分析。在以下参考中找到与这些统计方法有关的详情：ruczinski等人,12j.ofcomputalalandgraphicalstatistics475-511(2003)；friedman,j.h.,84j.oftheamericanstatisticalassociation165-75(1989)；hastie,trevor,tibshirani,robert,friedman,jerome,theelementsofstatisticallearning,springerseriesinstatistics(2001)；breiman,l.,friedman,j.h.,olshen,r.a.,stone,c.j.classificationandregressiontrees,california:wadswort(1984)；breiman,l.,45machinelearning5-32(2001)；pepe,m.s.,thestatisticalevaluationofmedicaltestsforclassificationandprediction,oxfordstatisticalscienceseries,2003；以及duda,r.o.,hart,p.e.,stork,d.g.,patternclassification,wileyinterscience,第二版(2001)。
4.使用生物标志物评估tbi特征
在一些实施方式中，本公开提供了基于一种或多种tbi生物标志物的检测到、未检测到和/或检测水平表征和/或分类tbi的方法，例如表征tbi的不同类型tbi的严重性。tbi的每个类别或亚类都可能具有生物标志物的特征水平或一组生物标志物的相对水平(表征)。在一个实施方式中，本公开提供了用于评估患者中tbi状态随时间的进展的方法，包括进展(恶化)和消退(改善)。随着时间，tbi生物标志物的数量或相对数量(例如模式或表征)可能改变。例如，生物标志物“x”可能因脑损伤而增加，而生物标志物“y”可能因脑损伤而降低。因此，这些生物标志物随着时间趋向于脑损伤或没有脑损伤的趋势增加或减少将表明该病程。因此，该方法包括至少在两个不同的时间点测量患者中一种或多种生物标志物的水平(例如第一时间和第二时间，并且比较变化，如果有的话)。
在一些实施方式中，可以通过测量相关的生物标志物然后将它们提交分类算法或将它们与参考量(例如与特定的类型或亚类相关的生物标志物的预定水平或模式)进行比较来表征tbi的类别或亚类。
在一些实施方式中，使用诸如“已知样本”的样本生成的数据然后可以用于“训练”分类模型。“已知样本”是已预先分类的样本。用于形成分类模型的数据可以称为“训练数据集”。用于形成分类模型的训练数据集可以包括原始数据或预处理数据。训练后，分类模型可以识别使用未知样本生成的数据中的模式。然后可以使用分类模型将未知样本分类。例如，这在预测特定生物样品是否与某种生物状况(例如患病或未患病)有关时可能是有用的。
可以使用任何合适的统计分类或学习方法来形成分类模型，该方法试图基于数据中存在的客观参数将数据主体分离为各类。分类方法可以是有监督的或无监督的。有监督和无监督分类过程的示例在jain,“statisticalpatternrecognition:areview”，ieeetransactionsonpatternanalysisandmachineintelligence，第22卷第1期，2000年1月22日中进行了描述，其内容在此引用作为参考。
在监督分类中，将包含已知类别的示例的训练数据呈现给学习机制，该学习机制学习定义每个已知类别的一组或多组关系。然后可以将新数据应用于学习机制，该学习机制随后使用所学习的关系对新数据进行分类。监督分类过程的示例包括线性回归法(例如多元线性回归(mlr)、偏最小二乘(pls)回归和主成分回归(pcr))、二元决策树(例如递归分区法，例如cart)、人工神经网络例如反向传播网络、判别分析(例如贝叶斯分类法或菲舍尔分析)、逻辑分类法和支持向量分类法(支持向量机)。
另一监督分类方法是递归分区法。递归分区法使用递归分区树对源自未知样本的数据进行分类。paulse等人的美国专利申请号20020138208a1，“用于分析质谱的方法”中提供了有关递归分区法的更多详细信息。
在其他实施方式中，可以使用无监督学习方法来形成所创建的分类模型。无监督分类尝试基于训练数据集中的相似性来学习分类，而不预先分类从中得出训练数据集的光谱。无监督学习方法包括聚类分析。聚类分析试图将数据划分为“聚类”或组，理想情况下其应具有彼此非常相似且与其他聚类的成员非常不同的成员。然后使用某种距离度量来测量相似性，该距离度量可测量数据项之间的距离，并将彼此更靠近的数据项聚类在一起。聚类技术包括macqueen的k-means算法和kohonen的自组织映射算法。
例如，pct国际公开号wo01/31580(barnhill等人，“用于识别生物系统中的模式的方法和设备及其使用方法”)，美国专利申请公开号2002/0193950(gavin等人，“方法或分析质谱”)，美国专利申请公开号2003/0004402(hitt等人，“基于生物学数据的隐藏模式区分生物学状态的方法”，以及美国专利申请公开号2003/0055615(zhang和zhang，“用于处理生物表达数据的系统和方法”)中描述了宣称用于对生物信息进行分类的学习算法。
分类模型可以在任何合适的数字计算机上形成并在其上使用。合适的数字计算机包括使用任何标准或专用操作系统(例如基于unix、
根据本发明实施方式的训练数据集和分类模型可以由数字计算机执行或使用的计算机代码来体现。计算机代码可以存储在任何合适的计算机可读介质上，包括光盘或磁盘、棒、磁带等，并且可以用任何合适的计算机编程语言(包括r、c、c++、visualbasic等)编写。
上述学习算法对于开发已发现的生物标志物的分类算法以及寻找新的一种或多种生物标志物都是有用的。通过提供单独或组合使用的生物标志物的诊断值(例如截止点)，分类算法又为诊断测试奠定了基础。
5.遭受tbi的受试者的治疗和监测
可基于评估来治疗或监测被鉴定或评估为患有tbi的受试者，该评估可包括检测或测量各种tbi生物标志物。在一些实施方式中，该方法进一步包括用治疗来治疗被评估为患有tbi的人类受试者，该治疗可以采取多种形式，这取决于头部损伤的严重程度。例如，对于患有轻度tbi的受试者，治疗可以包括一次或多次休息，放弃体育锻炼(如运动)，避光或在阳光下戴太阳眼镜，缓解头痛或偏头痛的药物，抗-恶心药物等。对患有严重tbi的患者的治疗可能包括施用一种或多种合适的药物(例如利尿药，抗惊厥药物，用于使人镇静并使之陷入药物性昏迷的药物，或其他药学或生物药学药物(已知或未来开发用于tbi的治疗)，一种或多种外科手术(例如血肿切除，颅骨骨折修复，减压颅骨切除术等)和一种或多种疗法(例如一种或多种康复，认知行为疗法，愤怒管理，心理咨询等)。在一些实施方式中，该方法还包括监测被评估为患有创伤性脑损伤(例如轻度或中度至重度创伤)的人类受试者。在一些实施方式中，可以用ct扫描或mri监测被鉴定为患有创伤性脑损伤、例如轻度创伤性脑损伤或重度创伤性脑损伤的受试者。
在一个实施方式中，本公开提供了用于确定患者中发展tbi的风险的方法。tbi生物标志物百分比、量或模式是各种风险状态(例如高、中或低)的特征。可以通过测量相关的生物标志物，然后将其提交分类算法，或将它们与参考量(例如与特定风险水平相关的生物标志物的预定义水平或表征)进行比较，以确定发展tbi的风险。
在一些实施方式中，治疗已遭受tbi的受试者可以包括基于使用一种或多种tbi生物标志物而建立的tbi状态来管理患者治疗。这样的管理可以包括在确定tbi状态之后医师或临床医生的动作。例如，如果医师诊断为轻度tbi，则将遵循一定的监测制度。然后，使用本公开的方法评估tbi过程可能需要某种tbi治疗方案。可选地，可以在诊断为非tbi之后进行进一步测试，以确定患者可能患有的特定疾病。另外，如果诊断测试未给出tbi状态的结论，则可能需要进一步测试。
在另一个实施方式中，本公开提供了用于在tbi治疗的情况下确定药物的治疗功效的方法。这些方法可用于进行药物的临床试验以及监测患者使用药物的进程。治疗或临床试验涉及以特定方案施用药物。该方案可以随着时间涉及单剂药物或多剂药物。医生或临床研究人员在给药过程中监视药物对患者或受试者的作用。如果药物对该病症具有药理学影响，则本发明的一种或多种tbi生物标志物的量或相对量(例如模式或表征)可以朝非脑损伤的方向变化。因此，在治疗过程中，可以跟踪患者体内一种或多种tbi生物标志物的过程。
因此，该方法可以包括在接受药物治疗的患者中测量一种或多种tbi生物标志物，并将生物标志物水平与患者的tbi状态相关联(例如通过与对应于不同脑损伤状态的生物标志物的预定水平进行比较)。该方法的一个实施方式可以包括在药物治疗的过程中在至少两个不同的时间点确定一种或多种tbi生物标志物的水平(例如第一时间和第二时间，并且比较变化，如果有的话)。例如，可以在给药之前或之后或在给药期间的两个不同时间点测量一种或多种tbi生物标志物的水平。根据这些比较确定治疗效果。如果治疗有效，则一种或多种tbi生物标志物将趋于正常，而如果治疗无效，则一种或多种tbi生物标志物将趋向脑损伤。
6.tbi的生物标志物
本文所述的方法可以用于鉴定一种或多种tbi生物标志物或候选tbi生物标志物，其可以帮助诊断和评估可能患有tbi的受试者。示例性的tbi生物标志物描述如下。
a.纳入的tbi生物标志物
如下所述，以下tbi生物标志物被鉴定为能够将健康受试者与单独或联合检测时患有tbi的受试者区分开：
埃兹蛋白(ezr)。
ezr也被称为细胞绒毛蛋白或绒毛蛋白-2，并且编码在人类中由ezr基因编码的蛋白质。埃兹蛋白的n-端包含ferm结构域，该结构域进一步细分为三个子域。c-端包含erm域。埃兹蛋白被认为参与主要细胞骨架结构与质膜的连接。在上皮细胞中，是在顶端形成微绒毛和膜褶皱所需的。与plekhg6一起，是正常微胞吞作用所需的。(uniprot主登录号：p15311。)
4-三甲基氨基丁醛脱氢酶(aldh9a1或al9a1)。
al9a1也称为4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、tmabadh、醛脱氢酶e3同工酶、醛脱氢酶家族9成员a1、γ-氨基丁醛脱氢酶，r-氨基丁醛脱氢酶。该蛋白质将γ-三甲基氨基丁醛转化为γ-丁甜菜碱，并在nad依赖性反应中催化大量醛不可逆地氧化为相应的酸。该蛋白质在成人肝脏、骨骼肌和肾脏中高表达，在心脏、胰腺、肺和脑中低水平表达，并在脑的所有区域中表达。表达水平在不同的大脑区域中是可变的，在脊髓中最高且在枕骨中最低。(uniprot主登录号：p49189。)
atp合酶亚基γ，线粒体(atpg)。
线粒体膜atp合酶(f1f0atp合酶或复合物v)在跨膜的质子梯度存在下由adp产生atp，该质子梯度是由呼吸链的电子传输复合物产生的。f型atp酶由两个结构域组成，f1-包含膜外催化核心，f0-包含膜质子通道，通过中央茎和周围茎连接在一起。在催化过程中，f1的催化结构域中的atp合成通过中心茎亚基的旋转机制与质子易位耦合。复合物f1结构域的一部分和作为复合物旋转元素一部分的中央茎。γ亚基突出到由α3β3形成的催化结构域中。中心茎针对周围α3β3亚基的旋转导致β亚基上三个单独催化位点中的atp水解。(uniprot主登录号：p36542。)
补体c1r亚组分-样蛋白(c1rl)。
c1rl介导内质网中hp/触珠蛋白的蛋白水解切割。与c1rl相关的疾病包括卵巢腺癌。(uniprot主登录号：q9nzp8。)
cullin缔合nedd8解离的蛋白质1(cand1)。
cand1是scf(skp1-cul1-f-box蛋白)e3泛素连接酶复合物的关键装配因子，其促进scf复合物中底物识别f-box亚基的交换，从而在scf复合物的细胞库中起关键作用。充当f-box蛋白交换因子。cand1的交换活性与联结共轭的循环有关：在树突状状态下，与cullin结合的cand1结合cul1-rbx1，增加scf复合物的解离并促进f-box蛋白的交换。可能在其他cullin-ringe3泛素连接酶复合物中起类似作用。(uniprot主登录号：q86vp6。)
epiplakin(epipl或eppk1)。
epipl是细胞骨架连接蛋白，其连接至中间丝并响应于应激而控制它们的重组。响应诸如伤口愈合的机械应力，通过减慢角质形成细胞的迁移和增殖并加速角质形成细胞增殖中的角蛋白束与细胞运动的机制相关联，从而有助于组织结构。然而，在角膜上皮的伤口愈合中，它也正调节细胞分化和增殖，而负调节迁移，从而控制角膜上皮的形态发生和完整性。响应细胞压力，可能通过保护角蛋白丝免受破坏，在角蛋白丝重组中发挥作用。在肝和胰腺损伤期间，该蛋白通过陪伴疾病引起的中间丝重组(通过相似性)起到保护作用。(uniprot主登录号：p58107。)
羟酰基谷胱甘肽水解酶，线粒体(glo2或hagh)。
glo2是硫酯酶，其催化s-d-乳酰基-谷胱甘肽的水解以形成谷胱甘肽和d-乳酸。(uniprot主登录号：q16775。)
免疫球蛋白重恒定α2(igha2)。
igha2是免疫球蛋白重链的恒定区。免疫球蛋白也称为抗体，是b淋巴细胞产生的膜结合或分泌的糖蛋白。在体液免疫的识别阶段，与膜结合的免疫球蛋白起受体的作用，一旦结合特定抗原，就会触发b淋巴细胞的克隆扩增和分化为分泌免疫球蛋白的浆细胞。分泌的免疫球蛋白介导体液免疫的效应期，从而消除结合的抗原。抗原结合位点由一条重链的可变结构域及其相关轻链的可变结构域形成。因此，每个免疫球蛋白具有两个对特定抗原具有显著亲和力的抗原结合位点。可变结构域通过称为v-(d)-j重排的过程组装，然后可以进行体细胞超突变，其在暴露于抗原和选择后允许对特定抗原的亲和力成熟。igα是人体分泌物中主要的免疫球蛋白类别。(uniprot主登录号：p01877。)
怀孕区蛋白(pzp)。
pzp能够通过独特的“诱捕”机制抑制所有四类蛋白酶。该蛋白具有称为“诱饵区”的肽段，其中包含针对不同蛋白酶的特异性切割位点。当蛋白酶切割诱饵区时，会在捕获蛋白酶的蛋白质中诱导构象变化。捕获的酶对低分子量底物保持活性(对高分子量底物的活性大大降低)。在诱饵区切割后，硫酯键被水解并介导蛋白质与蛋白酶的共价结合。(uniprot主登录号：p20742。)
苏氨酸-trna连接酶，细胞质(sytc或tars)。
sytc催化反应：atp+l-苏氨酸+trna(thr)＝amp+二磷酸+l-苏氨酸-trna(thr)。它受到硼瑞林(bn，ic50为7nm)的抑制，该硼瑞林与蛋白质中的4个不同亚位点结合，从而阻止所有3种底物的结合。(uniprot主登录号：p26639。)
酪氨酸-trna连接酶，细胞质(syyc或yars)。
syyc在两步反应中催化酪氨酸与trna(tyr)的附着：酪氨酸首先被atp活化以形成tyr-amp，并然后转移至trna(tyr)的受体端。(uniprot主登录号：p54577。)
蛋白abhd14b(abheb或abhd14b)。
abheb对对硝基苯基丁酸酯表现出水解酶活性(体外)并且可以激活转录。(uniprot主登录号：q96iu4。)
动力蛋白-1-样蛋白(dnm1l)。
dnm1l在线粒体和过氧化物酶体分裂中起作用。该蛋白通过低聚作用介导膜裂变进入膜相关的管状结构，该结构围绕着分裂位点，通过gtp水解依赖性机制来收缩和切断线粒体膜。通过其在线粒体分裂中的功能，它可通过抑制氧化损伤来确保至少某些类型的有丝分裂后神经元(包括浦肯野细胞)的存活。它是包括小脑在内的正常大脑发育所需的。它有助于神经管形成过程中发育调控的凋亡。它是细胞凋亡期间正常速率的细胞色素c释放和半胱天冬酶活化所需的；该需求可能取决于细胞类型和生理凋亡提示。它在有丝分裂期间在线粒体裂变中起重要作用。它是形成内吞囊泡所需的。可以通过与bcl2l1同工型bcl-x(l)结合来调节突触小泡膜动力学，该bcl2l1同工型bcl-x(l)刺激其在突触小泡中的gtp酶活性；该功能可能需要mff将其募集到含网格蛋白的囊泡中。并且它是编程的坏死执行所需的。(uniprot主登录号：o00429。)
ficolin-2(fcn2)。
fcn2可以通过激活凝集素补体途径而在先天免疫中起作用。它表现出钙依赖性和glcnac结合凝集素。它增强了嗜中性粒细胞对鼠伤寒沙门氏菌的吞噬作用，表明通过胶原蛋白区域的调理作用。(uniprot主登录号：q15485。)
转化的formin-2(ifn2)。
ifn2参与肌动蛋白丝的切断，并加速它们的聚合和解聚。(uniprot主登录号：q27j81。)
角蛋白，ii型细胞骨架2表皮(k22e或krt2)。
k22e是一种中间蛋白并被认为有助于终末角化。该蛋白质与角质形成细胞的活化、增殖和角质化有关。(uniprot主登录号：p35908。)
丝裂原活化的蛋白激酶激酶激酶5(m3k5或map3k5)。
m3k5是丝氨酸/苏氨酸激酶，其充当map激酶信号转导途径的重要组成部分。它在环境变化引起的细胞反应级联中起重要作用。它介导确定细胞命运如分化和存活的信号。它在线粒体依赖性半胱天冬酶激活的细胞凋亡信号转导途径中起着至关重要的作用。map3k5/ask1是先天性免疫应答所需的，这对于宿主防御多种病原体至关重要。它通过受体如肿瘤坏死因子(tnf)或脂多糖(lps)介导的炎症信号介导各种应激源如氧化应激的信号转导。一旦激活，它通过多种map激酶激酶(如map2k4/sek1、map2k3/mkk3、map2k6/mkk6和map2k7/mkk7)的磷酸化和激活来充当mkk/jnk信号转导级联和p38mapk信号转导级联的上游激活因子。这些map2k依次激活p38mapk和c-junn末端激酶(jnk)。p38mapk和jnks都控制转录因子激活蛋白1(ap-1)。(uniprot主登录号：q99683。)
核受体共抑制因子1(ncor1)。
ncor1通过某些核受体介导转录抑制。它是复合物的一部分，该复合物促进组蛋白去乙酰化和抑制性染色质结构的形成，这可能阻碍基础转录因子的进入。它参与由bcl6产生的转录阻遏物活性。(uniprot主登录号：o75376。)
suprabasin(sbsn)。
sbsn是在小鼠和人分化角质形成细胞中表达的新基因。它被认为是从分层上皮的棘突层分泌的，并可能在第2号染色体上与真皮因子α/β和kdap形成新的基因复合体。(uniprot主登录号：q6uwp8。)
双功能谷氨酸/脯氨酸-trna连接酶(syep或eprs)。
syep在两步反应中催化同源氨基酸与相应trna的附着：该氨基酸首先被atp激活以与amp形成共价中间体，然后被转移至同源trna的受体端。它是gait(γ干扰素激活的翻译抑制因子)复合物的组成部分，该复合物在炎症过程中介导γ干扰素诱导的转录选择性翻译抑制。干扰素-γ激活并随后磷酸化后，它会从多合成酶复合物中解离，并组装成gait复合物，该复合物与多种炎症性mrna(例如铜蓝蛋白)的3'-utr中的含茎环的gait元件结合并抑制其翻译。(uniprot主登录号：p07814。)
三肽基-肽酶2(tpp2)。
tpp2是在泛素-蛋白酶体途径中作用于26s蛋白酶体下游的蛋白水解级联的组分。在抑制后者的条件下，它可能能够在一定程度上补充26s蛋白酶体的功能。它刺激脂肪生成(通过相似性)。(uniprot主登录号：p29144。)
膜联蛋白a6(anxa6)。
anxa6可以与cd21缔合，并且可以调节ca2+从细胞内存储的释放。它可以被分泌。(uniprot主登录号：p08133。)
内质网氨基肽酶1(erap1)。
erap1是一种氨基肽酶，在肽修整中起着核心作用，这是产生大多数hlai类结合肽所需的步骤。肽修整对于定制更长的前体肽以使其适合在mhci类分子上呈递所需的正确长度至关重要。强烈优选长9-16个残基的底物。迅速将13-mer降解为9-mer，然后停止。它优先水解残基leu和带有疏水性c末端的肽，而对带电荷c末端的肽具有弱活性。它可能在肽激素失活中起作用。它可能通过血管紧张素ii失活和/或肾脏中缓激肽的产生而参与血压调节。(uniprot主登录号：q9nz08。)
凝血因子v(fa5或f5)。
fa5是止血的中央调节因子。它是导致凝血酶原活化为凝血酶的因子xa的凝血酶原酶活性的关键辅助因子。(uniprot主登录号：p12259。)
6-磷酸葡萄糖异构酶(g6pi或gpi)。
g6pi是糖酵解酶，并且哺乳动物g6pi可以充当肿瘤分泌的细胞因子和刺激内皮细胞运动的血管生成因子(amf)。在细胞质中，基因产物作为糖酵解酶(6-磷酸葡萄糖异构酶)起作用，将六磷酸葡萄糖(g6p)和六磷酸果糖(f6p)相互转化。在细胞外，编码的蛋白质(也称为神经白蛋白)作为促进骨骼运动神经元和感觉神经元存活的神经营养因子，并作为引起免疫球蛋白分泌的淋巴因子起作用。基于作为肿瘤分泌细胞因子和血管生成因子的附加功能，编码的蛋白也称为自分泌运动因子(amf)。该基因的缺陷是非球囊性溶血性贫血的原因，严重的酶缺乏症可能与胎儿积水、新生儿立即死亡和神经功能障碍有关。选择性剪接导致多个转录变体。(uniprot主登录号：p06744。)
肌球蛋白轻链激酶，平滑肌(mylk)。
mylk是钙/钙调蛋白依赖性肌球蛋白轻链激酶，通过肌球蛋白轻链(mlc)的磷酸化参与平滑肌收缩。它还通过非激酶活性调节肌动蛋白-肌球蛋白的相互作用。它使ptk2b/pyk2和肌球蛋白轻链磷酸化。参与炎症反应(例如细胞凋亡、血管通透性、白细胞渗血)，细胞运动性和形态，气道反应过度和其他与哮喘有关的活动。它是滋补气道平滑肌收缩所需的，这是生理和哮喘气道抵抗所必需的。它是肠胃蠕动是所必需的。它可能通过调节细胞骨架重排而参与内皮以及血管渗透性的调节。在神经系统中，已显示出它可以控制培养过程中星形细胞过程的生长，并参与培养的交感神经节细胞之间形成的突触中的递质释放。它是导致成纤维细胞凋亡的信号转导序列的关键参与者。它在上皮细胞存活的调节中起作用。它是上皮伤口愈合所需的，尤其是在包线伤口闭合期间放线肌球蛋白环收缩期间。它介导依赖rhoa的膜起泡。它通过诱导其在质膜上的亚细胞定位，以钙依赖性信号传导触发trpc5通道活性。它促进细胞迁移(包括肿瘤细胞)和肿瘤转移。通过磷酸化激活ptk2b/pyk2介导itgb2激活，因此对于急性肺损伤(ali)触发中性粒细胞迁移至关重要。它可能调节视神经头星形胶质细胞的迁移。它可能参与有丝分裂细胞骨架的调节。它可以通过调节结周放线菌素环中的zo-1交换来调节紧密连接。它介导烧伤引起的微血管屏障损伤；通过使mlc磷酸化来触发微血管通透性发展中的内皮细胞收缩。它对于肠屏障功能障碍至关重要。它可以通过重组细胞骨架f-肌动蛋白和紧密连接的zo-1来弥补贾第鞭毛虫介导的贾第鞭毛虫肠道感染过程中上皮屏障功能的降低。它对于低渗性诱导的ca2+进入以及随后激活宫颈癌细胞中的体积敏感性有机渗透压/阴离子通道(vsoac)而言是必需的。它通过抗凋亡导致乳腺癌细胞的高增殖能力。(uniprot主登录号：q15746。)
血清淀粉样蛋白p成分(samp或apcs)。
samp可以与dna和组蛋白相互作用，并且可以清除从受损的循环细胞释放的核材料。它也可以起钙依赖性凝集素的作用。(uniprot主登录号：p02743。)
在一些实施方式中，基于来自受试者的样品中检测到一种或多种这些tbi生物标志物，并且在对照受试者(例如未患有tbi的受试者)中未检测到一种或多种tbi生物标志物，可以将以上列出的一种或多种tbi生物标志物用于确定受试者已遭受tbi。这些tbi生物标志物可包括al9a1，atpg，c1rl，epipl，igha2，pzp，sytc，syyc，abheb，dnm1l，fcn2，inf2，k22e，m3k5，ncor1，sbsn，syep，tpp2，anxa6，erap1，ezri，fa5，g6pi，mylk，samp或其任何组合。在受试者中测量或检测到一种或多种这些tbi生物标志物足以表明该受试者已遭受tbi，而无需检测、测量、比较和/或定量对照受试者中一种或多种tbi生物标志物的量、浓度和/或表达水平。尽管这些tbi生物标志物中的一种或多种可能存在于对照受试者中，或者存在于尚未患有tbi的受试者中，但是它通常以无法通过常规手段检测的量存在，如本文所述。因此，在某些情况下，在受试者中检测到一种或多种这些tbi生物标志物表明该受试者遭受tbi。
在一些实施方式中，基于来自受试者的样品中检测到一种或多种这些tbi生物标志物，并且在对照受试者(例如未患有tbi的受试者)中未检测到一种或多种tbi生物标志物、或者在已遭受轻度tbi的受试者中未检测到，可以将以上列出的一种或多种tbi生物标志物用于确定受试者已遭受重度tbi。这些tbi生物标志物可包括atpg，c1rl，syyc或其任何组合中的一种或多种。在受试者中测量或检测到一种或多种这些tbi生物标志物足以表明该受试者已遭受重度tbi，而无需检测、测量、比较和/或定量对照受试者或已遭受轻度tbi的受试者中一种或多种tbi生物标志物的量、浓度和/或表达水平。
在一些实施方式中，基于来自受试者的样品中检测到一种或多种这些tbi生物标志物的量、浓度和/或表达水平高于对照受试者中相应tbi生物标志物的量、浓度和/或表达水平，可以使用以上列出的一种或多种tbi生物标志物来确定该受试者已遭受tbi。这些tbi生物标志物可以包括cand1和glo2或其任何组合中的一种或多种。与对照受试者(例如未患有tbi的受试者)相比，在受试者中测量或检测到一种或多种这些tbi生物标志物的升高水平可以足够表明该受试者已遭受tbi，在某些情况下，可以足够表明该受试者已遭受重度tbi。
在一些实施方式中，基于来自受试者的样品中检测到一种或多种这些tbi生物标志物的量、浓度和/或表达水平高于或低于对照受试者中相应tbi生物标志物的量、浓度和/或表达水平，可以使用以上列出的一种或多种tbi生物标志物来确定该受试者已遭受tbi。这些tbi生物标志物可以包括abheb，al9a1，dnm1l或其任何组合中的一种或多种。与对照受试者(例如未患有tbi的受试者)相比，在受试者中测量或检测到一种或多种这些tbi生物标志物的升高或降低水平可以足够表明该受试者已遭受tbi，在某些情况下，可以足够表明该受试者已遭受tbi。例如，与对照受试者的水平相比，在可能已患有tbi的受试者中检测或测量较高水平的abhed、和/或较低水平的al9a1和/或dnm1l可以表明该受试者确实已遭受tbi。这些tbi生物标志物的水平可以单独检测或测量，也可以作为tbi组或表征的一部分进行组合检测。
在一些实施方式中，基于来自受试者的样品中检测到一种或多种这些tbi生物标志物的量、浓度和/或表达水平高于或低于对照受试者中相应tbi生物标志物的量、浓度和/或表达水平，可以使用以上列出的一种或多种tbi生物标志物来确定受试者已遭受轻度tbi。这些tbi生物标志物可以包括m3k5，sbsn，syep或其任何组合中的一种或多种。与对照受试者(例如未遭受tbi的受试者)相比，在受试者中测量或检测到一种或多种这些tbi生物标志物的升高或降低水平可以足够表明该受试者已遭受tbi，在某些情况下，可以足够表明受试者已遭受轻度tbi。例如，与对照受试者的水平相比，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量较高水平的sbsn和/或syep、和/或较低水平的m3k5可以表明该受试者确实已遭受轻度tbi。这些tbi生物标志物的水平可以单独检测或测量，也可以作为tbi组或表征的一部分进行组合检测。
在一些实施方式中，以上列出的一种或多种tbi生物标志物可以与可能已经或可能没有被鉴定为tbi生物标志物的其他生物标志物一起包括。例如，以上列出的一种或多种tbi生物标志物可以被包括在生物标志物的组中，该生物标志物的组可以包括anxa6，erap1，ezri，fa5，g6pi，mylk，samp或其组合中的一种或多种。在某些情况下，与单独的单个生物标志物相比，tbi生物标志物、其他tbi生物标志物和非tbi生物标志物的组可以在更大程度上帮助诊断tbi。
b.纳入的轻度tbi生物标志物
如下所述，以下tbi生物标志物被鉴定为在单独或组合检测时能够将健康受试者与已遭受轻度tbi的受试者区分开：
聚(rc)结合蛋白2(α-cp2)(pcbp2)。
聚(rc)结合蛋白2是在人中由pcbp2基因编码的蛋白。该基因编码的蛋白质似乎是多功能的。它与pcbp-1和hnrnpk对应于主要细胞多(rc)结合蛋白。它包含三个可能与rna结合有关的k-同源(kh)域。该编码蛋白与pcbp-1一起，还通过与ires茎环iv的序列特异性相互作用，充当脊髓灰质炎病毒rna的翻译共激活因子，并通过结合其5'-末端苜蓿叶结构促进脊髓灰质炎病毒rna复制。它也与15-脂加氧酶mrna、人乳头瘤病毒16l2型mrna和甲型肝炎病毒rna的翻译控制有关。还暗示编码的蛋白质在与α-珠蛋白mrna稳定性相关的序列特异性α-珠蛋白mrnp复合物的形成中发挥作用。该多外显子结构mrna被认为是经转座产生具有相似功能的pcbp-1无内含子基因。该基因和pcbp-1具有旁系同源物pcbp3和pcbp4，据认为它们是由于整个基因的重复事件而产生的。它还具有两个经处理的伪基因pcbp2p1和pcbp2p2。目前有两个针对该基因的选择性剪接的转录变体。在人类中，pcbp2基因与作为与肝细胞癌有关的转录超保守元件的tuc338重叠。(uniprot主登录号：q15366。)
硫氧还蛋白还原酶2，线粒体(trxr2)。
硫氧还蛋白还原酶(tr，trxr)(ec1.8.1.9)是唯一已知的还原硫氧还蛋白(trx)的酶。已经鉴定出两类硫氧还蛋白还原酶：一类在细菌和一些真核生物中，而另一类在动物中。这两类都是作为同二聚体的黄素蛋白。每个单体包含一个fad辅基、一个nadph结合域和一个包含氧化还原活性二硫键的活性位点。硫氧还蛋白还原酶是已知的催化硫氧还蛋白还原的唯一酶，因此是硫氧还蛋白系统中的核心成分。与硫氧还蛋白(trx)和nadph一起使用时，该系统的最一般描述是作为在细胞中形成还原的二硫键的方法。通过trxr从nadph中获取电子，并转移到trx的活性位点，该位点继续还原蛋白质二硫键或其他底物。trx系统存在于所有活细胞中，并且具有与dna作为遗传物质相关的进化历史，可以防御由于氧代谢引起的氧化损伤，并使用过氧化氢和一氧化氮等分子进行氧化还原信号传递。(uniprot主登录号：q9nnw7。)
14-3-3蛋白γ(1433g或ywhag)。
1433g是衔接子蛋白，其参与大范围的一般和专门信号通路的调控。通常通过识别磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸基元与大量配偶体结合。结合通常导致结合配偶体活性的调节。(uniprot主登录号：p61981。)
活化的cdc42激酶1(ack1或tkn2)。
ack1是非受体酪氨酸蛋白和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与细胞扩散和迁移、细胞存活、细胞生长和增殖有关。将细胞外信号转导至胞质和核效应子。它会磷酸化akt1，ar，mcf2，wasl和wwox。通过与表皮生长因子受体(egfr)和网格蛋白的结合，参与运输和网格蛋白介导的内吞作用。它与多泛素和单泛素结合，并调节配体诱导的egfr降解，从而促进egfr在早期内体的限制膜上积聚。它是cdc42的下游效应子，通过bcar1的磷酸化介导cdc42依赖性细胞迁移。它可能与成人突触功能和可塑性以及大脑发育有关。通过在“tyr-176”上磷酸化akt1来激活它。在“tyr-267”和“tyr-363”上磷酸化ar，从而促进其募集至雄激素响应性增强子(are)。它将“tyr-287”上的wwox磷酸化。它使mcf2磷酸化，从而增强其作为rho家族蛋白的鸟嘌呤核苷酸交换因子(gef)的活性。它有助于控制axl受体水平。它通过负调控wwox等肿瘤抑制因子和正调控akt1和ar等促生存因子来赋予癌细胞转移特性并促进肿瘤生长。它会使wasp磷酸化。(uniprot主登录号：q07912。)
氨基酰基酶-1(acy1)。
acy1参与n-酰化或n-乙酰化氨基酸(l-天冬氨酸除外)的水解。(uniprot主登录号：q03154。)
a激酶锚蛋白12(aka12或akap12)。
aka12是锚定蛋白，其介导蛋白激酶a(pka)和蛋白激酶c(pkc)的亚细胞区室化。(uniprot主登录号：q02952。)
精氨酸酶-1(argi1或arg1)。
argi1是尿素循环中将l-精氨酸转化为尿素和l-鸟氨酸的关键元素，其进一步被代谢成脯氨酸和聚酰胺的代谢产物，分别驱动胶原合成和对细胞增殖至关重要的生物能途径；尿素循环主要发生在肝脏中，而次要发生在肾脏中。它在非肝组织的l-精氨酸稳态中起作用，其特征在于一氧化氮合酶(nos)和精氨酸酶之间竞争细胞内可用的精氨酸。精氨酸代谢是先天和适应性免疫反应的关键调节因子。它参与多形核粒细胞(pmn)的抗菌效应途径。pmn细胞死亡后，它会从吞噬溶酶体中释放出来，并在微环境中消耗精氨酸，从而导致t细胞和自然杀伤(nk)细胞增殖和细胞因子分泌受到抑制。在第2组先天性淋巴样细胞(ilc2)中，它促进肺中的急性2型炎症，并参与最佳ilc2增殖，但不参与存活(相似性)。(uniprot主登录号：p05089。)
钙黏着蛋白5(cadh5或cdh5)。
cadh5是钙粘蛋白；钙粘蛋白是钙依赖性细胞粘附蛋白。它们优先以同质方式在连接细胞时与自身相互作用；钙粘蛋白可能因此有助于异种细胞类型的分类。通过控制细胞间连接的黏附和组织，该钙粘蛋白可能在内皮细胞生物学中起重要作用。它与α-连环蛋白缔合，形成与细胞骨架的链接。它与krit1协同作用，以建立和维持正确的内皮细胞极性和血管腔。这些作用由par极性复合物和rap1b的募集和激活介导。它是激活prkcz和将磷酸化prkcz、pard3、tiam1和rap1b定位到细胞连接处所需的。(uniprot主登录号：p33151。)
网格蛋白重链1(cltc的clh1)。
clh1是包被的凹坑和囊泡的多面体包衣的主要蛋白质。两种不同的衔接蛋白复合物将网格蛋白晶格连接到质膜或反高尔基体网络。它是tacc3/ch-tog/网格蛋白复合物的组成部分，被提议通过充当微管桥来促进有丝分裂纺锤体的线粒体纤维的稳定化。tacc3/ch-tog/网格蛋白复合物是维持动粒纤维张力所需的。它在早期自噬体形成中起作用。(uniprot主登录号：q00610。)
包被体亚基γ-2(copg2)。
copg2是胞质蛋白复合物，其与二赖氨酸基序结合并且与高尔基非网格蛋白包被的囊泡可逆地缔合，其进一步介导从er经由高尔基体到反高尔基体网络的生物合成蛋白运输。包被体复合物是从高尔基体膜出芽所需的，这对于二赖氨酸标记的蛋白质从高尔基体向er逆行转运至关重要。在哺乳动物中，包被体仅可通过与adp-核糖基化因子(arf)相关的膜(其是小的gtp结合蛋白)来募集；该复合物还影响高尔基体的结构完整性，以及ldl受体的加工、活性和内吞再循环(通过相似性)。(uniprot主登录号：q9ubf2。)
dna聚合酶δ亚基2(dpod2或pold2)。
作为三聚体和四聚体dna聚合酶δ复合物(分别为pol-δ3和pol-δ4)的组分，dpod2在高保真基因组复制中起作用，包括在滞后链合成和修复中。pol-δ3和pol-δ4的特征在于不存在或存在pold4。它们在催化活性上表现出差异。最值得注意的是，pol-δ3显示出pol-δ4更高的校对活性。尽管pol-δ3和pol-δ4都在体外加工okazaki片段，但pol-δ3也可能更适合完成此任务，与pol-δ4相比，其几乎没有链置换活性，并且在遇到5'-封闭寡核苷酸时停滞。pol-δ3空转过程可以避免形成间隙，同时保持易于结扎的切口。与dna聚合酶κ一起，dna聚合酶δ会在紫外线照射后进行大约一半的核苷酸切除修复(ner)合成。在dna复制压力下，需要通过断裂诱导复制(bir)来修复断裂的复制叉。参与通过pol-δ4进行携带o6-甲基鸟嘌呤或无碱基位点的模板的跨病变合成(tls)，而与dna聚合酶ζ(rev3l)或η(polh)无关。通过促进从病灶对面插入的核苷酸延伸来促进dna聚合酶δ的无碱基位点旁路。还作为polz复合体的一部分参与tls。与pold3一起，极大提高了仅由rev3l和rev7组成的最小dna聚合酶ζ复合物的dna合成效率和合成能力。(uniprot主登录号：p49005。)
桥粒芯蛋白2(dsg2)。
dsg2是细胞间桥粒连接的组分。它参与噬菌斑蛋白和介导细胞间粘附的中间丝的相互作用。(uniprot主登录号：q14126。)
免疫球蛋白重可变3-7(hv307或ighv3-7)。
hv307是参与抗原识别的免疫球蛋白重链可变结构域的v区。免疫球蛋白也称为抗体，是b淋巴细胞产生的膜结合或分泌的糖蛋白。在体液免疫的识别阶段，与膜结合的免疫球蛋白起受体的作用，在结合特定抗原后，触发b淋巴细胞的克隆扩增和分化为分泌免疫球蛋白的浆细胞。分泌的免疫球蛋白介导体液免疫的效应期，从而消除结合的抗原。抗原结合位点由一条重链的可变结构域及其相关轻链的可变结构域形成。因此，每个免疫球蛋白具有两个对特定抗原具有显著亲和力的抗原结合位点。可变结构域通过称为v-(d)-j重排的过程组装，然后可以进行体细胞超突变，其在暴露于抗原和选择后允许对特定抗原的亲和力成熟。(uniprot主登录号：p01780。)
rasgtp酶激活样蛋白iqgap2(iqga2或iqgap2)。
iqga2与活化的cdc42和rac1结合，但似乎并不刺激其gtp酶活性。它与钙调蛋白有关。(uniprot主登录号：q13576。)
角蛋白，i型细胞骨架14(k1c14或krt14)。
k1c14是中间丝蛋白，并且非螺旋尾结构域参与促进krt5-krt14丝自组织成大束，并在体外增强角蛋白中间丝回弹性涉及的机械性能。(uniprot主登录号：p02533。)
角蛋白，i型细胞骨架19(k1c19或krt19)。
k1c19参与肌纤维的组织。与krt8一起，它有助于将横纹肌肋骨处的收缩装置与肌营养不良蛋白连接起来。(uniprot主登录号：p08727。)
免疫球蛋白κ可变1-5(igkv1-5的kv105)。
kv105是参与抗原识别的免疫球蛋白轻链可变结构域的v区。免疫球蛋白也称为抗体，是b淋巴细胞产生的膜结合或分泌的糖蛋白。在体液免疫的识别阶段，与膜结合的免疫球蛋白起受体的作用，在结合特定抗原后，触发b淋巴细胞的克隆扩增和分化为分泌免疫球蛋白的浆细胞。分泌的免疫球蛋白介导体液免疫的效应期，从而消除结合的抗原。抗原结合位点由一条重链的可变结构域及其相关轻链的可变结构域形成。因此，每个免疫球蛋白具有两个对特定抗原具有显著亲和力的抗原结合位点。可变结构域通过称为v-(d)-j重排的过程组装，然后可以进行体细胞超突变，其在暴露于抗原和选择后允许对特定抗原的亲和力成熟。(uniprot主登录号：p01602。)
层粘连蛋白亚基γ-1(lamc1)。
通过高亲和力与细胞结合，受体lamc1被认为可在胚胎发育过程中通过与其他细胞外基质成分相互作用来介导细胞向组织的附着、迁移和组织。(uniprot主登录号：p11047。)
苹果酸脱氢酶，线粒体(mdhm或mdh2)。
利用柠檬酸循环中的nad/nadh辅因子系统，mdhm催化苹果酸可逆氧化为草酰乙酸。该基因编码的蛋白质位于线粒体中，并可能在苹果酸-天冬氨酸穿梭中起关键作用，该穿梭在细胞质和线粒体之间的代谢协调中操作。已发现该基因的几种编码不同同工型的转录变体。(uniprot主登录号：p40926。)
核糖基二氢烟碱酰胺脱氢酶[醌](nqo2)。
nqo2用作醌还原酶，与解毒途径以及生物合成过程(例如凝血酶原合成中谷氨酸残基的维生素k依赖性γ-羧化)中涉及的氢醌的缀合反应有关。(uniprot主登录号：p16083。)
髓过氧化物酶(perm或mpo)。
perm是多形核白细胞的宿主防御系统的一部分。它负责针对多种生物的杀微生物活性。在受刺激的pmn中，mpo催化次卤酸(在生理情况下主要为次氯酸)和其他有毒中间体的产生，这些中间体极大地增强了pmn的杀微生物活性。(uniprot主登录号：p05164。)
网素-3(plst或pls3)。
plst是在肠微绒毛、毛细胞立体纤毛和成纤维细胞丝状伪足中发现的肌动蛋白捆绑蛋白。它可能在骨骼发育的调节中起作用。(uniprot主登录号：p13797。)
烟酸酯磷酸核糖基转移酶(pncb或naprt)。
pncb催化烟酸(na)向na单核苷酸(namn)的转化。对于na而言，增加细胞nad水平并防止细胞的氧化应激至关重要。它以烟酰胺为催化剂，从烟酸酯和5-磷酸-d-核糖1-磷酸合成β-烟酸酯d-核糖核苷酸。(uniprot主登录号：q6xqn6。)
受体型酪氨酸蛋白磷酸酶c(ptprc)。
ptprc是通过抗原受体激活t细胞所需的蛋白酪氨酸-蛋白磷酸酶。与dpp4结合后，它充当t细胞共激活的正向调节因子。第一个ptpase结构域具有酶促活性，而第二个ptpase结构域似乎影响第一个ptpase结构域的底物特异性。t细胞活化后，它会募集skap1和fyn并使其去磷酸化。它使lyn去磷酸化，从而调节lyn活性(通过相似性)。(uniprot主登录号：p08575。)
隔蛋白-7(sept7)。
sept7是形成细丝的细胞骨架gtp酶。它是肌动蛋白细胞骨架的正常组织所需的。它是通过有丝分裂正常进展所需的。它参与胞质分裂。它是cenpe与动粒的正常结合所需的。它在纤毛发生和集体细胞运动中起作用。它在精子环上与sept12、sept6、sept2甚至可能与sept4形成丝状结构，是减数分裂后分化过程中精子尾部结构完整性和运动性所需的。(uniprot主登录号：q16181。)
精氨酸-trna连接酶，细胞质(strc或rars)。
syrc形成大分子复合物的一部分，该大分子复合物在蛋白质合成期间催化特定氨基酸对同源trna的附着。它调节aimp1的分泌，可能与aimp1产生炎性细胞因子emap2有关。(uniprot主登录号：p54136。)
硫氧还蛋白样蛋白1(txnl1)。
txnl1是具有约-250mv的氧化还原电势的活性硫氧还蛋白。(uniprot主登录号：o43396。)
udp-葡萄糖：糖蛋白葡萄糖基转移酶1(uggg1或uggt1)。
uggg1识别具有较小折叠缺陷的糖蛋白。它会在蛋白质错误折叠的部分附近再葡萄糖化单个n-聚糖，从而为内质网中蛋白质折叠提供质量控制。再葡萄糖化的蛋白质由钙网蛋白识别，以再循环至内质网并重新折叠或降解。(uniprot主登录号：q9nyu2。)
含有wd重复序列的蛋白质1(wdr1)。
wdr1与adf/丝切蛋白家族蛋白一起诱导肌动蛋白丝的分解。它增强丝切蛋白介导的肌动蛋白切断(通过相似性)。它参与胞质分裂。它通过限制层状脂质体膜突出而参与趋化性细胞迁移。它参与心肌肌节组织。它是心肌细胞生长和维持所需的(通过相似性)。它参与巨核细胞的成熟和血小板脱落。它是在卵泡上皮发育过程中建立平面细胞极性(pcp)和在pcp过程中改变细胞形状所需的；该功能似乎暗示了与cfl1和/或dstn/adf的合作。它参与皮层张力的产生/维持(通过相似性)。它参与上皮顶细胞连接的组装和维护，并在结周肌动球蛋白带的组织中发挥作用。(uniprot主登录号：o75083。)
神经母细胞分化相关蛋白ahnak(ahnak的ahnk)。
ahnk被认为是神经元细胞分化所需的。(uniprot主登录号：q09666。)
视网膜脱氢酶1(aldh1a1的al1a1)。
al1a1将视黄醛转化/氧化为视黄酸。它结合游离的视网膜和细胞视黄醇结合蛋白结合的视网膜(通过相似性)。它可能具有更广泛的特异性，并在体内氧化其他醛。(uniprot主登录号：p00352。)
氨肽酶n(ampn或anpep)。
ampn是广泛特异性的氨基肽酶，其在胃和胰蛋白酶水解蛋白质产生的肽的最终消化中起作用。它还参与各种肽的加工，包括肽激素，例如血管紧张素iii和iv、神经肽和趋化因子。它也可能参与与抗原呈递细胞的主要组织相容性复合物ii类分子结合的肽的裂解。它可能在血管生成中起作用，并促进胆固醇结晶。it充当人类冠状病毒229e/hcov-229e的受体。在人类冠状病毒229e(hcov-229e)感染的情况下，可作为hcov-229e尖峰糖蛋白的受体。它也介导人类巨细胞病毒(hcmv)感染。(uniprot主登录号：p15144。)
f-肌动蛋白封端蛋白亚基β(capzb)。
capzb是f-肌动蛋白封端蛋白，其以ca2+非依赖性的方式结合至肌动蛋白丝的快速生长末端(带刺的末端)，从而在这些末端阻断亚基的交换。与其他加帽蛋白(例如凝溶胶蛋白和肌割蛋白)不同，这些蛋白不会切断肌动蛋白丝。它在调节细胞形态和细胞骨架组织中发挥作用。(uniprot主登录号：p47756。)
组织蛋白酶d(ctsd的catd)。
catd是在细胞内蛋白质分解中有活性的酸性蛋白酶。它在adam30裂解和激活后导致app降解的app处理过程中发挥作用。它参与多种疾病的发病机理，例如乳腺癌，可能还包括阿尔茨海默氏病。(uniprot主登录号：p07339。)
含有cap-gly结构域的接头蛋白2(clip2)。
clip2将微管连接至树突状片状体(dlb)，dlb是主要存在于通过树突状间隙接合连接的神经元的球状树突状附件中的膜状细胞器。它可以控制特定于大脑的细胞器移位(通过相似性)。(uniprot主登录号：q9udt6。)
嗜铬粒蛋白-a(cmga或chga)。
胰腺抑制素：强烈抑制葡萄糖诱导的胰岛素从胰腺释放。catestatin：通过充当非竞争性烟碱胆碱能拮抗剂，抑制儿茶酚胺从嗜铬细胞和去甲肾上腺素能神经元释放。显示对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和黄褐藻以及革兰氏阴性菌大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抗菌活性。可以诱导肥大细胞迁移、脱粒以及细胞因子和趋化因子的产生。充当体外有效的自由基清除剂。可能在心脏功能和血压的调节中起作用。serpinin：通过经由camp-pka-sp1途径上调蛋白酶连接素1(serpine2)的转录来调节内分泌细胞中的颗粒生物发生。这导致高尔基复合物中颗粒蛋白降解的抑制，继而促进颗粒的形成。(uniprot主登录号：p10645。)
成束蛋白(fscn1)。
fscn1将丝状肌动蛋白组织成束，肌动蛋白/成束蛋白比率最小为4.1：1。它在肌动蛋白丝束的组织以及微钉、膜褶皱和应力纤维的形成中起作用。这对于形成各种不同的细胞突起(如丝状伪足)及细胞运动和迁移非常重要。(uniprot主登录号：q16658。)
gmp还原酶2(gmpr2)。
gmpr2催化gmp向imp的不可逆的nadph依赖性脱氨。它的作用是将g的核苷碱基、核苷和核苷酸衍生物转化为a核苷酸，并维持a和g核苷酸的细胞内平衡。它在调节细胞分化中起作用。(uniprot主登录号：q9p2t1。)
78kda葡萄糖调节蛋白(grp78或hspa5)。
grp78在促进内质网内部多聚蛋白复合物的组装中起作用。它通过其与dnajc10的相互作用参与蛋白质的正确折叠和错折叠的蛋白质的降解，可能有助于dnajc10从其底物中释放(通过相似性)。它被认为是分泌蛋白。(uniprot主登录号：p11021。)
谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(gsh1或gclc)。
gsh1也称为γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，是谷胱甘肽合成的第一种限速酶。该酶由两个亚基组成：重催化亚基和轻调节亚基。该基因座编码催化亚基，而调节亚基来自位于染色体1p22-p21上的不同基因。由于γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的缺乏和对心肌梗塞的敏感性，该基因座的突变与溶血性贫血有关。(uniprot主登录号：p48506。)
异柠檬酸脱氢酶[nadp]细胞质(idhc或idh1)。
idhc是在人类中由2号染色体上的idh1基因编码的酶。异柠檬酸脱氢酶催化异柠檬酸氧化脱羧为2-氧代戊二酸。这些酶属于两个不同的亚类，其中一个使用nad+作为电子受体，另一个使用nadp+。已经报道了五种异柠檬酸脱氢酶：三种nad+依赖性异柠檬酸脱氢酶，其定位于线粒体基质，以及两种nadp+依赖性异柠檬酸脱氢酶，其中一种是线粒体的，而另一种主要是细胞质的。每个nadp+依赖性同工酶是同型二聚体。该基因编码的蛋白质是在细胞质和过氧化物酶体中发现的nadp+依赖性异柠檬酸脱氢酶。它包含pts-1过氧化物酶体靶向信号序列。该酶在过氧化物酶体中的存在表明在nadph的再生中用于过氧化物酶体内部还原，例如2,4-二壬酰基-coa向3-烯酰基-coa的转化，以及消耗2-氧戊二酸的过氧化物酶体反应，即植酸的α-羟基化。细胞质酶在细胞质nadph产生中起重要作用。已经发现该基因编码相同蛋白质的剪接的转录变体。(uniprot主登录号：o75874。)
角蛋白，i型细胞骨架20(k1c20或krt20)。
k1c20在维持肠上皮中的角蛋白丝组织中起重要作用。当被磷酸化时，它在小肠粘蛋白的分泌中起作用(通过相似性)。(uniprot主登录号：p35900。)
krr1小亚基加工组组分同源物(krr1)。
krr1是40s核糖体生物发生所需的。它参与18s前核糖体rna的核仁加工和核糖体装配(通过相似性)。(uniprot主登录号：q13601。)
甘露糖结合蛋白c(mbl2)。
mbl2是参与先天免疫防御的钙依赖性凝集素。它在不同的微生物上结合甘露糖、岩藻糖和n-乙酰氨基葡萄糖，并激活凝集素补体途径。它与晚期凋亡细胞、凋亡小泡和坏死细胞结合，但不与早期凋亡细胞结合，从而促进其被巨噬细胞摄取。它可能结合dna。(uniprot主登录号：p11226。)
核转运因子2(ntf2或nutf2)。
ntf2介导gdp结合的ran从细胞质进入细胞核，这对于ran在货物受体介导的核质运输中的功能至关重要。因此，它间接地在货物受体介导的核质运输中发挥更普遍的作用。它与细胞质中结合gdp的ran相互作用，通过与核孔蛋白的相互作用将其募集到核孔复合体中，并促进其核输入。(uniprot主登录号：p61970。)
磷酸甘油酸激酶1(pgk1)。
除作为糖酵解酶起作用外，pgk-1还充当聚合酶α辅因子蛋白(引物识别蛋白)。它可能在精子运动中起作用。(uniprot主登录号：p00558。)
血清淀粉样蛋白a-1蛋白(saa1)。
saa1是在人类中由saa1基因编码的蛋白质。saa1是主要的急性期蛋白，主要由肝细胞响应感染、组织损伤和恶性肿瘤而产生。当saa1进入血液循环时，它是与高密度脂蛋白(hdl)相关的载脂蛋白。saa1是淀粉样蛋白a(aa)的主要前体，其沉积会导致炎症性淀粉样变性。(uniprot主登录号：p0dji8。)
转铁蛋白受体蛋白1(tfr1或tfrc)。
铁的细胞摄取是通过受体介导的配体占据的转铁蛋白受体进入特定内体的内吞作用而发生的。内体酸化导致铁释放。然后将载铁蛋白-受体复合物再循环至细胞表面，恢复至中性ph，并随之丧失载铁蛋白对其受体的亲和力。转铁蛋白受体对于红细胞和神经系统的发育是必需的(通过相似性)。第二种配体(遗传性血色素沉着病蛋白hfe)与运铁蛋白竞争结合的c端结合位点。通过铁摄取正调控t和b细胞增殖。(uniprot主登录号：p02786。)
在一些实施方式中，基于来自受试者的样品中检测到一种或多种这些tbi生物标志物，并且在对照受试者(例如未遭受tbi的受试者)中没有检测到一种或多种tbi生物标志物，或在某些情况下，在已遭受重度tbi的受试者中没有检测到，以上列出的一种或多种tbi生物标志物可以用于确定受试者已遭受tbi。这些tbi生物标志物可以包括1433g，ack1，acy1，aka12，argi1，cadh5，clh1，copg2，dpod2，dsg2，hv307，iqga2，k1c14，k1c19，kv105，lamc1，mdhm，nqo2，perm，plst，pncb，ptprc，sept7，syrc，trxr2，txnl1，uggg1，wdr1，ahnk，al1a1，ampn，capzb，catd，clip2，cmga，fscn1，gmpr2，grp78，gsh1，idhc，k1c20，krr1，mbl2，ntf2，saa1，tfr1或其任何组合中的一种或多种。在受试者中测量或检测到一种或多种这些tbi生物标志物可以足够表明该受试者已遭受轻度tbi，而不需要检测、测量、比较和/或定量对照受试者或遭受重度tbi的受试者中一种或多种tbi生物标志物的量、浓度和表达水平。尽管这些tbi生物标志物中的一种或多种可能存在于对照受试者中，或者存在于尚未遭受tbi的受试者中，但是它通常以无法通过常规手段检测的量存在，如本文所述。因此，在某些情况下，在受试者中检测到一种或多种这些tbi生物标志物表明该受试者已遭受轻度tbi。
在一些实施方式中，以上列出的一种或多种tbi生物标志物可用于确定受试者已遭受特定亚类的轻度tbi。不受特定理论、潜在病因或疾病机制的束缚，可以将这些tbi生物标志物中的一种或多种用于将已遭受轻度tbi的受试者分为四个亚类之一(例如亚类1、亚类2、亚类3或亚类4)。例如，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量ack1，acy1，plst，pncb，ptprc，uggg1或其任何组合中的一种或多种可以表明该受试者确实已遭受亚类1的轻度tbi。在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量aka12，hv307，perm，kv105，nqo2，sept7，syrc，trxr2或其任何组合中的一种或多种可以表明该受试者确实已遭受亚类2的轻度tbi。并且在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量1433b，argi1，cadh5，clh1，copg2，dpod2，dsg2，iqga2，k1c14，lamc1，mdhm，txnl1或其任何组合中的一种或多种可以表明该受试者确实已遭受亚类3的轻度tbi。这些tbi生物标志物的水平可以单独检测或测量，也可以作为轻度tbi组或表征的一部分进行组合检测。
在一些实施方式中，以上列出的一种或多种tbi生物标志物可以与可能已经或可能没有被鉴定为tbi生物标志物的其他生物标志物一起包括。例如，以上列出的一种或多种tbi生物标志物可以包括在生物标志物的组中，该生物标志物的组可以包括ahnk，al1a1，ampn，capzb，catd，clip2，cmga，fscn1，gmpr2，grp78，gsh1，idhc，k1c20，krr1，mbl2，ntf2，pcbp2，pgk1，saa1，tfr1或其组合中的一种或多种。在某些情况下，与单独的单个生物标志物相比，tbi生物标志物、其他tbi生物标志物和非tbi生物标志物的组可以在更大程度上帮助诊断tbi。
c.轻度tbi表征
如下所述，以下轻度tbi生物标志物被鉴定为在单独或组合检测时能够区分健康受试者与已遭受轻度tbi和/或特定亚类的轻度tbi的受试者：
肝配蛋白b型受体4(ephb4)。
肝配蛋白b型受体4是在人类中由ephb4基因编码的蛋白质。肝配蛋白受体及其配体肝配蛋白介导许多发育过程，特别是在神经系统中。根据它们的结构和序列关系，肝配蛋白分为通过糖基磷脂酰肌醇连接固定在膜上的肝配蛋白-a(efna)类和跨膜蛋白的肝配蛋白-b(efnb)类。eph受体家族根据其胞外域序列的相似性及其结合肝配蛋白-a和肝配蛋白-b配体的亲和力分为两组。肝配蛋白受体构成受体酪氨酸激酶(rtk)家族的最大亚组。该基因编码的蛋白与肝配蛋白-b2结合并对血管发育起重要作用。(uniprot主登录号：p54760。)
免疫球蛋白重可变1-3(hv103或ighv1-3)。
hv103是参与抗原识别的免疫球蛋白重链可变结构域的v区。免疫球蛋白也称为抗体，是b淋巴细胞产生的膜结合或分泌的糖蛋白。在体液免疫的识别阶段，与膜结合的免疫球蛋白起受体的作用，在结合特定抗原后，触发b淋巴细胞的克隆扩增和分化为分泌免疫球蛋白的浆细胞。分泌的免疫球蛋白介导体液免疫的效应期，从而消除结合的抗原。抗原结合位点由一条重链的可变结构域及其相关轻链的可变结构域形成。因此，每个免疫球蛋白具有两个对特定抗原具有显著亲和力的抗原结合位点。可变结构域通过称为v-(d)-j重排的过程组装，然后可以进行体细胞超突变，其在暴露于抗原和选择后允许对特定抗原的亲和力成熟。(uniprot主登录号：a0a0c4dh29。)
免疫球蛋白重恒定δ(ighd)。
ighd是免疫球蛋白重链的恒定区。免疫球蛋白也称为抗体，是b淋巴细胞产生的膜结合或分泌的糖蛋白。在体液免疫的识别阶段，与膜结合的免疫球蛋白起受体的作用，在结合特定抗原后，触发b淋巴细胞的克隆扩增和分化为分泌免疫球蛋白的浆细胞。分泌的免疫球蛋白介导体液免疫的效应期，从而消除结合的抗原。抗原结合位点由一条重链的可变结构域及其相关轻链的可变结构域形成。因此，每个免疫球蛋白具有两个对特定抗原具有显著亲和力的抗原结合位点。可变结构域通过称为v-(d)-j重排的过程组装，然后可以进行体细胞超突变，其在暴露于抗原和选择后允许对特定抗原的亲和力成熟。igd是大多数外围b细胞表面上与igm共表达的主要抗原受体同种型。膜结合的igd(migd)通过蛋白酪氨酸激酶的src家族诱导cd79a和cd79b的磷酸化。血清中可溶性igd(sigd)浓度低于igg、iga和igm，但远高于ige。b细胞上存在的igm和igd分子具有相同的v区和抗原结合位点。抗原结合b细胞受体后，分泌形式sigd被关闭。igd是tnf、il1b和il1rn的有效诱导剂。igd还诱导从外周血单核细胞释放il6、il10和lif。在存在igd的情况下，单核细胞似乎是体外细胞因子的主要生产者。(uniprot主登录号：p01880。)
酯水解酶c11orf54(ck054或c11orf54)。
ck054是在人类中由c11orf54基因编码的蛋白质。人类基因c11orf54也称为ptd012和ptod12。c11orf54在对硝基苯基乙酸酯上表现出水解酶活性，并在酯键上起作用，尽管整体功能尚未为科学界所完全理解。该蛋白质高度保守，与细菌中发现的最远同源物相同(uniprot主要保藏号：q9h0w9。)
附睾特异性α-甘露糖苷酶(ma2b2或man2b2)。
ma2b2催化α-d-甘露糖苷中末端的、非还原性α-d-甘露糖残基的水解。(uniprot主登录号：q9y2e5。)
蛋白质透明同系物1(diap1或diaph1)。
diap1以rho依赖性方式起作用以将pfy1募集至膜。这是组装f-肌动蛋白结构(例如肌动蛋白电缆和应力纤维)所需的。核化肌动蛋白丝。它结合到肌动蛋白丝的带刺的末端，并减慢肌动蛋白的聚合和解聚。它是胞质分裂和血清反应因子转录激活所需的。dfr蛋白在信号传导和肌动蛋白动力学调节过程中偶联rho和src酪氨酸激酶。它充当mapre1和apc的支架蛋白来稳定微管并促进细胞迁移(相似性)。它具有促进神经突增生的活性(通过相似性)。在听力细胞中，它可能在调节毛细胞中的肌动蛋白聚合中发挥作用。memo1-rhoa-diaph1信号通路在依赖erbb2的细胞皮层微管稳定中起重要作用。它通过调节gsk3b活性来控制apc和clasp2在细胞膜上的定位。反过来，膜结合的apc允许macf1定位到细胞膜，这是微管捕获和稳定所需的。它在调节细胞形态和细胞骨架组织中发挥作用。它是控制晶胞形状所需的。它在大脑发育中起作用。(uniprot主登录号：o60610。)
前胶原赖氨酸，2-氧戊二酸酯5-双加氧酶1(plod1)。
plod1是由plod1、p3h3和p3h4组成的复合物的一部分，该复合物催化胶原α链中赖氨酸残基的羟基化，并且是胶原原纤维的正常组装和交联所需的(通过相似性)。它在胶原蛋白的-xaa-lys-gly-序列中形成羟基赖氨酸残基。这些羟基赖氨酸充当碳水化合物单元的连接位点，对于分子间胶原交联的稳定性至关重要(可能)。(uniprot主登录号：q02809。)
免疫球蛋白κ变量1-33(kv133或igkv1-33)。
kv133是参与抗原识别的免疫球蛋白轻链可变结构域的v区。免疫球蛋白也称为抗体，是b淋巴细胞产生的膜结合或分泌的糖蛋白。在体液免疫的识别阶段，与膜结合的免疫球蛋白起受体的作用，在结合特定抗原后，触发b淋巴细胞的克隆扩增和分化为分泌免疫球蛋白的浆细胞。分泌的免疫球蛋白介导体液免疫的效应期，从而消除结合的抗原。抗原结合位点由一条重链的可变结构域及其相关轻链的可变结构域形成。因此，每个免疫球蛋白具有两个对特定抗原具有显著亲和力的抗原结合位点。可变结构域通过称为v-(d)-j重排的过程组装，然后可以进行体细胞超突变，其在暴露于抗原和选择后允许对特定抗原的亲和力成熟。(uniprot主登录号：p01594。)
如本文所公开的，以下生物标志物也被鉴定为在单独或彼此以及与本节中的其他生物标志物组合检测时能够区分健康受试者与已遭受轻度tbi和/或特定亚类的轻度tbi的受试者：tpp2，cand1，ncor1，k22e，al9a1，abheb，dnm1l，inf2，m3k5，sbsn，syep，mylk和samp。这些生物标志物的描述已在上文提供，此处不再赘述。
在一些实施方式中，以上列出的一种或多种tbi生物标志物可用于确定受试者已遭受特定亚类的轻度tbi。不受特定理论、潜在病因或疾病机制的束缚，可以将这些tbi生物标志物中的一种或多种用于将已遭受轻度tbi的受试者分为四个亚类之一(例如亚类1、亚类2、亚类3或亚类4)。在一些实施方式中，基于来自受试者的样品中检测到一种或多种这些tbi生物标志物的量、浓度和/或表达水平高于或低于对照受试者中相应tbi生物标志物的量、浓度和/或表达水平，可以使用以上列出的一种或多种tbi生物标志物来确定该受试者已遭受轻度tbi。与对照受试者(例如未遭受tbi的受试者)相比，在受试者中测量或检测到一种或多种这些tbi生物标志物的升高或降低水平可以足够表明该受试者已遭受轻度tbi，在某些情况下，可以足够表明该受试者已遭受特定亚类的轻度tbi。
例如，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量tpp2，cand1，ncor1，k22e，al9a1，abheb，dnm1l，inf2或其任何组合中的一种或多种可以表明该受试者确实已遭受亚类4的轻度tbi。在某些情况下，与对照受试者的水平相比，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量到较高水平的cand1，ncor1，k22e，abheb，dnm1l或其任何组合、和/或较低水平的tpp2，al9a1，inf2或其任何组合可以表明该受试者确实已遭受亚类4的轻度tbi。
在一些实施方式中，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量tpp2，ncor1，hv103，inf2，ighd，ck054，m3k5，abheb，al9a1，dnm1l或其任何组合中的一种或多种可以表明该受试者确实已遭受亚类3的轻度tbi。在某些情况下，与对照受试者的水平相比，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量到较高水平的ncor1，hv103，ighd，abheb，dnm1l或其任何组合、和/或较低水平的tpp2，ighd，ck054，m3k5，al9a1或其任何组合可以表明该受试者确实已遭受亚类3的轻度tbi。
在一些实施方式中，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量ncor1，tpp2，k22e，abheb，inf2，sbsn，al9a1，ma2b2或其任何组合中的一种或多种可以表明该受试者确实已遭受亚类2的轻度tbi。在某些情况下，与对照受试者的水平相比，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量到较高水平的ncor1，k22e，abheb，sbsn或其任何组合、和/或较低水平的tpp2，inf2，al9a1，ma2b2或其任何组合可以表明该受试者确实已遭受亚类2的轻度tbi。
在其他实施方式中，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量k22e，dnm1l，diap1，abheb，plod1，syep，kv133，al9a1，ephb4或其任何组合中的一种或多种可以表明该受试者确实已遭受亚类1的轻度tbi。在某些情况下，与对照受试者的水平相比，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量到较高水平的k22e，dnm1l，diap1，abheb，plod1，syep，ephb4或其任何组合、和/或较低水平的kv133和al9a1或其任何组合可以表明该受试者确实已遭受亚类1的轻度tbi。
这些tbi生物标志物的水平可以被单独、或作为轻度tbi检测或表征的一部分而组合检测或测量。
在一些实施方式中，以上列出的一种或多种tbi生物标志物可以与可能已经或可能没有被鉴定为tbi生物标志物的其他生物标志物一起包括。例如，以上列出的一种或多种tbi生物标志物可以包括在生物标志物的组中，该生物标志物的组可以包括mylk，samp或其组合中的一种或多种。在某些情况下，与单独的单个生物标志物相比，tbi生物标志物、其他tbi生物标志物和非tbi生物标志物的组可以在更大程度上帮助诊断tbi。
如下所述，以下轻度tbi生物标志物被鉴定为在单独或组合检测时能够区分健康受试者与已遭受轻度tbi和/或特定亚类的轻度tbi的受试者：
动力蛋白轻链1，细胞质(dyl1或dynll1)。
dyl1充当细胞质动力蛋白1复合物的几种非催化辅助成分之一，被认为与动力蛋白与货物以及调节动力蛋白功能的衔接蛋白的连接有关。细胞质动力蛋白1沿着微管沿囊泡和细胞器的细胞内逆行运动。它可能在改变或维持细胞骨架结构的空间分布中起作用。它结合并抑制神经元一氧化氮合酶的催化活性。它促进esr1的反式激活功能，并在esr1的核定位中发挥作用。它通过螯合微管来调节bcl2l11的凋亡活性。在细胞凋亡刺激后，bcl2l11-dynll1复合物从细胞质动力蛋白上解离，并转移到线粒体并螯合bcl2，从而中和其抗凋亡活性。(uniprot主登录号：p63167。)
嘌呤霉素敏感的氨基肽酶(psa或npepps)。
psa是氨基肽酶，对几种肽具有广泛的底物特异性。它参与对细胞生长和活力至关重要的蛋白水解事件。它可以充当神经肽活性的调节剂。它在mhci类分子的抗原加工途径中起作用。它参与细胞毒性t细胞表位前体的n末端修饰。它消化许多细胞蛋白中发现的poly-q肽。与正常人大脑中的tau相比，它比阿尔茨海默氏病大脑中的tau更有效地消化。(uniprot主登录号：p55786。)
含egf的纤维蛋白样细胞外基质蛋白1(fbln3或efemp1)。
fbln3结合egfr(egf受体)，诱导egfr自磷酸化和下游信号传导途径的激活。它可能在细胞粘附和迁移中起作用。它可以作为软骨细胞分化的负调节剂。在嗅觉上皮中，它可能调节神经胶质细胞的迁移、分化以及神经胶质细胞支持神经突突生长的能力。(uniprot主登录号：q12805。)
血清白蛋白(albu或alb)。
albu是血浆的主要蛋白质，对水、ca2+、na+、k+、脂肪酸、激素、胆红素和药物具有良好的结合能力。它的主要功能是调节血液的胶体渗透压。它是血浆中主要的锌转运蛋白，通常结合所有血浆锌的约80％。(uniprot主登录号：p02768。)
3-酮酰基-coa硫解酶，线粒体(thim或acaa2)。
thim参与消除bnip3介导的细胞凋亡和线粒体损伤。(uniprot主登录号：p42765。)
免疫球蛋白κ变量1-39(kv139或igkv1-39)。
kv139是参与抗原识别的免疫球蛋白轻链可变结构域的v区。免疫球蛋白也称为抗体，是b淋巴细胞产生的膜结合或分泌的糖蛋白。在体液免疫的识别阶段，与膜结合的免疫球蛋白起受体的作用，在结合特定抗原后，触发b淋巴细胞的克隆扩增和分化为分泌免疫球蛋白的浆细胞。分泌的免疫球蛋白介导体液免疫的效应期，从而消除结合的抗原。抗原结合位点由一条重链的可变结构域及其相关轻链的可变结构域形成。因此，每个免疫球蛋白具有两个对特定抗原具有显著亲和力的抗原结合位点。可变结构域通过称为v-(d)-j重排的过程组装，然后可以进行体细胞超突变，其在暴露于抗原和选择后允许对特定抗原的亲和力成熟。(uniprot主登录号：p01597。)
甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2(masp2)。
masp2是血清蛋白酶，其在通过甘露糖结合的凝集素激活补体系统中起重要作用。通过自动催化裂解激活后，它裂解c2和c4，导致其激活并形成c3转化酶。(uniprot主登录号：o00187。)
如本文所公开的，以下轻度tbi生物标志物被鉴定为在单独或彼此以及与本节中的其他生物标志物组合检测时能够区分健康受试者与已遭受轻度tbi和/或特定亚类的轻度tbi的受试者：anxa6，cand1，ncor1，k22e，abheb，diap1，dnm1l，ephb4，glo2，hv103，igha2，ighd，plod1，sbsn，syep，mylk和samp。这些生物标志物的描述已在上文提供，此处不再赘述。
在一些实施方式中，以上列出的一种或多种tbi生物标志物可用于确定受试者已遭受特定亚类的轻度tbi。不受特定理论、潜在病因或疾病机制的束缚，可以将这些tbi生物标志物中的一种或多种用于将已遭受轻度tbi的受试者分为四个亚类之一(例如亚类1、亚类2、亚类3或亚类4)。在一些实施方式中，基于来自受试者的样品中检测到一种或多种这些tbi生物标志物的量、浓度和/或表达水平高于或低于对照受试者中相应tbi生物标志物的量、浓度和/或表达水平，可以使用以上列出的一种或多种tbi生物标志物来确定该受试者已遭受轻度tbi。与对照受试者(例如未遭受tbi的受试者)相比，在受试者中测量或检测到一种或多种这些tbi生物标志物的升高或降低水平可以足够表明该受试者已遭受轻度tbi，在某些情况下，可以足够表明该受试者已遭受特定亚类的轻度tbi。
例如，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量cand1，ncor1，k22e，abheb，dnm1l，sbsn，glo2，syep或其任何组合中的一种或多种可以表明该受试者确实已遭受亚型4的轻度tbi。在某些情况下，与对照受试者的水平相比，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量到较高水平的cand1，ncor1，k22e，abheb，dnm1l，sbsn，glo2，syep或其任何组合可以表明该受试者确实已遭受亚类4的轻度tbi。
在一些实施方式中，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量ncor1，hv103，ighd，abheb，dnm1l，albu，thim，igha2，kv139或其任何组合中的一种或多种可以表明受试者确实已遭受亚类3的轻度tbi。在某些情况下，与对照受试者的水平相比，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量到较高水平的ncor1，hv103，ighd，abheb，dnm1l，albu，thim，igha2，kv139或其任何组合表明该受试者确实已遭受亚类3的轻度tbi。
在一些实施方式中，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量ncor1，k22e，abheb，sbsn，dnm1l，diap1，dyl1，psa，ephb4或其任何组合中的一种或多种可以表明受试者确实已遭受亚类2的轻度tbi。在某些情况下，与对照受试者的水平相比，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量到较高水平的ncor1，k22e，abheb，sbsn，dnm1l，diap1，dyl1，psa，ephb4或其任何组合表明该受试者确实已遭受亚类2的轻度tbi。
在其他实施方式中，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量k22e，dnm1l，diap1，abheb，plod1，syep，ephb4，fbln3或其任何组合中的一种或多种可以表明该受试者确实已遭受亚类1的轻度tbi。在某些情况下，与对照受试者的水平相比，在可能已遭受tbi的受试者中检测或测量到较高水平的k22e，dnm1l，diap1，abheb，plod1，syep，ephb4，fbln3或其任何组合可以表明该受试者确实已遭受亚类1的轻度tbi。
这些tbi生物标志物的水平可以被单独、或作为轻度tbi检测或表征的一部分而组合检测或测量。
在一些实施方式中，以上列出的一种或多种tbi生物标志物可以与可能已经或可能没有被鉴定为tbi生物标志物的其他生物标志物一起包括。例如，以上列出的一种或多种tbi生物标志物可以包括在生物标志物的组中，该生物标志物的组可以包括anxa6，masp2，mylk，samp或其组合中的一种或多种。在某些情况下，与单独的单个生物标志物相比，tbi生物标志物、其他tbi生物标志物和非tbi生物标志物的组可以在更大程度上帮助诊断tbi。
d.排除的tbi生物标志物
如下所述，以下tbi生物标志物被鉴定为在单独或组合检测时能够将健康受试者与患有tbi的受试者区分开：
sh3结构域结合的富谷氨酸样蛋白(sh3bgrl)。
sh3结构域结合的富谷氨酸样蛋白3是在人类中由sh3bgrl3基因编码的蛋白。10.5kda蛋白质sh3结合的富谷氨酸样蛋白质3的等电点为5.0。sh3结合的富谷氨酸(sh3bgr)基因位于人类21号染色体上。两个同源基因sh3bgrl和sh3bgrl3分别位于xq13.3和1p34.3-35染色体上，并编码类似于sh3bgr蛋白的n末端区域的小蛋白。sh3bgrl3蛋白与大肠杆菌的谷氧还蛋白1显示出显著相似性，并且所有这三种蛋白均被预测为属于硫氧还蛋白样蛋白家族。戊二醛(grx)是普遍存在的氧化还原酶，其催化许多细胞内蛋白质二硫化物的还原，并在许多氧化还原途径中起重要作用。然而，sh3bgrl3蛋白缺乏戊二醛酶的酶促功能，并可能具有氧化还原活性的调节作用。(uniprot主登录号：o75368。)
β-肌动蛋白样蛋白2(actbl或actbl2)。
actbl是肌动蛋白家族的成员。肌动蛋白是高度保守的蛋白，参与各种类型的细胞运动，并在所有真核细胞中普遍表达。(uniprot主登录号：q562r1。)
醛脱氢酶，线粒体(aldh2)。
aldh2催化醛的氧化。尽管有“脱氢酶”的名称，但它们的氧化方式是通过添加氧而不是通过去除氢来实现的，也就是说，它们将醛(r-c(＝o)-h)转化为羧酸(r(c＝o)-o-h)。迄今为止，已经在人类基因组中鉴定出十九种aldh基因。这些基因参与各种各样的生物学过程，包括外源性和内源性醛的解毒。(uniprot主登录号：p05091。)
膜联蛋白a5(anxa5)。
anxa5是抗凝血蛋白，其充当参与凝血级联反应的凝血活素特异性复合物的间接抑制剂。(uniprot主登录号：p08758。)
cathelicidin抗菌肽(camp)。
camp与细菌脂多糖(lps)结合，并表现出抗菌活性。(uniprot主登录号：p49913。)
copine-3(cpne3)。
cpne3是钙依赖性磷脂结合蛋白，其响应于生长因子调蛋白刺激，在erbb2介导的肿瘤细胞迁移中起作用。(uniprot主登录号：o75131。)
软骨酸性蛋白1(crac1或crtac1)。
crac1编码糖基化的细胞外基质蛋白，其在关节深区软骨的间质基质中发现。该蛋白用作区分培养中成骨细胞的软骨细胞和间充质干细胞的标志物。fg-gap基序和rgd整合素结合基序的存在表明该蛋白可能与细胞-细胞或细胞-基质相互作用有关。在与神经纤维瘤病1型相关的glomus肿瘤中已观察到该基因拷贝数改变。选择性剪接导致多个转录变体。(uniprot主登录号：q9nq79。)
胱抑素-c(cytc或cst3)。
作为半胱氨酸蛋白酶的抑制剂，cytc被认为作为该酶活性的局部调节剂起重要的生理作用。(uniprot主登录号：p01034。)
天冬氨酰氨肽酶(dnpep)。
dnpep是对n-末端的酸性氨基酸具有特异性的氨基肽酶。它可能在细胞内蛋白质和肽代谢中起重要作用。(uniprot主登录号：q9ula0。)
真核翻译起始因子3亚基i(eif3i)。
eif3i是真核翻译起始因子3(eif-3)复合物的组分，其是蛋白质合成起始中几个步骤所需的。eif-3复合物与40s核糖体缔合并促进eif-1、eif-1a、eif-2：gtp：甲硫酰基-trnai和eif-5的募集，以形成43s预起始复合物(43spic)。eif-3复合物刺激mrna募集至43spic并扫描mrna以进行aug识别。终止后核糖体复合物的拆卸和回收也需要eif-3复合物，并在启动前防止40s和60s核糖体亚基的过早结合。eif-3复合物特异性靶向并启动参与细胞增殖(包括细胞周期、分化和凋亡)的mrna子集的翻译，并使用不同模式的rna茎环结合来发挥翻译激活或抑制作用。(uniprot主登录号：q13347。)
谷胱甘肽合成酶(gshb或gss)。
gshb是谷胱甘肽(gsh)生物合成途径中的第二种酶。它催化γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸的缩合，以形成谷胱甘肽。谷胱甘肽合成酶也是有效的抗氧化剂。它存在于许多物种中，包括细菌、酵母、哺乳动物和植物。在人类中，gss的缺陷以常染色体隐性方式遗传，并且是严重代谢性酸中毒、5-氧代脯氨酸尿症、溶血速率增加和中枢神经系统功能缺陷的原因。gss缺乏会在植物和人类中引起一系列有害症状。在真核生物中，这是一种同二聚酶。底物结合结构域具有3层α/β/α结构。该酶利用并稳定酰基磷酸酯中间体，以随后对甘氨酸进行有利的亲核攻击。(uniprot主登录号：p48637。)
细胞间粘附分子1(icam1)。
icam1蛋白是白细胞粘附蛋白lfa-1(整联蛋白α-l/β-2)的配体。在白细胞跨内皮迁移过程中，icam1整合通过arhgef26/sgef和rhog激活促进了内皮尖杯的组装。它充当主要受体群鼻病毒a-b衣壳蛋白的受体。充当柯萨奇病毒a21衣壳蛋白的受体。在卡波济氏肉瘤相关的疱疹病毒/hhv-8感染后，它会被病毒e3泛素连接酶mir2降解，以防止细胞毒性t淋巴细胞和nk细胞裂解感染的细胞。(uniprot主登录号：p05362。)
(hv323或ighv3-23)。
hv323是参与抗原识别的免疫球蛋白重链可变结构域的v区。免疫球蛋白也称为抗体，是b淋巴细胞产生的膜结合或分泌的糖蛋白。在体液免疫的识别阶段，与膜结合的免疫球蛋白起受体的作用，在结合特定抗原后，触发b淋巴细胞的克隆扩增和分化为分泌免疫球蛋白的浆细胞。分泌的免疫球蛋白介导体液免疫的效应期，从而消除结合的抗原。抗原结合位点由一条重链的可变结构域及其相关轻链的可变结构域形成。因此，每个免疫球蛋白具有两个对特定抗原具有显著亲和力的抗原结合位点。可变结构域通过称为v-(d)-j重排的过程组装，然后可以进行体细胞超突变，其在暴露于抗原和选择后允许对特定抗原的亲和力成熟。(uniprot主登录号：p01764。)
异种核糖核蛋白d0(hnrpd或hnrnpd)。
hnrpd以高亲和力与包含在许多原癌基因和细胞因子mrna的3'-utr内发现的含有富au元件(are)的rna分子结合。它还以特定方式结合双链和单链dna序列，并具有转录因子的功能。每个rna结合结构域都可以特异性地与单链非单调5'-uuag-3'序列结合，并且也比单链5'-ttaggg-3'端粒dna重复序列弱。与端粒单链dna5'-ttaggg-3'重复序列相比，它更紧密地结合5'-uuaggg-3'重复序列的rna寡核苷酸。rrm1与dna的结合会抑制dna四链体结构的形成，这可能在端粒延长中起作用。它可能参与翻译偶联的mrna更新。它与其他rna结合蛋白在由不稳定的主要编码区决定子(mcrd)结构域介导的fosmrna的胞质腺苷酸化/翻译和衰变相互作用中有关。它可能在昼夜节律核心基因的节律性表达的调节中起作用。它直接与cry1mrna的3'utr结合并诱导cry1有节奏的翻译。它还可能参与per2翻译的调节。(uniprot主登录号：q14103。)
免疫球蛋白κ可变1d-33(kvd33或igkv1d-33)。
kvd33是参与抗原识别的免疫球蛋白轻链可变结构域的v区。免疫球蛋白也称为抗体，是b淋巴细胞产生的膜结合或分泌的糖蛋白。在体液免疫的识别阶段，与膜结合的免疫球蛋白起受体的作用，在结合特定抗原后，触发b淋巴细胞的克隆扩增和分化为分泌免疫球蛋白的浆细胞。分泌的免疫球蛋白介导体液免疫的效应期，从而消除结合的抗原。抗原结合位点由一条重链的可变结构域及其相关轻链的可变结构域形成。因此，每个免疫球蛋白具有两个对特定抗原具有显著亲和力的抗原结合位点。可变结构域通过称为v-(d)-j重排的过程组装，然后可以进行体细胞超突变，其在暴露于抗原和选择后允许对特定抗原的亲和力成熟。(uniprot主登录号：p01593。)
凝血因子ix(fa9或f9)。
fa9是因子ix，其是维生素k依赖性血浆蛋白，其通过在存在ca2+离子、磷脂和因子viiia的情况下将因子x转化为其活性形式而参与凝血的内在途径。(uniprot主登录号：p00740。)
补体因子h相关蛋白4(fhr4或cfhr4)。
fhr4参与补体调节。它可以与脂蛋白结合，并可能在脂质代谢中起作用。(uniprot主登录号：q92496。)
含ferm和pdz结构域的蛋白质1(frpd1或frmpd1)。
frpd1用于稳定膜结合的gpsm1，从而促进其与gnai1的相互作用。(uniprot主登录号：q5syb0。)
热激蛋白hsp90-β(hs90b或hsp90ab1)。
hs90b是分子伴侣，其促进参与例如细胞周期控制和信号转导的特定靶蛋白的成熟、结构维持和适当调节。它经历与其atp酶活性相关的功能周期。该循环可能诱导客户蛋白的构象变化，从而引起其激活。它与各种辅助伴侣动态相互作用，从而调节其底物识别、atpase循环和伴侣功能。它通过与各种辅助伴侣蛋白或复合物(充当衔接子)相互作用而与一系列客户蛋白相互作用，同时能够与特定的客户和中心伴侣自身相互作用。招募atp和共伴侣蛋白，然后由客户蛋白组成功能性伴侣蛋白。陪伴过程完成后，正确折叠的客户蛋白和共伴侣蛋白将hsp90保留在adp结合的部分开放构象中，最后adp从hsp90释放，该蛋白在下一个周期获得开放构象。除了其伴侣活性外，它还在转录机制的调控中发挥作用。hsp90及其共伴侣蛋白至少在三个不同水平上调节转录。首先，它们响应各种生理信号而改变某些转录因子的稳态水平。其次，它们调节某些表观遗传修饰剂(例如组蛋白脱乙酰基酶或dna甲基转移酶)的活性，从而响应环境的变化。第三，它们参与从某些基因的启动子区域驱逐组蛋白，从而开启基因表达。它通过抑制stub1介导的smad3泛素化和降解来拮抗stub1介导的对tgf-β信号的抑制。它通过陪伴birc2促进细胞分化，从而保护其免受蛋白酶体机制的自身泛素化和降解。它是通过在热激下对jak2和prkce进行陪伴并参与其自身转录而参与stat1磷酸化/激活的主要伴侣蛋白。(uniprot主登录号：p08238。)
α-甘露糖苷酶2(ma2a1或man2a1)。
ma2a1催化复合n-聚糖的生物合成中的第一步。它控制着高甘露糖向复合n-聚糖的转化。n-聚糖成熟途径中的最后水解步骤。(uniprot主登录号：q16706。)
异戊二烯半胱氨酸氧化酶1(pcyox或pcyox1)。
pcyox参与异戊二烯化蛋白的降解。它切割异戊二烯基-l-半胱氨酸的硫醚键，如法呢基半胱氨酸和香叶基香叶基半胱氨酸。(uniprot主登录号：q9uhg3。)
嘌呤核苷磷酸化酶(pnph或pnp)。
pnph是嘌呤核苷磷酸化酶，其催化β-(脱氧)核糖核苷分子中的n-糖苷键的磷酸分解，形成相应的游离嘌呤碱基和1-磷酸戊糖。(uniprot主登录号：p00491。)
维生素k依赖性蛋白c(proc)。
proc是维生素k依赖性丝氨酸蛋白酶，其在钙离子和磷脂存在下通过使因子va和viiia失活来调节凝血。它对内皮细胞屏障功能具有保护作用。(uniprot主登录号：p04070。)
60s核糖体蛋白l3(rl3或rpl3)。
rl3是细胞质核糖体的大亚基的组分。(uniprot主登录号：p39023。)
丝氨酸/精氨酸重复基质蛋白2(srrm2)。
srrm2参与预mrna剪接。它可以在剪接体的催化中心处的第一个催化剪接步骤中或之前起作用。它可以通过稳定催化中心或rna底物的位置来实现(通过相似性)。它与rna结合。(uniprot主登录号：q9uq35。)
微管蛋白β-1链(tbb1或tubb1)。
tbbi是微管蛋白的亚基，其是微管的主要成分。它与两摩尔gtp结合，一个在β链的可交换位点且一个在α链的不可交换位点(相似性)。(uniprot主登录号：q9h4b7。)
腱生蛋白(tena或tnc)。
tena是一种细胞外基质蛋白，在发育、突触可塑性以及神经元再生过程中与神经元和轴突的迁移有关。它促进星形胶质细胞单层生长的皮质神经元的神经突生长。它是整联蛋白α-8/β-1、α-9/β-1、α-v/β-3和α-v/β-6的配体。在肿瘤中，它通过内皮细胞的伸长、迁移和发芽来刺激血管生成。(uniprot主登录号：p24821。)
热激蛋白75kda，线粒体(trap1)。
trap1是表达atp酶活性的伴侣蛋白。它在pink1和线粒体复合体i的下游参与维持线粒体功能和极化。它是线粒体呼吸的负调节剂，能够调节氧化磷酸化和有氧糖酵解之间的平衡。trap1对线粒体呼吸的影响可能是通过调节线粒体src和抑制sdha介导的。(uniprot主登录号：q12931。)
在一些实施方式中，基于来自受试者的样品中检测到一种或多种这些tbi生物标志物，可以使用以上列出的一种或多种tbi生物标志物来确定受试者未遭受tbi(排除tbi)。这些tbi生物标志物可包括actbl，aldh2，anxa5，camp，cpne3，crac1，cytc，dnpep，eif3i，gshb，icam1，hv323，hnrpd，kvd33，fa9，fhr4，frpd1，hs90b，ma2a1，pcyox，pn，proc，rl3，sh3l3，srrm2，tbb1，tena，trap1或其任何组合中的一种或多种。在受试者中测量或检测到一种或多种这些tbi生物标志物足以表明该受试者未遭受tbi，而无需检测、测量、比较和/或定量对照受试者中一种或多种tbi生物标志物的量、浓度和/或表达水平。尽管这些tbi生物标志物中的一种或多种可能存在于患有tbi的受试者中，但是它通常以无法通过常规手段检测的量存在，如本文所述。因此，在某些情况下，在受试者中检测到一种或多种这些tbi生物标志物表明该受试者未遭受tbi。这些tbi生物标志物的水平可以单独、或作为轻度tbi检测或表征的一部分组合检测或测量。
7.用于测量tbi生物标志物水平的方法
在上述方法中，可以通过任何手段来测量tbi生物标志物水平，例如抗体依赖性方法，例如免疫测定、蛋白质免疫沉淀、免疫电泳、化学分析、sds-page和蛋白质印迹分析、蛋白质免疫染色、电泳分析、蛋白质分析、竞争结合分析、功能蛋白质分析、或色谱或光谱法，例如高效液相色谱(hplc)、质谱或液相色谱-质谱(lc/ms)或毛细管电泳(ce)-ms、或直接输注、或任何与ms耦合的分离前端。而且，该测定可以以本领域技术人员已知的临床化学形式进行。
在一些实施方式中，测量tbi生物标志物的水平包括使样品与第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触。在一些实施方式中，第一特异性结合成员是捕获抗体，而第二特异性结合成员是检测抗体。在一些实施方式中，测量tbi生物标志物的水平包括使样品同时或以任何顺序依次地与以下接触：(1)与tbi生物标志物或tbi生物标志物片段上的表位结合的捕获抗体(例如tbi生物标志物-捕获抗体)，以形成捕获抗体-tbi生物标志物抗原复合物(例如tbi生物标志物捕获抗体-tbi生物标志物抗原复合物)，以及(2)包括可检测标记并与tbi生物标志物上未被捕获抗体结合的表位结合的检测抗体(例如tbi生物标志物检测抗体)，以形成tbi生物标志物抗原-检测抗体复合物(例如tbi生物标志物抗原-tbi生物标志物-检测抗体复合物)，从而形成捕获抗体-tbi生物标志物抗原-检测抗体复合物(例如tbi生物标志物-捕获抗体-tbi生物标志物抗原-tbi生物标志物-检测抗体复合物)，并基于捕获抗体-tbi生物标志物抗原-检测抗体复合物中可检测标记产生的信号，测量样品中tbi生物标志物的量或浓度。
在一些实施方式中，第一特异性结合成员被固定在固体支持物上。在一些实施方式中，第二特异性结合成员被固定在固体支持物上。在一些实施方式中，第一特异性结合成员是如下所述的tbi生物标志物抗体。
在一些实施方式中，将样品稀释或不稀释。样品可以是约1至约25μl、约1至约24μl、约1至约23μl、约1至约22μl、约1至约21μl、约1至约20μl、约1至约18μl、约1至约17μl、约1至约16μl、约15μl或约1μl、约2μl、约3μl、约4μl、约5μl、约6μl、约7μl、约8μl、约9μl、约10μl、约11μl、约12μl、约13μl、约14μl、约15μl、约16μl、约17μl、约18μl、约19μl、约20μl、约21μl、约22μl、约23μl、约24μl或约25μl。在一些实施方式中，样品为约1至约150μl或更少、或约1至约25μl或更少。
除定点照护装置外的一些仪器(如像abbottlaboratories仪器architect、雅培alinity仪器和其他核心实验室仪器)可能能够测量样品中tbi生物标志物的水平在10％cv或更低的情况下约为0.032μg/l。其他检测方法包括在纳米孔装置或纳米孔装置上的使用或可适于在纳米孔装置或纳米井装置上使用。纳米孔装置的实例在国际专利公开号wo2016/161402中描述，其通过引用整体并入本文。纳米井装置的实例在国际专利公开号wo2016/161400中描述，其通过引用整体并入本文。
a.通过质谱的检测
如本文所用，“ms数据”通常是指从质谱仪获得的原始ms数据和/或其中肽和其片段(例如转变和ms峰)已经被鉴定、分析和/或定量的ms数据。在本公开的一些实施方式中，基于mrm-ms或srm-ms和/或prm-ms的方法允许检测和准确定量复合混合物中的特定肽。srm/mrm-ms是可以对复合样品中的低丰度物质进行可靠全面定量的技术。srm/mrm-ms在类似三重四极杆的仪器上进行，其中通过碰撞诱导的解离获得更高的选择性。这是非扫描质谱技术，其中两个质量分析器(q1和q3)用作静态质量过滤器，以监视选定前体的特定片段。在三重四极杆仪器上，可以使用各种电离方法，包括但不限于电喷雾电离、化学电离、电子电离、大气压化学电离和基质辅助激光解吸电离。第一质量分析仪和碰撞池两者都以时间依赖的方式连续暴露于来自离子源的离子。一旦离子进入第三质量分析仪，时间依赖性就成为一个因素。在三重四极杆仪器上，样品离开电离源后，第一四极杆质量过滤器q1是主要的m/z选择器。除质荷比以外的任何离子，都不允许其渗透到q1中。位于第一四极杆质量过滤器q1和第二四极质量过滤器q3之间的碰撞池(称为“q2”)是在存在惰性气体(例如氩气、氦气或氮气)的情况下发生样品片段化的地方。离开碰撞池后，碎片离子随后行进到第二四极杆质量过滤器q3，在此处可以再次进行m/z选择。
与选定的前体离子和碎片离子相关的特定对质量荷电(m/z)值称为“跃迁”。该检测器充当与所选跃迁匹配的离子的计数设备，从而返回强度随时间的分布。mrm-ms是在同一实验中，通过在不同的前体/片段对之间快速切换，在色谱时间尺度上测量多个srm-ms跃迁的情况。通常，三重四极杆仪器循环进行一系列跃迁，并记录每个跃迁的信号随洗脱时间的变化。该方法通过监控给定分析物的多个跃迁的色谱共洗脱，实现了额外的选择性。
对于质谱和蛋白质组学的一般参考，参见例如quantitativeproteomicsbymassspectrometry(methodsinmolecularbiology)第二次编辑，2016版,humanapress(纽约,ny,2009)；danielmartins-de-souza,shotgunproteomics:methodsandprotocols2014版,humanapress(纽约,ny,2014)；
除了prm-ms之外，srm的应用还包括使用高分辨率质谱仪在一次分析中并行检测所有跃迁。prm-ms提供高选择性、高敏感性和高通量来定量选择的肽(q1)，从而定量蛋白质(ms1)。同样，可以为每种蛋白质专门选择多个肽。prm-ms方法使用质谱仪的四极杆分离目标前体离子，在碰撞池中将目标前体离子片段化，并然后在orbitrap质谱仪中检测生成的产物离子。数据采集后，通过提取质量分数窗口为5-10ppm的一个或多个碎片离子来进行定量。prm-ms使用四极杆飞行时间(qtof)或混合四极杆orbitrap(qorbitrap)质谱仪进行肽/蛋白质定量。qtof示例包括但不限于：tripletof6600或5600系统(sciex)；x500rqtof系统(sciex)；6500系列精确质量四极杆飞行时间(q-tof)(agilent)；或xevog2-xsqtof四极杆飞行时间质谱仪(waters)。qobitrap示例包括但不限于：qexactive混合四极杆orbitrap质谱仪(thermoscientific)；或orbitrapfusiontribrid(thermoscientific)。
在一些实施方式中，本文开发的方法可以应用于定量生物样品中的多肽或蛋白质。包括多肽或蛋白质的任何种类的生物样品都可以作为起点并通过本文公开的方法进行分析。实际上，任何包含蛋白质/肽的样品都可用于此处产生的方法并进行分析(例如组织、细胞)。本文的方法也可以与通过消化获得的肽混合物一起使用。多肽或蛋白质的消化包括任何种类的裂解策略，例如酶、化学、物理或其组合。根据一些实施方式，确定本文提供方法的以下参数：胰蛋白酶(或其他蛋白酶)消化和肽清除、最佳应答多肽、最佳应答蛋白、最佳应答肽、最佳应答片段、片段强度比(增加高和可重现的峰强度)、最佳碰撞能量和所有最佳参数，以使方法的敏感性和/或特异性最大化。
在其他实施方式中，需要多肽和/或相应蛋白质的定量或相应蛋白质的活性/调节。所选肽用稳定同位素标记，并用作内标(sil)以实现目标蛋白质的绝对定量。将标签的定量稳定标记的肽类似物添加到已知量的肽样品中；然后通过质谱法对标签和目标肽进行定量，并获得蛋白质内源性水平的绝对定量。
在一些实施方式中，本公开的生物标志物可以通过质谱法来检测，如上所述，质谱法是采用质谱仪检测气相离子的方法。质谱仪的示例是飞行时间，磁性扇区，四极滤波器，离子阱，离子回旋共振，静电扇区分析仪，以及前述的混合或组合等。在一个实施方式中，质谱法包括基质辅助的激光解吸/电离飞行时间(maldi-tofms或maldi-tof)。在另一个实施方式中，方法包括maldi-tof串联质谱法(maldi-tofms/ms)。在又一个实施方式中，质谱可与本领域普通技术人员可以想到的另一种适当方法组合。例如，maldi-tof可与本文所述的胰蛋白酶消化和串联质谱法一起使用或与富集一起使用。在另一个实施方式中，质谱技术是多反应监测(mrm)或定量mrm。
在一些实施方式中，质谱法涉及首先通过在具有结合生物标志物的色谱特性的色谱树脂上捕获一种或多种生物标志物来富集。例如，质谱法可以将生物标志物捕获在阳离子交换树脂(例如cmceramichyperdf树脂)上，洗涤树脂，洗脱生物标志物并通过maldi检测。可替代地，该方法可以先在阴离子交换树脂上分级样品，然后再施加到阳离子交换树脂上。在一个实施方式中，质谱法可以在阴离子交换树脂上分级，并通过maldi直接检测。在另一个实施方式中，质谱法可以将生物标志物捕获在包含结合生物标志物的抗体的免疫层析树脂上，洗涤树脂以去除未结合的物质，从树脂洗脱生物标志物，并通过maldi或另一台ms仪器检测洗脱的生物标志物(使用任何定量方法)。
本公开的生物标志物也可以通过其他合适的方法检测。为此目的可以采用的检测范例包括光学方法、电化学方法(伏安法和安培法技术)、原子力显微镜和射频方法，例如多极共振光谱法。除显微镜外，共焦和非共焦的光学方法的示例是检测荧光，发光，化学发光，吸光度，反射率，透射率和双折射或折射率(例如表面等离振子共振，椭圆光度法，共振镜法，光栅耦合器波导法或干涉法)或使用任何ms仪器和ms方法进行质谱分析。
8.识别tbi生物标志物的抗体
本文所述的方法可以使用与tbi生物标志物或其片段特异性结合的分离的抗体，称为“tbi生物标志物抗体”。tbi生物标志物抗体可用于评估tbi生物标志物的状态作为创伤性脑损伤的度量，检测生物样品中tbi生物标志物的存在，定量生物样品中存在的tbi生物标志物的量，或检测生物样品中tbi生物标志物的存在并定量其量。
tbi生物标志物抗体包括与tbi生物标志物、其片段、tbi生物标志物的表位或其变体结合的任何抗体。该抗体可以是抗tbi生物标志物抗体的片段或其变体或衍生物。该抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体，单链抗体，亲和力成熟的抗体，人抗体，人源化抗体，完全人抗体或抗体片段，例如fab片段，或其混合物。抗体片段或衍生物可以包含f(ab′)2、fv或scfv片段。抗体衍生物可以由拟肽产生。此外，描述用于生产单链抗体的技术可以适于生产单链抗体。
抗tbi生物标志物抗体可以是嵌合抗tbi生物标志物抗体或人源化抗tbi生物标志物抗体。在一个实施方式中，人源化抗体和嵌合抗体都是单价的。在一个实施方式中，人源化抗体和嵌合抗体均包含连接至fc区的单个fab区。
人抗体可源自噬菌体展示技术或表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。人抗体可以作为人体内免疫应答的结果而产生并被分离。参见例如funaro等人，bmcbiotechnology,2008(8):85。因此，该抗体可能是人而不是动物库的产物。由于它是人类起源，因此可以降低自身抗原反应的风险。可选地，可以使用标准的酵母展示库和展示技术来选择和分离人抗tbi生物标志物抗体。例如，可以使用原始的人类单链可变片段(scfv)库来选择人类抗tbi生物标志物i抗体。转基因动物可用于表达人抗体。
人源化抗体可以是来自非人类物种抗体的抗体分子，其结合具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(cdr)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的所需抗原。
该抗体与已知抗体的区别在于，它具有与本领域已知的生物学功能不同的生物学功能。
该抗体可以免疫特异性结合tbi生物标志物的肽、其片段或其变体。该抗体可以免疫特异性识别并结合表位区域内的至少三个氨基酸、至少四个氨基酸、至少五个氨基酸、至少六个氨基酸、至少七个氨基酸、至少八个氨基酸、至少九个氨基酸、或至少有十个氨基酸。该抗体可以免疫特异性识别并结合具有表位区域的至少三个连续氨基酸、至少四个连续氨基酸、至少五个连续氨基酸、至少六个连续氨基酸、至少七个连续氨基酸、至少八个氨基酸连续氨基酸、至少九个连续氨基酸、或至少十个连续氨基酸的表位。
9.抗体制备/生产
抗体可以通过多种技术中的任一种来制备，包括本领域技术人员众所周知的那些。通常，抗体可以通过细胞培养技术产生，包括通过常规技术、或通过将抗体基因、重链和/或轻链转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中来产生单克隆抗体，以实现抗体的生产，其中抗体可以是重组的。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源dna引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、deae-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达抗体，但是在真核细胞中表达抗体是优选的，并且在哺乳动物宿主细胞中最优选，因为这种真核细胞(特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能表达组装并分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。
用于表达重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(cho细胞)(包括dhfr-cho细胞，描述于urlaub和chasin，proc.natl.acad.sci.usa,77:4216-4220(1980))，与dhfr选择性标记一起使用，例如kaufman和sharp，j.mol.biol.,159:601-621(1982)中所述的ns0骨髓瘤细胞、cos细胞和sp2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足够长的时间以使抗体在宿主细胞中表达，或更优选地将抗体分泌到其中生长宿主细胞的培养基中来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
宿主细胞也可用于产生功能性抗体片段，例如fab片段或scfv分子。将理解的是，可以执行以上过程的变型。例如，可能希望用编码抗体的轻链和/或重链的功能片段的dna转染宿主细胞。重组dna技术也可用于去除编码与目标抗原结合不必要的轻链或重链中一个或两个的部分或全部dna。从这种截短的dna分子表达的分子也被抗体涵盖。另外，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是抗体(即结合人肌钙蛋白i)，而另一条重链和轻链通过将人抗体与人tbi生物标志物交联，从而对除人tbi生物标志物以外的抗原具有特异性。通过标准化学交联方法获得第二抗体。
在用于抗体或其抗原结合部分的重组表达的优选系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-cho细胞。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自可操作地连接至cmv增强子/admlp启动子调控元件，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带dhfr基因，该基因允许使用甲氨蝶呤的选择/扩增来选择已被该载体转染的cho细胞。培养选择的转化体宿主细胞以表达抗体重链和轻链，并从培养基中回收完整的抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞，并从培养基中回收抗体。更进一步地，合成重组抗体的方法可以是通过在合适的培养基中培养宿主细胞直到合成重组抗体。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组抗体。
制备单克隆抗体的方法包括制备能够产生具有所需特异性的抗体的永生细胞系。这样的细胞系可由获自免疫动物的脾细胞产生。可以用tbi生物标志物或其片段和/或变体免疫动物。用于免疫动物的肽可包含编码人fc的氨基酸，例如人抗体的可结晶片段或尾部片段。然后可以通过例如与骨髓瘤细胞融合伴侣融合来使脾细胞永生化。可以采用多种融合技术。例如，可以将脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子去污剂混合几分钟，然后以低密度接种在支持杂交细胞而非骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上。一种这样的技术使用次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷(hat)选择。另一种技术包括电融合。在足够的时间(通常约1至2周)后，观察到杂种的集落。选择单个集落，并测试其培养上清液对多肽的结合活性。可以使用具有高反应性和特异性的杂交瘤。
可以从生长的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。另外，可以采用各种技术来提高产量，例如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主例如小鼠的腹膜腔中。然后可以从腹水或血液中收获单克隆抗体。可以通过常规技术，例如色谱法、凝胶过滤、沉淀和提取，从抗体中去除污染物。亲和色谱法是可用于纯化抗体的方法的示例。
蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割igg分子以产生几个片段，其中两个片段(f(ab)片段)各自包含具有完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够切割igg分子，以提供多个包含两个抗原结合位点的片段，包括f(ab')2片段。
fv片段可以优选通过igm的蛋白水解切割而产生，并且在极少数情况下可以是igg或iga免疫球蛋白分子。fv片段可以使用重组技术衍生。fv片段包括非共价的vh::vl异二聚体，其包含保留天然抗体分子的许多抗原识别和结合能力的抗原结合位点。
抗体、抗体片段或衍生物可以包含分别插入重链和轻链构架(“fr”)组之间的重链和轻链互补决定区(“cdr”)组，所述fr组提供支持cdr并限定cdr彼此之间的空间关系。cdr组可包含重链或轻链v区的三个高变区。
可以使用产生或分离具有必要特异性的抗体的其他合适方法，包括但不限于从肽或蛋白质库(例如但不限于噬菌体、核糖体、寡核苷酸、rna、cdna或酵母等展示库)中选择重组抗体的方法；例如，可使用本领域已知的方法从各种商业供应商购得，例如cambridgeantibodytechnologies(cambridgeshire,uk)，morphosys(martinsreid/planegg,del.)，biovation(aberdeen,scotland,uk)bioinvent(lund,sweden)。参见美国专利号4,704,692；5,723,323；5,763,192；5,814,476；5,817,483；5,824,514；5,976,862。替代方法依赖于对转基因动物的免疫(例如scid小鼠，nguyen等人(1997)microbiol.immunol.41:901-907；sandhu等人(1996)crit.rev.biotechnol.16:95-118；eren等人(1998)immunol.93:154-161)，其如本领域已知和/或本文所述能产生人抗体库。这种技术包括但不限于核糖体展示(hanes等人(1997)proc.natl.acad.sci.usa,94:4937-4942；hanes等人(1998)proc.natl.acad.sci.usa,95:14130-14135)；单细胞抗体产生技术(例如选择的淋巴细胞抗体方法(“slam”)(美国专利号5,627,052，wen等人(1987)j.immunol.17:887-892；babcook等人(1996)proc.natl.acad.sci.usa93:7843-7848)；凝胶微滴和流式细胞术(powell等人(1990)biotechnol.8:333-337；单细胞系统，(cambridge,mass)；gray等人(1995)j.imm.meth.182:155-163；kenny等人(1995)bio/technol.13:787-790)；b细胞选择(steenbakkers等人(1994)molec.biol.reports19:125-134(1994))。
亲和力成熟的抗体可以通过本领域已知的许多方法中的任一种来产生。例如，参见marks等人，biotechnology,10:779-783(1992)，描述了通过vh和vl结构域改组的亲和力成熟。cdr和/或构架残基的随机诱变描述于barbas等人，proc.nat.acad.sci.usa,91:3809-3813(1994)；schier等人，gene,169:147-155(1995)；yelton等人，j.immunol.,155:1994-2004(1995)；jackson等人，j.immunol.,154(7):3310-3319(1995)；hawkins等人，j.mol.biol.,226:889-896(1992)。在美国专利号6,914,128b1中描述了在选择性诱变位置以及在接触或超突变位置处具有增强活性的氨基酸残基的选择性突变。
抗体变体还可以通过将编码抗体的多核苷酸递送至合适的宿主以提供转基因动物或哺乳动物来制备，例如山羊、牛、马和绵羊等，在其乳汁中产生此类抗体。这些方法在本领域中是已知的，并且例如在美国专利号5,827,690；5,849,992；4,873,316；5,849,992；5,994,616；5,565,362和5,304,489中描述。
抗体变体还可以通过递送多核苷酸以提供转基因植物和培养的植物细胞(例如但不限于烟草、玉米和浮萍)来制备，所述转基因植物和植物细胞在植物部分或从中培养的细胞中产生此类抗体、特定部分或变体。例如，cramer等人(1999)curr.top.microbiol.immunol.240:95-118和其中引用的参考文献描述了表达大量重组蛋白的转基因烟草叶的生产，例如使用诱导型启动子。转基因玉米已用于以商业生产水平表达哺乳动物蛋白，其生物活性与其他重组系统中产生的或从天然来源纯化的生物活性相同。参见例如hood等人，adv.exp.med.biol.(1999)464:127-147和其中引用的参考文献。还已经从转基因植物种子(包括烟草种子和马铃薯块茎)中大量生产抗体变体，包括抗体片段，例如单链抗体(scfv)。参见例如conrad等人(1998)plantmol.biol.38:101-109和其中引用的参考文献。因此，还可以根据已知方法使用转基因植物产生抗体。
抗体衍生物可以例如通过添加外源序列以修饰免疫原性或减少、增强或修饰结合、亲和力、缔合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或任何其他合适的特征来产生。通常，保持部分或全部非人或人cdr序列，而可变区和恒定区的非人序列被人或其他氨基酸取代。
小抗体片段可以是具有两个抗原结合位点的双抗体，其中片段包含与同一条多肽链(vhvl)中的轻链可变结构域(vl)连接的重链可变结构域(vh)。参见例如ep404,097；wo93/11161；和hollinger等人，(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448。通过使用太短以至于不允许同一条链上两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。还参见chen等人的美国专利号6,632,926，其全部内容通过引用并入本文，并公开了具有一个或多个氨基酸插入亲本抗体的高变区中并且对靶抗原的结合亲和力比抗原的亲本抗体的结合亲和力强至少约两倍的抗体变体。
抗体可以是线性抗体。制备线性抗体的方法是本领域已知的，并在zapata等人，(1995)proteineng.8(10):1057-1062中描述。简而言之，这些抗体包含一对串联的fd区段(vh-ch1-vh-ch1)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
可通过已知方法从重组细胞培养物中回收和纯化抗体，所述方法包括但不限于蛋白a纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟磷灰石色谱和凝集素色谱。高效液相色谱法(“hplc”)也可以用于纯化。
可检测地标记抗体可能是有用的。偶联针对这些试剂的抗体的方法是本领域已知的。仅出于说明的目的，抗体可以用可检测部分标记，例如放射性原子、发色团或荧光团等。这种标记的抗体可以用于体内或分离的测试样品中的诊断技术。它们可以与细胞因子、配体和另一种抗体连接。用于与抗体偶联以实现抗肿瘤作用的合适试剂包括细胞因子，例如白介素2(il-2)和肿瘤坏死因子(tnf)；用于光动力疗法的光敏剂，包括铝(iii)酞菁铝四磺酸盐、血卟啉和酞菁；放射性核素，例如碘-131(131i)、钇-90(90y)、铋-212(212bi)、铋-213(213bi)、锝-99m(99mtc)、铼-186(186re)和铼-188(188re)；抗生素，例如亚德里亚霉素、阿霉素、柔红霉素、甲氨蝶呤、道诺霉素、新卡他汀和卡铂；细菌、植物和其他毒素，例如白喉毒素、假单胞菌外毒素a、葡萄球菌肠毒素a、abrin-a毒素、蓖麻毒素a(去糖基化蓖麻毒素a和天然蓖麻毒素a)、tgf-α毒素、中华眼镜蛇(眼镜蛇)的细胞毒素和白树毒素(植物毒素)；来自植物、细菌和真菌的核糖体失活蛋白，例如局限曲霉素(由限制曲霉产生的核糖体失活蛋白)、皂草素(来自肥皂草的核糖体失活蛋白)和rna酶；酪氨酸激酶抑制剂；ly207702(二氟嘌呤核苷)；含有抗囊性药物的脂质体(例如反义寡核苷酸、编码毒素的质粒、甲氨蝶呤等)；和其他抗体或抗体片段，例如f(ab)。
通过使用杂交瘤技术、选择淋巴细胞抗体方法(slam)、转基因动物和重组抗体库的抗体生产在下文中更详细地描述。
10.识别tbi生物标志物的适体
本公开的方法包括使用适体来检测或鉴定一种或多种tbi生物标志物。适体适用于开发对靶分子具有高亲和力和选择性的探针，例如tbi肽生物标志物。适体包括单链dna(ssdna)、rna或修饰的核酸，它们具有与从小有机分子到蛋白质和肽范围内的靶标特异性结合的能力。如本领域已知的，靶标识别的基础是由单链寡核苷酸形成的三级结构。在一些实施方式中，可通过称为selex的体外选择方法获得用于检测或鉴定一种或多种tbi生物标志物的适体，其中通过使寡核苷酸重复结合靶分子以从合成dna或rna的随机序列库中选择适体。
在一些实施方式中，构成用于筛选候选tbi生物标志物捕获剂的适体库混合物的核酸可以是具有或不具有化学修饰的单链dna或rna。在选择过程中将额外的化学实体引入dna中可以包括例如使用5-炔烃修饰的核碱基(例如胸腺嘧啶)。另外，5-c8-炔基修饰的核苷酸三磷酸酯(例如脱氧胸苷)可商购或合成。可以通过pcr将这种5-c8-炔修饰的核碱基引入dna。这样的修饰可以通过所谓的生物正交化学进一步衍生，例如，使用cu(i)催化的相应叠氮化物与炔烃的1,3-偶极环加成。除了cu(i)催化的叠氮化物-炔烃环加成(cuaac)，无铜应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(spaac)也是有用的。在涉及细胞或生物系统的一些实施方式中，应变促进的叠氮化物-炔烃环加成可以克服与使用cu(i)有关的毒性问题。可以将多种期望的化学修饰添加至用于筛选目的的寡核苷酸库。此类修饰的实例包括但不限于脂族残基、芳族残基、带电荷残基、碱性残基、酸性残基、杂芳族残基、糖类残基、含金属残基或肽残基。
在一些实施方式中，待修饰以包含叠氮化物-炔烃化学基团的核碱基可以包括乙炔基-、丙炔基-或丁炔基-du、da、dc或dg核苷酸。在其他实施方式中，待修饰以包含叠氮化物-炔烃化学基团的核碱基可以是乙炔基-du核苷酸、或乙炔基-da核苷酸、乙炔基-dc核苷酸或乙炔基-dg核苷酸。具有这些示例修饰的核苷酸适体库可用于各种基于selex的选择方法中，以增强dna适体库的化学多样性。可以修饰核酸的起始或候选混合物，使得至少25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，至少99％或100％的成员修饰为包括例如通过点击化学引入的官能化。少于100％的修饰可通过允许寡核苷酸中的某些位置被修饰而不允许其他位置被修饰，从而提高多样性，而100％的修饰可确保选择过程中的一致性。在一些实施方式中，在寡核苷酸中的不同位置进行不同的修饰以进一步增强多样性。
识别tbi生物标志物的适体可用于多种方法中，以检测生物样品(例如目标生物实体，如蛋白质，核酸或微囊泡)中一种或多种tbi生物标志物的存在或水平。适体可以用作结合剂或捕获剂，以评估同源tbi生物标志物的存在或水平。在针对诊断和/或预后的本公开的各种实施方式中，可以在基于配体靶标的测定中配置一种或多种适体，其中可以使一种或多种适体与选择的生物样品接触以使该或多种适体能够与其靶tbi生物标志物分子缔合或结合。适体还可以用于基于评估的生物样品和检测到的生物标志物来鉴定多个tbi生物标志物的特征(“生物标志物”概况或表征)。生物样品的生物标志物概况可以包括可评估的一种或多种目标生物标志物的存在、水平或其他特征，包括但不限于存在、水平、序列、突变、重排、易位、缺失、表观遗传修饰、甲基化、翻译后修饰、等位基因、活性、复合伴侣、稳定性和半衰期等。
生物标志物概况或表征可用于评估诊断和/或预后标准，例如疾病的存在、疾病分期、疾病监测、疾病分层、或监测疾病的检测、转移或复发或进展。例如，本公开的方法可以包括用于使tbi生物标志物概况与选定的病症或疾病相关的方法，例如重度tbi、轻度tbi或轻度tbi的亚类。生物标志物概况还可以在临床上用于做出有关包括治疗干预在内的治疗方式的决策。基于适体检测，鉴定和/或定量的生物标志物概况可进一步在临床上用于做出治疗决定，包括是否执行成像程序(例如mri)。
11.方法的变型
所公开的确定样品中存在的感兴趣分析物(例如tbi生物标志物)的存在或量的方法可以如本文所述。所述方法还可以根据用于分析分析物的其它方法进行调整。熟知的变型的实例包括但不限于免疫测定法，诸如夹心免疫测定法(例如单克隆-单克隆夹心免疫测定法、单克隆-多克隆夹心免疫测定法，包括酶检测(酶免疫测定法(eia)或酶联免疫吸附测定法)(elisa)，竞争性抑制免疫测定法(例如正向和反向)、酶扩大免疫测定技术(emit)、竞争性结合测定法、生物发光共振能量转移(bret)、一步抗体检测测定法、均质测定法、异质测定法、即时捕获测定法等。
a.免疫测定法
感兴趣分析物、和/或其片段的肽(例如tbi生物标志物和/或其肽或片段)可以使用免疫测定中的tbi生物标志物抗体来分析。可以使用抗体并且检测与分析物(例如tbi生物标志物)的特异性结合来确定分析物的存在或量。例如，抗体、或其抗体片段可以特异性结合于分析物。如果需要，可以将一种或多种抗体与一种或多种可商购获得的单克隆/多克隆抗体组合使用。这类抗体可从诸如r&dsystems,inc.(minneapolis,mn)和enzolifesciencesinternational,inc.(plymouthmeeting,pa)的公司获得。
身体样品中分析物(例如tbi生物标志物)的存在或存在量可以使用免疫测定法容易地确定，诸如夹心免疫测定法(例如单克隆-单克隆夹心免疫测定法、单克隆-多克隆夹心免疫测定法，包括放射性同位素检测(放射免疫测定法(ria))和酶检测(酶免疫测定法(eia)或酶联免疫吸附测定法(elisa)(例如quantikineelisaassays,r&dsystems,minneapolis,mn))。可以使用的定点照护装置的实例是
固定化抗体或其抗体片段的使用可以结合到免疫测定法中。可以将抗体固定化在多种支持物上，诸如磁性或色谱基质颗粒、测定板(诸如微量滴定孔)的表面、固体基质材料片等。可以通过将抗体或多种抗体以阵列方式涂布在固体支持物上来制备测定条。然后可以将此条浸入到测试样品中并通过洗涤和检测步骤迅速处理以产生可测量信号，诸如显色的点。
可以使用均质形式。例如，在从受试者获得测试样品之后制备混合物。该混合物包含待评估分析物(例如tbi生物标志物)和特异性结合配偶体的测试样品。加入测试样品和特异性结合配偶体以形成混合物的顺序并不重要。同时使测试样品与特异性结合配偶体接触。在一些实施方式中，测试样品中包含的特异性结合配偶体和任何tbi生物标志物可以形成特异性结合配偶体-分析物(例如tbi生物标志物)-抗原复合物。特异性结合配偶体可以是抗分析物抗体(例如抗tbi生物标志物抗体，其结合具有氨基酸序列的表位，该序列包含tbi生物标志物的至少三个连续(3)氨基酸。此外，特异性结合配偶体可以用如上所述的可检测标记来标记或包含该可检测标记。
可以使用异质形式。例如，在从受试者获得测试样品之后制备第一混合物。混合物包含待评估分析物(例如tbi生物标志物)和第一特异性结合配偶体的测试样品，其中测试样品中包含的第一特异性结合配偶体和任何tbi生物标志物形成第一特异性结合配偶体分析物(例如tbi生物标志物)-抗原复合物。第一特异性结合配偶体可以是抗分析物抗体(例如抗tbi生物标志物抗体，其结合具有氨基酸序列的表位，该序列包含tbi生物标志物的至少三个连续(3)氨基酸。加入测试样品和第一特异性结合配偶体以形成混合物的顺序并不重要。
可以将第一特异性结合配偶体固定化在固相上。用于免疫测定法(针对特异性结合配偶体)中的固相可以为在本领域中已知的任何固相，诸如但不限于磁性颗粒、珠粒、试管、微量滴定板、比色管、膜、支架分子、薄膜、滤纸、盘片和芯片。在固相是珠粒的那些实施方式中，珠粒可以是磁性珠粒或磁性颗粒。磁性珠粒/颗粒可以是铁磁性的、亚铁磁性的、顺磁性的、超顺磁性的或铁磁流体的。示例性铁磁材料包括fe、co、ni、gd、dy、cro2、mnas、mnbi、euo以及nio/fe。亚铁磁材料的实例包括nife2o4、cofe2o4、fe3o4(或feo.fe2o3)。珠粒可以具有磁性的实心核心部分并且被一个或多个非磁性层包围。另选地，磁性部分可以是围绕非磁性核心的层。其上固定化有第一特异性结合成员的固体支持物可以以干燥形式或以液体储存。磁性珠粒在与具有其上固定化有第一特异性结合成员的磁性珠粒的样品接触之前或之后可以经受磁场。
在形成含有一种或多种特异性结合配偶体-分析物(例如tbi生物标志物)抗原复合物之后，使用本领域已知的任何技术从所述复合物中除去任何未结合的分析物。例如，未结合的分析物可以通过洗涤除去。然而，合乎需要的是第一特异性结合配偶体以超过测试样品中存在的任何分析物的量存在，以使得测试样品中存在的所有分析物都被第一特异性结合配偶体结合。
在除去任何未结合的分析物(例如tbi生物标志物)之后，将第二特异性结合配偶体添加到混合物中以形成第一特异性结合配偶体-感兴趣分析物(例如tbi生物标志物)-第二特异性结合配偶体复合物。第二特异性结合配偶体可以是抗分析物抗体(例如tbi生物标志物抗体，其结合具有包含至少三个连续(3)氨基酸的氨基酸序列的表位。此外，第二特异性结合配偶体用如上所述的可检测标记来标记或含有该可检测标记。
固定化抗体或其抗体片段的使用可以结合到免疫测定法中。可以将抗体固定化在多种支持物上，诸如磁性或色谱基质颗粒(诸如磁性珠粒)、胶乳颗粒或表面改性的胶乳颗粒、聚合物或聚合物薄膜、塑料或塑料薄膜、平面基材、测定板(诸如微量滴定孔)的表面、固体基质材料片等。可以通过将抗体或多种抗体以阵列方式涂布在固体支持物上来制备测定条。然后可以将此条浸入到测试样品中并通过洗涤和检测步骤迅速处理以产生可测量信号，诸如显色的点。
(1)夹心免疫测定
夹心免疫测定法测量抗体(即至少一种捕获抗体)和检测抗体(即至少一种检测抗体)的两个层之间的抗原量。捕获抗体和检测抗体结合抗原上的不同表位，例如感兴趣分析物(例如tbi生物标志物)。期望地，捕获抗体与表位的结合不会干扰检测抗体与表位的结合。单克隆或多克隆抗体均可用作夹心免疫测定法中的捕获抗体和检测抗体。
通常，采用至少两种抗体来分离和定量测试样品中的分析物(例如tbi生物标志物)。更具体地，至少两种抗体结合分析物的某些表位，从而形成免疫复合物，其被称为“夹心”。可以将一种或多种抗体用于捕获测试样品中的分析物(这些抗体常称为一种或多种“捕获”抗体)并且将一种或多种抗体用于使可检测(即可定量)标记结合夹心(这些抗体常称为一种或多种“检测抗体”)。在夹心测定法中，抗体与其表位的结合合乎需要地不会因测定中任何其它抗体与其相应表位的结合而减弱。选择抗体以使得与疑似含有分析物的测试样品接触的一种或多种第一抗体不与第二或后续抗体所识别的表位的全部或部分结合，从而干扰一种或多种第二检测抗体结合分析物的能力。
抗体可以在所述免疫测定法中用作第一抗体。抗体免疫特异性结合于分析物(例如tbi生物标志物)上的表位。除了本公开的抗体之外，所述免疫测定法可以包含第二抗体，所述第二抗体免疫特异性结合于未被第一抗体识别或结合的表位。
疑似含有分析物(例如tbi生物标志物)的测试样品可以同时或依次地与至少一种第一捕获抗体(或多种抗体)和至少一种第二检测抗体接触。在夹心测定形式中，首先在允许形成第一抗体-分析物抗原复合物的条件下使疑似含有分析物的测试样品与特异性结合于特定表位的至少一种第一捕获抗体接触。如果使用超过一种捕获抗体，则形成第一多重捕获抗体-tbi生物标志物抗原复合物。在夹心测定法中，抗体、优选至少一种捕获抗体以测试样品中预期的分析物的最大量的摩尔过量量使用。例如，每ml微粒涂布缓冲液可以使用约5μg/ml至约1mg/ml抗体。
i.抗tbi生物标志物捕获抗体
任选地，在使测试样品与至少一种第一捕获抗体接触之前，至少一种第一捕获抗体可以结合至固体支持物，所述固体支持物有利于从测试样品分离第一抗体-分析物(例如tbi生物标志物)复合物。可以使用本领域中已知的任何固体支持物，包括但不限于由聚合物材料制成、呈孔、管或珠粒(例如微粒)形式的固体支持物。一种(或多种)抗体可以通过吸附、通过使用化学偶联剂的共价键合或通过本领域中已知的其它手段与固体支持物结合，前提条件是这种结合不会干扰抗体结合分析物(例如tbi生物标志物)的能力。此外，如果需要，可以将固体支持物衍生化以允许与抗体上的各种官能团反应。这种衍生化需要使用某些偶联剂，诸如但不限于顺丁烯二酸酐、n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺。
此后将疑似含有分析物(例如tbi生物标志物)的测试样品孵育以允许形成第一捕获抗体(或多重捕获抗体)-分析物复合物。孵育可以在约4.5至约10.0的ph下，在约2℃至约45℃的温度下，并且持续至少约一(1)分钟至约十八(18)小时、约2-6分钟、约7-12分钟、约5-15分钟或约3-4分钟的时段来进行。
ii.检测抗体
在形成第一/多重捕获抗体-分析物(例如tbi生物标志物)复合物之后，然后使复合物与至少一种第二检测抗体接触(在允许形成第一/多重抗体-分析物抗原-第二抗体复合物的条件下)。在一些实施方式中，使测试样品与捕获抗体同时地与检测抗体接触。如果使第一抗体-分析物复合物与超过一种检测抗体接触，则形成第一/多重抗体-分析物-多重抗体检测复合物。与第一抗体一样，当使至少第二(和后续)抗体与第一抗体-分析物复合物接触时，在与上述的那些类似的条件下孵育一段时间是形成第一/多重抗体-分析物-第二/多重抗体复合物所需的。优选地，至少一种第二抗体含有可检测标记。在形成第一/多重抗体-分析物-第二/多重抗体复合物之前、同时或之后，可检测标记可以结合至少一种第二抗体。可以使用本领域中已知的任何可检测标记。
化学发光测定法可以根据adamczyk等人,anal.chim.acta579(1):61-67(2006)中所述的方法进行。虽然可以使用任何适合测定法形式，但微板化学发光计(mithraslb-940,bertholdtechnologiesu.s.a.,llc,oakridge,tn)使得能够快速测定多个小体积样品。使用96孔黑色聚苯乙烯微孔板(costar#3792)时，化学发光计可以配备有多个试剂注射器。可以将每个样品添加至单独的孔中，然后同时/依次添加如由所采用的测定类型所确定的其它试剂。合乎需要地，避免采用吖啶芳基酯的中性或碱性溶液中的假碱形成，例如通过酸化。然后逐孔记录化学发光应答。就这一点而言，记录化学发光应答的时间部分地取决于添加试剂和所采用的特定吖啶之间的延迟。
添加测试样品和一种或多种特异性结合配偶体以形成用于化学发光测定法的混合物的顺序并不关键。如果第一特异性结合配偶体用吖啶化合物可检测地标记，则形成可检测地标记的第一特异性结合配偶体-抗原(例如tbi生物标志物)复合物。可选地，如果使用第二特异性结合配偶体并且第二特异性结合配偶体用吖啶化合物可检测地标记，则形成可检测地标记的第一特异性结合配偶体-分析物-第二特异性结合配偶体复合物。任何未结合的特异性结合配偶体(无论标记或未标记的)都可以使用本领域中已知的任何技术(诸如洗涤)从混合物中除去。
过氧化氢可以在混合物中原位产生，或者在添加上述吖啶化合物之前、同时或之后提供或供应至混合物。过氧化氢可以许多方式(诸如将为本领域技术人员所显而易见的方式)原位产生。
可选地，可以简单地将过氧化氢源添加至混合物。例如，过氧化氢源可以是已知含有过氧化氢的一种或多种缓冲液或其它溶液。就这一点而言，可以简单地添加过氧化氢溶液。
在同时或依次向样品中添加至少一种碱性溶液之后，产生指示分析物(例如tbi生物标志物)存在的可检测信号，即化学发光信号。碱性溶液含有至少一种碱并且具有大于或等于10、优选大于或等于12的ph。碱性溶液的实例包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铵、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钙、碳酸钙和碳酸氢钙。添加至样品中的碱性溶液的量取决于碱性溶液的浓度。基于所用碱性溶液的浓度，本领域技术人员可容易地确定添加至样品中的碱性溶液的量。可以采用除化学发光标记以外的其它标记。例如，可以采用酶标记(包括但不限于碱性磷酸酶)。
可以使用本领域技术人员已知的常规技术检测产生的化学发光信号或其它信号。基于产生信号的强度，可以定量样品中的感兴趣分析物(例如tbi生物标志物)的量。具体地，样品中分析物的量与产生信号的强度成正比。所存在的分析物的量可以通过将所产生的光的量与分析物的标准曲线比较或通过与参考标准物比较来定量。可以通过质谱法、重量分析方法和本领域中已知的其它技术使用分析物的已知浓度的连续稀释液或溶液来生成标准曲线。
(2)正向竞争抑制测定
在正向竞争形式中，将已知浓度的标记的感兴趣分析物(例如具有荧光标记、用可裂解接头附接的标签等的tbi生物标志物)的等分试样用于与测试样品中用于与感兴趣分析物抗体(例如tbi生物标志物抗体)结合的感兴趣分析物比较。
在正向竞争测定中，固定化的特异性结合配偶体(诸如抗体)可以依次或同时与测试样品和标记的感兴趣分析物、其感兴趣分析物片段或感兴趣分析物变体接触。感兴趣分析物肽、感兴趣分析物片段或感兴趣分析物变体可以用任何可检测标记来标记，包括由用可裂解接头附接的标签组成的可检测标记。在此测定中，可以将抗体固定化在固体支持物上。可选地，可以将抗体与固定化在固体支持物(诸如微粒或平面基材)上的抗体，诸如抗物种抗体偶联。
将标记的感兴趣分析物、测试样品和抗体在与上文结合夹心测定形式所述的那些类似的条件下孵育。然后可以产生两种不同物种的抗体-感兴趣分析物复合物。具体地，产生的抗体-感兴趣分析物复合物之一含有可检测标记(例如荧光标记等)，而另一种抗体-感兴趣分析物不含可检测标记。抗体-感兴趣分析物复合物可以但不必在定量可检测标记之前与测试样品的其余部分分离。无论抗体-感兴趣分析物复合物是否与测试样品的其余部分分离，然后都定量抗体-感兴趣分析物复合物中可检测标记物的量。然后可以确定测试样品中感兴趣分析物(诸如膜相关的感兴趣分析物、可溶性感兴趣分析物、可溶性感兴趣分析物的片段、感兴趣分析物的变体(膜相关的或可溶性感兴趣分析物)或其任何组合)的浓度，例如，如上所述的。
(3)反向竞争抑制测定
在反向竞争测定法中，固定化的感兴趣分析物(例如tbi生物标志物)可以依次或同时地与测试样品和至少一种标记抗体接触。
感兴趣分析物可以与固体支持物，诸如上文结合夹心测定形式讨论的固体支持物结合。
将固定化的感兴趣分析物、测试样品和至少一种标记抗体在与上文结合夹心测定形式所述的那些类似的条件下孵育。然后产生两种不同物种的感兴趣分析物-抗体复合物。具体地，产生的感兴趣分析物-抗体复合物之一被固定化并且含有可检测标记(例如荧光标记等)，而另一种感兴趣分析物-抗体没有被固定化且不含可检测标记。通过本领域已知的技术，诸如洗涤，从固定化的感兴趣分析物-抗体复合物的存在中除去未固定化的感兴趣分析物-抗体复合物和测试样品的其余部分。一旦除去未固定化的感兴趣分析物抗体复合物则在裂解标签后定量固定化的感兴趣分析物-抗体复合物分析物中可检测标记的量。然后可以通过比较如上所述的可检测标记的数量来确定测试样品中每种感兴趣分析物的浓度。
(4)一步免疫测定法或“即时捕获”测定
在即时捕获免疫测定法中，将固体基质预先涂布有固定剂。将分析物(例如tbi生物标志物)的捕获剂和检测剂共同添加至固体基质，之后进行洗涤步骤，然后检测。捕获剂可以结合分析物并且包含固定剂的配体。捕获剂和检测剂可以是抗体或如本文所述或本领域中已知的能够捕获或检测的任何其它部分。配体可以包含肽标签并且固定剂可以包含抗肽标签抗体。另选地，配体和固定剂可以是能够结合在一起，以便用于即时捕获测定法的任何试剂对(例如特异性结合对，以及如本领域中已知的其它试剂对)。可以测量超过一种分析物。在一些实施方式中，可以用抗原涂布固体基质，并且待分析的分析物是抗体。该方法还可以与ms检测和定量结合。
在某些其它实施方式中，在一步免疫测定法或“即时捕获”中，使用了预先涂布有固定剂(诸如生物素、链霉抗生物素蛋白等)的固体支持物(诸如微粒)和至少第一特异性结合成员和第二特异性结合成员(分别用作捕获试剂和检测试剂)。第一特异性结合成员包含固定剂的配体(例如，如果固体支持物上的固定剂是链霉抗生物素蛋白，则第一特异性结合成员上的配体可以是生物素)并且还结合感兴趣分析物(例如tbi生物标志物)。第二特异性结合成员包含可检测标记并且结合感兴趣分析物。可以将固体支持物和第一和第二特异性结合成员(依次或同时地)添加到测试样品中。第一特异性结合成员上的配体与固体支持物上的固定剂结合，形成固体支持物/第一特异性结合成员复合物。存在于样品中的任何感兴趣分析物与固体支持物/第一特异性结合成员复合物结合以形成固体支持物/第一特异性结合成员/分析物复合物。第二特异性结合成员与固体支持物/第一特异性结合成员/分析物复合物结合，并且检测到可检测标记。在检测之前可以采用任选的洗涤步骤。在某些实施方式中，在一步测定法中，可以测量超过一种分析物。在某些其它实施方式中，可以采用超过两种特异性结合成员。在某些其它实施方式中，可以添加多种可检测标记。在某些其它实施方式中，可以检测到多种感兴趣分析物，或者测量、确定或评估它们的量、水平或浓度，包括使用质谱。
即时捕获测定法的使用可以以如本文所述、并且在本领域中已知的多种形式进行。例如，所述形式可以是如上所述的夹心测定法，但另选地可以是竞争测定法，可以采用单一特异性结合成员、或使用诸如已知的其它变型。该方法还可以与ms检测和定量结合。
12.其他因素
如上所述的诊断、预后和/或评估的方法可以进一步包括使用其它因素进行诊断、预后和评估。在一些实施方式中，可以使用格拉斯哥昏迷量表或扩展的格拉斯哥结局量表(gose)来诊断创伤性脑损伤。也可以单独使用或与格拉斯哥昏迷量表组合使用其它测试、量表或指数。一个实例是瑞秋洛斯阿米哥斯量表(ranchoslosamigosscale)。瑞秋洛斯阿米哥斯量表测量意识、认知、行为和与环境的互动的水平。瑞秋洛斯阿米哥斯量表包括：i级：无反应；ii级：总体反应；iii级：局部反应；iv级：困惑-躁动；v级：困惑-不适当反应；vi级：困惑-适当反应；vii级：自动-适当反应；和viii级：有目的-适当反应。
13.样品
在一些实施方式中，在人类受试者遭受由身体摇动、导致闭合性或开放性头部创伤的外部机械力或其它力产生的钝性冲击、一次或多次跌倒、爆炸或冲击波或其它类型的钝力创伤引起的头部损伤之后获得样品。在一些实施方式中，在人类受试者摄入或暴露于化学物质、毒素或化学物质和毒素的组合之后获得样品。此类化学物质和/或毒素的实例包括火、霉菌、石棉、杀虫剂和杀昆虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体(诸如一氧化碳、硫化氢和氰化物)、有机金属(诸如甲基汞、四乙基铅和有机锡)和/或一种或多种滥用药物。在一些实施方式中，样品从罹患自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、一种或多种病毒、脑膜炎、脑积水或其组合的人类受试者获得。
在又另一个实施方式中，本文所述的方法使用的样品还可以用于通过使用下文所述的抗tbi生物标志物抗体或其抗体片段确定受试者中的tbi生物标志物的水平来确定受试者是否患有轻度创伤性脑损伤或处于罹患轻度创伤性脑损伤的风险中。因此，在特定实施方式中，本公开还提供了一种用于确定患有本文所述且本领域已知的创伤性脑损伤或处于本文所述且本领域已知的创伤性脑损伤的风险中的受试者是否是用于疗法或治疗的候选者的方法。通常，受试者是以下中的至少一者：(i)经历过头部损伤；(ii)摄入和/或暴露于一种或多种化学物质和/或毒素；(iii)罹患自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、一种或多种病毒、脑膜炎、脑积水或罹患其任何组合；或(iv)(i)-(iii)的任何组合；或者，实际上已被诊断患有tbi或处于tbi的风险下(诸如像，罹患自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、一种或多种病毒、脑膜炎、脑积水或其组合的受试者)和/或展现出不利的(即临床上不希望的)如本文所述的tbi生物标志物或tbi生物标志物片段的浓度或量。
a.测试或生物样品
如本文所用，“样品”、“测试样品”、“生物样品”是指含有或疑似含有tbi生物标志物的流体样品。样品可以源自任何适合的来源。在一些情况下，样品可以包含液体、流动的微粒固体或固体颗粒的流体悬浮液。在一些情况下，可以在本文所述的分析之前处理样品。例如，可以在分析之前将样品从其来源分离或纯化；然而，在某些实施方式中，可以直接测定含有tbi生物标志物的未处理样品。在一个具体实例中，含有tbi生物标志物的来源是人体物质(例如体液、血液(诸如全血、血清、血浆)、尿液、唾液、汗液、痰液、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊水、间质液、肺灌洗液、脑脊髓液、粪便、组织、器官等)。组织可以包括但不限于骨骼肌组织、肝组织、肺组织、肾组织、心肌组织、脑组织、骨髓、子宫颈组织、皮肤等。样品可以是液体样品或固体样品的液体提取物。在某些情况下，样品的来源可以是器官或组织，诸如活检样品，其可以通过组织分解/细胞裂解而溶解。
可以分析广泛范围体积的流体样品。在一些示例性实施方式中，样品体积可以是约0.5nl、约1nl、约3nl、约0.01μl、约0.1μl、约1μl、约5μl、约10μl、约100μl、约1ml、约5ml、约10ml等。在一些情况下，流体样品的体积在约0.01μl与约10ml之间、在约0.01μl与约1ml之间、在约0.01μl与约100μl之间、或在约0.1μl与约10μl之间。
在一些情况下，流体样品可以在用于测定中之前进行稀释。例如，在含有tbi生物标志物的来源为人体液(例如全血、血清或血浆)的实施方式中，流体可以用适当的溶剂(例如缓冲液，诸如pbs缓冲液)进行稀释。在使用之前可以将流体样品稀释约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约10倍、约100倍或更多。在其它情况下，流体样品在用于测定中之前不进行稀释。
在一些情况下，样品可以经历分析前处理。分析前处理可以提供额外的功能性，诸如非特异性蛋白质去除和/或有效但可廉价实现的混合功能性。分析前处理的一般方法可以包括使用电动力捕获、ac电动力学、表面声波、等速电泳、介电电泳、电泳或本领域已知的其它预浓缩技术。在一些情况下，流体样品可以在用于测定中之前进行浓缩。例如，在含有tbi生物标志物的来源为人体液(例如全血、血清或血浆)的实施方式中，流体可以通过沉淀、蒸发、过滤、离心或其组合来浓缩。在使用之前可以将流体样品浓缩约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约10倍、约100倍或更多。
b.对照
可能希望包括对照样品。对照样品可以与如上所述的来自受试者的样品同时分析。可以将从受试者样品获得的结果与从对照样品获得的结果进行比较。可以提供标准曲线，可以将样品的测定结果与其进行比较。如果使用荧光标记，则这类标准曲线呈现作为测定单位，即荧光信号强度的函数的标记物水平。使用取自多个供体的样品，可以提供针对正常健康组织中tbi生物标志物的参考水平，以及针对取自可能具有上文阐述的一个或多个特征的供体的组织中tbi生物标志物的“有风险”水平的标准曲线。
因此，鉴于上文，提供了一种用于确定测试样品中tbi生物标志物的存在、量或浓度的方法。所述方法包括通过免疫测定法测定测试样品的tbi生物标志物，例如采用至少一种结合tbi生物标志物上的表位的捕获抗体和至少一种结合tbi生物标志物上的不同于捕获抗体表位的表位并且任选地包括可检测标记的检测抗体，并且包括将作为测试样品中tbi生物标志物的存在、量或浓度的直接或间接指示的由可检测标记生成的信号与作为校准物中tbi生物标志物的存在、量或浓度的直接或间接指示的生成信号进行比较。校准物任选地、且优选地是一系列校准物的一部分，其中每种校准物与系列中的其它校准物的不同之处在于tbi生物标志物的浓度。
14.试剂盒
本文提供一种试剂盒，该试剂盒可以用于测定或评估测试样品的一种或多种tbi生物标志物和/或其片段。该试剂盒包含用于测定测试样品的tbi生物标志物的至少一种组分和用于测定测试样品的tbi生物标志物的说明书。例如，该试剂盒可以包含用于通过免疫测定法，例如化学发光微粒免疫测定法测定测试样品的tbi生物标志物的说明书。试剂盒中所包括的说明书可以粘贴于包装材料上或可以作为包装说明书包括在内。虽然说明书通常是书写或印刷的材料，但它们不限于此类。本公开涵盖了能够存储这类说明并将其传达给最终使用者的任何介质。这类介质包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、磁片盒、芯片)、光学介质(例如cdrom)等。如本文所用，术语“说明书”可以包括提供说明书的互联网网站的地址。
至少一种组分可以包括至少一种组合物，该组合物包含特异性结合于tbi生物标志物的一种或多种分离抗体或其抗体片段。抗体可以是tbi生物标志物检测抗体和/或捕获抗体。
可选地或另外，试剂盒可以包含校准物或对照(例如纯化的且任选冻干的tbi生物标志物)、和/或用于进行测定的至少一个容器(例如管、微量滴定板或条，其可以已经用抗tbi生物标志物抗体涂布)和/或缓冲液，诸如测定缓冲液或洗涤缓冲液，其中任一者都可以提供为浓缩溶液、可检测标记(例如酶标记)的底物溶液、或终止溶液。优选地，试剂盒包含进行测定法所必需的所有组分，即试剂、标准物、缓冲液、稀释剂等。说明书还可以包括用于生成标准曲线的说明书。
试剂盒可以进一步包含用于定量tbi生物标志物的参考标准物。参考标准物可以用于建立标准曲线以内推和/或外推tbi生物标志物的浓度。标准可以包括由氨基酸残基组成的蛋白质或肽片段、或n15稳定同位素标记的蛋白质或各种分析物的肽片段，以及样品处理的标准，包括涉及蛋白质和定量肽中的尖峰的标准。在一些实施方式中，tbi生物标志物的参考标准物可以对应于来源于健康参考群体的第99个百分位数。这类参考标准物可以使用本领域已知的常规技术确定。
试剂盒中提供的任何抗体，诸如对tbi生物标志物具有特异性的重组抗体可以合并可检测标记，诸如荧光团、放射性部分、酶、生物素/抗生物素蛋白标记、发色团或化学发光标记等，或者试剂盒可以包括用于标记抗体的试剂或用于检测抗体(例如检测抗体)的试剂和/或用于标记分析物(例如tbi生物标志物)的试剂或用于检测分析物(例如tbi生物标志物)的试剂。抗体、校准物和/或对照可以提供于独立容器中或预分配至适当测定形式中，例如预分配至微量滴定板中。
任选地，试剂盒包括质量控制组分(例如敏感性组、校准物和阳性对照)。质量控制试剂的制备为本领域中所熟知且描述于各种免疫诊断产品的插页上。敏感性组成员任选地用于确立测定法性能特征，并且进一步任选地是免疫测定试剂盒试剂的完整性和测定法的标准化的可用指标。
试剂盒也可以任选地包括进行诊断测定法或有利于质量控制评价所需的其它试剂，诸如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、底物、检测试剂等。用于分离和/或处理测试样品的其它组分(诸如缓冲液和溶液)(例如预处理试剂)也可以包括于试剂盒中。试剂盒可以另外包括一个或多个其它对照。试剂盒的一种或多种组分可以被冻干，在所述情况下试剂盒可以进一步包括适于复原冻干组分的试剂。
试剂盒的各种组分任选地根据需要提供于适合容器，例如微量滴定板中。试剂盒可以进一步包括用于容纳或存储样品的容器(例如用于尿液、全血、血浆或血清样品的容器或盒)。适当时，试剂盒任选地也可以含有反应器皿、混合器皿和有利于制备试剂或测试样品的其它组分。试剂盒也可以包括用于帮助获得测试样品的一种或多种仪器，诸如注射器、移液管、钳子、测量匙等。
如果可检测标记是至少一种吖啶化合物，则试剂盒可以包括至少一种吖啶-9-甲酰胺、至少一种吖啶-9-羧酸芳基酯或其任何组合。如果可检测标记是至少一种吖啶化合物，则试剂盒也可以包括过氧化氢来源，诸如缓冲液、溶液和/或至少一种碱性溶液。如果需要，试剂盒可以含有固相，诸如磁性颗粒、珠粒、试管、微量滴定板、比色管、膜、支架分子、薄膜、滤纸、盘片或芯片。
如果需要，试剂盒可以进一步包括用于测定测试样品中的另一种分析物的一种或多种组分，这些组分单独地或与说明书进一步组合，所述另一种分析物可以是生物标志物，诸如创伤性脑损伤或病症的生物标志物。
a.试剂盒和方法的适应性
试剂盒(或其组分)以及用于通过本文所述的免疫测定法评估或测定测试样品中tbi生物标志物的浓度的方法可以适用于多种自动化和半自动化系统(包括其中固相包括微粒的那些)，如例如美国专利号5,063,081、美国专利申请公开号2003/0170881、2004/0018577、2005/0054078和2006/0160164中所述的和如例如由abbottlaboratories(abbottpark,il)作为abbott定点照护(
自动化或半自动化系统与非自动化系统(例如elisa)之间相比的一些差异包括第一特异性结合配偶体(例如分析物抗体或捕获抗体)所附接的底物(其可能影响夹心形成和分析物反应性)，以及捕获、检测和/或任何任选洗涤步骤的长度和时间。非自动化形式(诸如elisa)关于样品和捕获试剂可能需要相对较长的孵育时间(例如约2小时)，而自动化或半自动化形式(例如
可从abbottlaboratories获得的其它平台包括但不限于
具体地，关于测定法对
在操作中，将来自疑似患有tbi的受试者的样品添加到测试盒的保持室中，并且将盒插入到
如本文所述的方法和试剂盒必然涵盖用于进行免疫测定法的其它试剂和方法。例如，涵盖各种缓冲液，诸如本领域中已知和/或可以易于制备或优化以例如用于洗涤、用作缀合物稀释剂、微粒稀释剂和/或用作校准物稀释剂的缓冲液。示例性缀合物稀释剂是在某些试剂盒(abbottlaboratories,abbottpark,il)中所采用且含有2-(n-吗啉基)乙烷磺酸(mes)、盐、蛋白阻断剂、抗微生物剂和洗涤剂的
本文所述的方法和试剂盒还可涉及单分子计数。在某些实施方式中，用于分析物分析的方法可以包括评估样品中存在的分析物。在某些实施方式中，该评估可用于确定样品中分析物的存在和/或浓度。在某些实施方式中，该方法还可用于确定样品中存在的多种不同分析物的存在和/或浓度。
本领域中已知的允许检测一种或多种感兴趣分析物的单个分子的任何装置都可以用于本文所述的系统中。例如，该设备可以是微流体设备、数字微流体设备(dmf)、基于表面声波的微流体设备(saw)、集成dmf和分析物检测设备、集成saw和分析物检测设备、或基于机器人的测定处理单元。可以使用的其他设备的示例包括quanterixsimoatm(lexington,ma)、singulex的单分子计数(smctm)技术(alameda,ca，参见例如美国专利号9,239,284，其内容通过引用并入本文)等。
其他检测方法包括使用纳米孔装置或纳米井装置或可适于在它们上使用。纳米孔装置的实例在国际专利公开号wo2016/161402中描述，其通过引用整体并入本文。纳米井装置的实例在国际专利公开号wo2016/161400中描述，其通过引用整体并入本文。
本文所述的方法和试剂盒可涉及使用dia-ms、dda-ms或srm/mrm-ms或prm-ms的质谱法。在某些实施方式中，用于分析物分析的方法可以包括评估样品中分析物的存在。在某些实施方式中，评估样品中分析物的存在可用于确定样品中分析物或片段的存在和/或浓度。在某些实施方式中，该方法还可用于确定样品中存在的多种不同分析物或分析物片段的存在和/或浓度。可以使用内部对照蛋白或肽片段进行定量。
虽然本文的某些实施方式在用于评估疾病(诸如创伤性脑损伤)时是有利的，但是测定法和试剂盒也可以任选地在适当时用于评估其它疾病、病症和病状中的各种生物标志物。
测定方法也可用于鉴定改善疾病，诸如创伤性脑损伤的化合物。例如，可以使表达任何本文所述的各种生物标志物的细胞与候选化合物接触。可以使用本文所述的测定方法将与化合物接触的细胞中的一种或多种这些生物标志物的表达水平与对照细胞中的表达水平进行比较。
本公开具有多个方面，这通过以下非限制性实施例说明。
15.实施例
对于本领域技术人员显而易见的是，本文所述的本公开方法的其它适合修改和变型是容易应用和了解的，并且可以在不脱离本公开或本文公开的方面和实施方式的范围下使用适合等同物来进行。现已详细描述本公开，通过参考以下实施例将对其有更明确理解，所述实施例仅旨在说明本公开的一些方面和实施方式，并且不应视为限制本公开的范围。本文中提及的所有期刊参考文献、美国专利和公布的公开内容均据此通过引用全文并入。
本公开具有多个方面，这通过以下非限制性实施例说明。
实施例1
针对创伤性脑损伤开发多模态分类方案
这项研究的目的是为脑损伤开发分类方案，该方案指示损伤的性质(类型)和严重程度。例如，血清生物标志物揭示细胞类型。创伤患者分为三组进行分析：仅脑损伤、仅非脑损伤和组合损伤。将脑损伤和非脑损伤的创伤组相互比较，并与脑/非脑创伤的组合进行比较。将这些创伤组与非创伤对照组进行比较。将创伤患者的csf与非创伤患者的csf进行了比较。次要目标是确定任何一项测量(单独或组合使用)是否可作为tbi术后临床预后的指标。
基于以下几种测量，开发了一种针对创伤性脑损伤的客观多模态分类方案和结局度量：1)基于血液的生物标志物；2)生理测量及评价；和3)射线照相测量(ct和3tmri)。基于血液的生物标志物可以指示受损的细胞类型(例如神经胶质细胞相对于神经元)，而射线照相可以检测结构变化。
研究地点：在明尼苏达州的亨内平县医疗中心(hcmc)招募了创伤患者。参与者包括出现在hcmc急诊部(ed)、创伤急救室或直接转移到神经外科的各个年龄段的创伤患者。排除患有重大精神或神经病症、发育异常或是犯人的创伤患者。通过搜索所有创伤入院的医疗记录并与医院使用的美国外科医师学院创伤记录进行交叉核对来鉴别受试者。
在入院时招募经历以下的所有创伤患者以进行筛选：1)标准化(模板化)病史检查和体检；2)如果针对其它适应症抽血，则分析血清生物标志物；3)按照临床指示的射线照相研究；4)按照1)-3)的临床指示进行的随访；5)仅对进入手术室的患者进行的病理标本分析；6)仅对接受脑室造瘘术导管的患者进行的csf分析；7)仅对接受licox的患者进行的脑组织氧合分析；和8)按照临床指示在tbi中心进行的结局评估。在入院时，潜在的参与者在提供知情同意书之前经历了24小时的筛选过程(表2)。
表2筛选评估
or：进入手术室的患者；vc：接受脑室造瘘术导管的患者；licox：接受licox的患者
此外，同意的患者和对照者(年龄和性别匹配)经历了上述研究以及以下附加研究：1基因组、血清和csf；和2)选定情况下的3tmri(测试组中的血清标记物；对照组中的正常标记物)。创伤患者包括从无脑受伤、ct阴性到需要进行手术的结构性脑损伤的全部范围。历经大约15个月招募患者和对照者。追踪存活的创伤受试者，直到他们退出hcmc服务。邀请在er中评估并释放的受试者进行研究随访。
筛选过程包括标准化和模板化病史检查和体检。该模板是epic中当前的“手术创伤史和身体”模板，还有一个附加问题：询问患者是否遭受了头部创伤。如果患者遭受了头部创伤，则三个部分自动下拉以显示额外信息。第一部分是来自神经外科创伤史和身体模板的信息，包括蛛网膜下腔级别、出血级别、脑内出血和社会历史(教育水平、就业、生活安排和种族)。最后两部分是标准化脑损伤评估工具：脑震荡的标准化评估(sac)和症状严重程度评分(sss)。这些评估的婴儿版本可用，并在有指示时使用。此外，“手术创伤史和身体”模板中已经包括的意识丧失问题被复制到此下拉部分，其中包含问题子集，其为意识丧失事件和患者当前的方向提供更加清楚的了解。将在入院前24小时内进行的临床上最准确的评估用于将来的数据分析。
还基于以下标准包括非tbi受试者：纳入时年龄在15与50岁之间；在性别、年龄、偏手性、教育程度和扫描仪标准方面具有与tbi人群相似的特征；并能够足够清晰的沟通和语言流畅，以允许受试者提供书面知情同意，或未成年人获得父母或监护人的同意，以及完成研究评估以参与研究的所有部分。非tbi受试者在有以下情况时被排除：在过去6个月内被诊断为轻度tbi；在过去的10年内，先前有中度至重度tbi(gcs<13)；在过去的10年中，有癫痫，伴有反复发作；基于dast-10筛选，在过去10年内有药物滥用(大麻除外)；基于audit-c筛选，有酒精滥用；当前的原发性第i轴或第ii轴精神障碍，但归为轻度且预计不会影响研究行为或完整性的疾病除外；脑质量、神经外科手术、中风、白质病和/或痴呆病史；已知的认知功能障碍或结构性脑疾病/畸形；基于先前神经影像学检查发现的结构性脑损伤；开了抗精神病药/抗癫痫药；研究者认为，无法(例如由于紧急医疗需要)或不愿意准确地完成研究程序或存在任何可能影响研究结果的利益冲突；或mri扫描的禁忌症，包括：a.根据现场实际情况，目前或疑似怀孕；b.根据研究人员在参与研究期间可能对受试者造成危害的其它状况；和c.无法遵守地方的mr安全政策的任何部分。
样本收集和处理.在每次样本收集时获取至多40ml(大约3大匙)血液。在遭遇1、24和5时抽取2管血清和2管血浆。在遭遇3时，抽取2管血清、1管血浆和1或2管全血。这些研究样本经过处理、等分、冷冻并运到abbottlaboratories进行生物标志物测试和存储。将样品等分试样送到测试地点进行额外的tbi生物标志物测试。如果存在以下情况，则该样本视为对于该研究而言是无法评估的：它含有的体积不足以进行必要的测量；样本有严重溶血、脂血或黄疸；没有将其收集在正确类型的收集管中；它没有正确标记；或收集地点或abbottlaboratories未将其正确存储。
通过抽血获得血清样本。如果出于临床目的在入院时获得抽血，则获得并保留额外的样本用于研究目的。如果没有出于临床目的抽取血液，则受过训练的研究人员会抽取研究所需的血液。除非标准护理要求中心静脉通道(在这种情况下通过该通道抽取血液)，否则通过静脉穿刺抽取血液。入院时进行第一次抽血，第一次抽血后3-6小时进行第二次抽血，且在创伤后24小时进行第三次抽血。寻找易受tbi影响的遗传标记或tbi的预测标记的探索工作也在进行中。在每个时间点，收集40ml(少于3大匙)血液：20ml血清(2管)和20ml血浆(2管)。在遭遇1期间，仅收集2管血清和1管血浆用于血液生物标志物分析。此全血收集在全血试管中为6.0ml。如果患者纳入遭遇2而非遭遇1，则对他们收集2管血清和1管血浆以进行血液生物标志物分析。此全血收集在全血试管中为6.0ml。
根据ninos标准化表(表8)限制抽血量。对于七岁以下的儿童，抽血的尝试次数限制到两次尝试。在ninos标准化表格不允许抽取足够的血液用于研究，或者在儿童患者中有两次抽取血液的尝试失败的情况下，需要获取根据临床护理标准抽取的剩余血液样品以用于本研究中完整的生物标志物分析。此血液抽取允许分析至多390个与创伤性脑损伤相关的基于血液的生物标志物。
表3最大可允许总抽血体积
除了初始体检外，送去手术室的那些患者经历病理标本分析，记录那些接受了licox的患者的脑组织氧合信息，且收集那些接受了脑室造瘘术导管的患者的csf以进行分析。为了分析csf，以抽取血液的相同间隔收集了5.0ml。根据照护标准进行射线照相研究。在筛选过程中进行的所有评估均未用其余数据进行分析，直到获得知情同意。如果患者最终未同意研究，则弃置样本和初始评估结果。
参与者出院后，获得患者的病历记录以获取有关临床过程的信息，包括在ed花费的时间、所用的任何手术或其它神经监测方法以及急性护理结果评估。如果患者在icu花费了时间，也从该时间段提取信息，所述信息包括moberg监护仪和每日治疗强度水平的数据。
创伤患者分为三组进行分析：仅脑损伤、仅非脑损伤和组合损伤。在这项研究中包括并从ed招募两个年龄和性别相匹配的对照组：非创伤和csf对照。非创伤对照是未经历任何创伤的那些，且该组很大程度上由因脑损伤而入院的患者的家属和朋友构成。两个对照组同意经历单一密集型评估，该评估包括抽血和认知评估、神经学评估以及生存质量评估(sac、nos-tbi、qolabi)。接受选择性脑室造瘘术或腰椎引流导管的患者(术前)同意成为csf对照组的一部分。从此对照组中患者的脑室造瘘术导管中收集5mlcsf，以与从研究组中接受脑室造瘘术导管作为其护理标准的一部分收集的csf进行比较。还向csf对照组提供参与和另外两个对照组相同的密集型评估的机会，该评估包括抽血和3tmri扫描。
随访：要求同意参加研究随访部分的所有患者都返回医院。在第2周、第4周、个月、第6个月和1年于tbi门诊诊所接诊返回的患者。如果他们在tbi门诊诊所没有安排的预约，就在那些时间点为其安排时间到脑损伤研究实验室(pl.610)。表9提供每次评估的时间线。以如上所述的相同方法在五个随访时间点中的每一个时间点进行抽血以用于生物标志物分析。在第3个月、第6个月和一年完成列于表10和11中的结果评估组。通过参与者的病例记录获得作为标准护理一部分的射线照相扫描，但选择也在其脑损伤之后第2周和第6个月经历3tmri扫描的同意的参与者和对照。每次mri检查花费大约一小时，并且包括以下脉冲序列：(1)矢状短tr定位器；(2)轴位fse；(3)轴位flair；(4)轴位swi；(5)轴位t2*成像。在患者不能到医院进行随访的情况下，在他们损伤之后三个月和一年通过电话与他们接触以完成btact，该btact为设计用于经由电话施用的15-20分钟认知评估。
表4结果时间线
表5结果评估-未最终化
表6可能的婴儿评估
*请求访问
统计分析规划.通过检查每名患者针对每种生物标志物的最大浓度抽取值，或距事故桶的时间或两者，来分析生物标志物数据。为解决确定血液中生物标志物浓度与临床神经学和磁共振成像数据之间的关联性的主要目的，采用多次分析。使用主成分分析检查哪些生物标志物可能解释相同的差异，或者生物标志物是否对差异作用极小。将生物标志物用于逻辑回归分析，且基于主成分分析的结果和临床输入，排除了一些生物标志物。将0.05的显著性水平用于逻辑回归分析。对于这组数据，roc分析还用于检查每种生物标志物在确定mri状态或神经测试结果方面的预测能力。
实施例2
dia-ms分析
对来自患有轻度tbi的个体和对照的49份血浆进行了使用数据独立采集(dia-ms)的基于发现的质谱法。这些样本中的十五(15)个来自没有已知创伤性脑损伤的健康患者。在其余的34个样本中，有33个样本来自经医生诊断为患有轻度创伤性脑损伤(mtbi)的患者，其余的样本是来自经医师诊断为患有重度创伤性脑损伤(stbi)的患者的血浆池。还获得了队列中每位患者的gcs评分，所有评分均在正常范围内(合并的严重tbi样本除外)。对受试者的子集执行ct扫描，并且包括来自ct阳性受试者的样本(请参见图1a)。用胰蛋白酶消化血浆样品以产生肽，其使用dia-ms分析(肽身份包括在下面)。包括所有可量化的肽和蛋白质。基于2种独特肽的gfap检测也被选择性地从数据中拉出并包括在图1中，图1中还包括使用免疫测定法(基于elisa的gfap测定法)独立评估的gfap水平。
上述方法用于鉴定tbi生物标志物的各种tbi类别和亚类。表7显示了与重度tbi相关的候选tbi生物标志物(与具有可检测gfap水平的stbi样本聚类在一起)。stbi组中samp下调(并在健康对照组中上调)，stbi组中cand1和glo2上调(并在健康对照组中下调)。仅在stbi组检测到erap1、syyc、c1rl和atpg，而在健康对照组中没有(即独特表达)。
表7
重度tbi的候选生物标志物
无监督分析。将无监督聚类分析应用于通过dia-ms获得的蛋白质组数据，以确定患者队列样本如何根据其分子蛋白质组概况进行聚类，而不受任何临床分组的偏见。该分析的无效假设是，蛋白质组学数据随机分散在所有样品中，没有任何与tbi的存在或严重程度有关的聚类模式。如图1a所示，聚类分析的对照分支(五个分组的最下部分组)成功地从tbi样本中识别出15个健康样本中的10个。最终，出现了四个额外的亚聚类，它们对应于轻度tbi的亚类。这些数据总结如下。
无监督聚类分析产生了5个聚类(图1a-1c)。这包括“健康”受试者(即对照组)的聚类，由指定为健康个体的原始十个样本组成。此外，这些数据和伴随的分析证明了轻度tbi的四个不同亚类的存在。为了清楚和区分起见，为这些聚类中的每个聚类分配了编号：tbi-1聚类＝轻度tbi亚类1；tbi-2聚类＝轻度tbi亚类2；tbi-3聚类＝轻度tbi亚类3；复合tbi聚类＝轻度tbi亚类4(也称为“复杂性轻度”tbi)。
“轻度tbi亚类1”(tbi-1)是指被分类为患有轻度tbi并且还表现出与对照(例如健康对照或尚未遭受tbi的对照)不同，与患有中度至重度tbi的受试者不同，并且与患有亚类2、3或4的轻度tbi的受试者不同的血浆蛋白质组表征的受试者。“轻度tbi亚类2”(tbi-2)是指被分类为患有轻度tbi并且还表现出与对照(例如健康对照或尚未遭受tbi的对照)不同，与患有中度至重度tbi的受试者不同，并且与患有亚类1、3或4的轻度tbi的受试者不同的血浆蛋白质组表征的受试者。“轻度tbi亚类3”(tbi-3)是指被分类为患有轻度tbi并且还表现出与对照(例如健康对照或尚未遭受tbi的对照)不同，与患有中度至重度tbi的受试者不同，并且与患有亚类1、2或4的轻度tbi的受试者不同的血浆蛋白质组表征的受试者。“轻度tbi亚类4”(复合tbi，在本文中也称为“复杂性轻度tbi”)是指被分类为患有轻度tbi并且还表现出与对照(例如健康对照或尚未遭受tbi的对照)不同，与患有中度至重度tbi的受试者不同，并且与患有亚类1、2或3的轻度tbi的受试者不同的血浆蛋白质组表征的受试者。此外，患有轻度tbi亚类4的受试者表现出与从患有重度tbi的受试者的合并样本中获得的蛋白质组表征相似的蛋白质组表征。在本文公开的数据中，轻度tbi亚类4聚类包含数量最多的具有升高gfap水平(根据基于elisa的gfap测定法和gfap质谱法)的受试者，以及仅有的ct扫描呈阳性的受试者。
在无监督聚类完成时，样品来源被取消鉴定，并且四个关键参数被分别包括在内并在图1a中示出。这些参数包括神经胶质生物标志物得分(阳性(灰色)(基于elisa的gfap测定)，阴性(缺失)，边界区域(白色)，不确定或缺乏信息(浅灰色))；ct扫描得分(正(灰色)，负(黑色)或未执行(浅灰色))；使用ms获得的gfap蛋白表达水平(最低(黑色)到最高(灰色)之间的数字连续体)；性别(男性(灰色)或女性(黑色))；以及年龄(20(黑色)至59(灰色)年之间的数字连续体)。
基于该分析，得出的结论是，作为疾病指征的tbi包括一系列损伤状态，这些损伤状态可根据tbi生物标志物特征进行描述和分类。鉴定出四个不同的聚类对应于轻度tbi的四个不同亚类(图1b-1c)。复合tbi聚类代表轻度tbi亚类中最严重的一个，因为该聚类包含重度tbi合并样本，仅有的ct扫描呈阳性的个体，最多数量的gfap生物标志物阳性样本(通过免疫测定法检测)和最多数量的gfap阳性样品(基于ms数据)。
对照聚类代表健康个体，因为它对所有临床和生化标志物均为阴性，并且仅包含来自没有已知tbi的患者的样品。该组用作所有后续分析的健康对照组。
tbi-1聚类代表轻度tbi的最不严重的亚类。该聚类包含一些指定的对照样品，以及ms检测到的gfap含量低但可检测水平的样品。另外，如图1b-1c中所示，无监督聚类分析导致确定了另外两个轻度tbi亚类：tbi-2聚类和tbi-3聚类。tbi-2和tbi-3分组均代表离散的聚类，这些聚类与tbi-1聚类(最不严重)和复合tbi聚类(最严重)两者均不同。
因此，这些数据和伴随的分析证明了轻度tbi的四个不同亚类的存在。
接下来，将这四个“非健康”亚聚类与“健康”聚类(对照)进行比较，并将此比较表示为log2[倍数变化]值。表8a和8b根据其log2[倍数变化]值分别包括十种差异最大调节的蛋白和十种最大上调的蛋白。
表8a
对照和mtbi亚类之间差异调节的tbi生物标志物
表8b
对照和mtbi亚类之间上调的tbi生物标志物
另外，为了区分每个疾病聚类，基于假定的类别或轻度tbi亚类的严重性进行了初步的分层分析。在不存在“健康”对照聚类的情况下，在“健康”聚类的每个组合之间进行相对的成对比较。这些数据总结在下面的表9中，作为每组中十个具有最大log2[倍数变化]值的蛋白质及其uniprotid。
然后评估数据以鉴定每个聚类独特的蛋白质，因为对于给定的tbi亚类，这些蛋白质可能被作为排他的候选tbi生物标志物包括在内(图2a-2c)。来自无监督聚类分析的五个主要样本亚聚类中的每个都包含至少五个独特表达的蛋白质。这些蛋白质可以包括在每个亚类中独特增加的蛋白质(表8和9)。图2a-2c包括基于无监督分析在样品聚类之间共享和独特的蛋白质。从无监督聚类分析得出的五个主要样本亚聚类中各自都有至少五个独特表达的蛋白质。图2a包括在五个确定亚组聚类之间具有共享和独特的蛋白质的维恩图；和图2b包括在每个亚组聚类中定量的总蛋白质和独特蛋白质的数值计数。图2c包括在每个亚组聚类中定量的独特蛋白质的uniprotid和简称。
监督分析。一旦完成盲的无监督分析，就根据样本来源患者的tbi状态对其进行身份识别。此附加信息使可以进行监督分析的多个轮次。
在该监督分析的第一轮中，将从tbi衍生样品中获得的所有蛋白质量与非tbi样品中获得的所有蛋白质量进行比较(基于患者特征)，并根据其差异表达的幅度对蛋白质进行排名。这是根据两个独立的标准完成的：1)根据其差异表达的幅度对蛋白质进行排名，而不考虑变化方向(上调和下调)；2)由于上调的蛋白质更适合作为生物标志物进行检测，因此根据其差异上调表达的幅度对蛋白质进行排名。这些是用于将轻度tbi与对照区分开的高概率tbi生物标志物候选物。这些数据总结在表10和图2a-2c中。
表10
tbi样品和健康对照之间的监督分析
图3a-3b包括在健康和tbi患者样品之间共享或独特的蛋白质的代表性维恩图。该分析仅包括在每组的所有样品中检测到的蛋白质(图3a)。图3b列出了在所有tbi样品中独特表达的8种蛋白质，包括其uniprotid和蛋白质名称。al9a1和sytc在大脑中表达，而fa5与凝血相关(两者均是基于uniprot(uniprot.org)的注释信息)。与15个健康对照组样本相比，这些蛋白在所有34种tbi样品(所有1-3亚类(tbi-1、tbi-2、tbi-3)和更严重的轻度tbi亚类4(复杂性tbi))中均显示出增加或独特的表达(参见图1和2)。图3a-3b代表了高概率分组，并且其中一些蛋白质是来自监督和无监督模型的蛋白质组的一部分。
另外，下面的表11提供了更多整体方法来确定受试者的tbi，例如重度tbi、轻度tbi或不存在tbi。表11包括使用差异模型在所有tbi类型中发现的蛋白质。
表11
通常发现的tbi生物标志物
bootstrap森林分析。在监督分析的另一轮次中，进行了bootstrap森林分析，作为对定量dia-ms数据进行传统监督分析的替代方法。该分析根据蛋白质的整体组成部分对蛋白质进行排名，并汇总在表12中。
表12
tbi样品和健康对照的bootstrap森林分析
除了通过bootstrap森林分析总结整个数据集外，还评估了各个蛋白质的贡献。如图4a-4e所示，该方法被概括为满足预测模型的标准的总共五个单独的决策树。该分析归因于给定蛋白质作为能够将tbi患者与健康同伴区别开来的生物标志物的能力的定量界限，以及相关的诊断概率。在单个蛋白质不足以进行区分的情况下，将识别并定义多种蛋白质的组合。
实施例3
tbi生物标志物蛋白质和肽片段
质谱技术通常涉及在质谱仪中检测已经历物理变化的离子。通常，物理变化涉及将选定的前驱物离子裂解并记录所得裂解离子的质谱。碎片离子质谱图中的信息通常有助于阐明前体离子的结构。用于获得质谱/质谱(ms/ms或ms2)光谱的一般方法是使用合适的m/z分析仪分离选定的前驱体离子，使该前驱体离子与中性气体发生高能碰撞，以便诱导解离，最后对碎片离子进行质量分析以生成质谱图。
基于本公开的本领域普通技术人员将认识到，用于dia-ms(或dda-ms)的此类肽片段可用于鉴定蛋白质/生物标志物。更具体地，下表包括在此识别和描述的各种tbi生物标志物的uniprotid号和简称，与它们相应的肽片段序列一起列出。
除dia-ms外，dda-ms和srm/mrm-ms还可用于各种肽分析物的可靠和全面定量。srm/mrm-ms通常在三重四极杆状仪器上进行，其中通过碰撞诱导的离解可提高选择性。这是一种非扫描质谱技术，其中两个质量分析器(q1和q3)用作静态质量过滤器，以监视选定前体的特定片段。在三重四极杆仪器上，可以使用各种电离方法，包括但不限于电喷雾电离、化学电离、电子电离、大气压化学电离和基质辅助激光解吸电离。与所选的前体离子和碎片离子相关的特定对质量荷电(m/z)值称为“跃迁”。该检测器充当与所选跃迁匹配的离子的计数设备，从而返回强度随时间的分布。mrm-ms是在同一实验中，通过在不同的前体/片段对之间快速切换，在色谱时间尺度上测量多个srm-ms跃迁的情况。通常，三重四极杆仪器循环进行一系列跃迁，并记录每个跃迁的信号随洗脱时间的变化。该方法通过监控给定分析物的多个跃迁的色谱共洗脱，实现了额外的选择性。表13-21列出了针对本公开中概述的不同分类的潜在肽。
另外，可以使用prm-ms，其中使用高分辨率质谱仪在一次分析中并行检测所有跃迁。prm-ms提供高选择性、高敏感性和高通量来定量选择的肽(q1)，从而定量蛋白质(ms1)。同样，可以为每种蛋白质专门选择多个肽。prm-ms方法使用质谱仪的四极杆分离目标前体离子，在碰撞池中将目标前体离子片段化，并然后在orbitrap质谱仪中检测生成的产物离子。prm-ms使用四极杆飞行时间(qtof)或混合四极杆orbitrap(qorbitrap)质谱仪进行肽/蛋白质定量。表13-21列出了针对本公开中概述的不同分类的潜在肽。
在一些实施方式中，本文描述的方法可以应用于定量生物样品中的多肽或蛋白质。包括任何种类的多肽或蛋白质的生物样品都可以作为起点并通过本文的方法进行分析。实际上，任何包含蛋白质/肽的样品都可用于此处产生的方法(例如组织、细胞)并进行分析。本文的方法也可以与通过消化获得的肽混合物一起使用。多肽或蛋白质的消化包括任何种类的裂解策略，例如酶、化学、物理或其组合。根据一些实施方式，确定本文提供方法的以下参数：胰蛋白酶(或其他蛋白酶)消化和肽清除、最佳应答多肽、最佳应答蛋白、最佳应答肽、最佳应答片段、片段强度比(增加高和可重现的峰强度)、最佳碰撞能量和所有最佳参数，以使方法的敏感性和/或特异性最大化。
在其他实施方式中，需要多肽和/或相应蛋白质的定量或相应蛋白质的活性/调节。所选肽用稳定同位素标记，并用作内标(sil)以实现目标蛋白质的绝对定量。将标签的定量稳定标记的肽类似物添加到已知量的肽样品中；然后通过质谱法对标签和目标肽进行定量，并获得蛋白质内源性水平的绝对定量。
表13
纳入的tbi生物标志物–独特
表14
纳入的tbi生物标志物–监督分析
表15
纳入的tbi生物标志物–无监督分析
表16
纳入的tbi生物标志物–bootstrapping分析
表17
纳入的轻度tbi生物标志物–独特
表18
纳入的轻度tbi生物标志物–监督分析
表19
纳入的轻度tbi生物标志物–无监督分析
表20
纳入的重度tbi生物标志物
表21
排除的tbi生物标志物
应理解先前详细描述和随附实施例仅是说明性的，并且不应视为对本公开的范围的限制，所述范围仅由随附权利要求及其等效物限定。
所公开的实施方式的各种改变和修改对本领域技术人员是显而易见的。在不偏离其本质和范围的前提下，可以进行与包括但不限于本公开的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂和/或使用方法有关的这类改变和修改。
出于完整性的原因，在以下编号条款中列出本公开的各个方面：
条款1、一种测量或检测至少一种生物标志物的方法，所述方法包括：测试从受试者获得的样品；以及测量或检测所述样品中选自由al9a1、atpg、c1rl、cand1、epipl、glo2、igha2、pzp、sytc、syyc或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段；和/或测量或检测所述样品中选自abheb、al9a1、dnm1l、fcn2、inf2、k22e、m3k5、ncor1、sbsn、syep、tpp2或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受或可能已遭受创伤性脑损伤(tbi)。
条款2、根据条款1的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由al9a1、atpg、c1rl、epipl、igha2、pzp、sytc、syyc或其任何组合组成的组；并且其中所述至少一种生物标志物在从健康受试者获得的样品中检测不到。
条款3、根据条款1或条款2的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由atpg、c1rl、syyc或其任何组合组成的组。
条款4、根据条款1的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由cand1、glo2或其组合组成的组，其中cand1和glo2水平相比于从健康受试者获得的样品中的cand1和glo2水平更高。
条款5、根据条款1的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由abheb、al9a1、dnm1l或其组合组成的组；其中abheb水平相比于从健康受试者获得的样品中的abheb水平更高；和/或其中al9a1和dnm1l水平相比于从健康受试者获得的样品中的al9a1和dnm1l水平更低。
条款6、根据条款1的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由m3k5、sbsn、syep或其组合组成的组；并且其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受或可能已遭受轻度tbi。
条款7、根据条款1或条款6的方法，其中sbsn和syep水平相比于从健康受试者获得的样品中的sbsn和syep水平更高；和/或其中m3k5水平相比于从健康受试者获得的样品中的m3k5水平更低。
条款8、根据条款1的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由inf2、syep或其组合组成的组。
条款9、根据条款1的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段进一步包含选自由anxa6、erap1、ezri、fa5、g6pi、mylk、samp或其组合组成的组中的至少一种生物标志物。
条款10、一种测量或检测至少一种生物标志物的方法，所述方法包括：测试从受试者获得的样品；以及测量或检测所述样品中选自由1433g、ack1、acy1、aka12、argi1、cadh5、clh1、copg2、dpod2、dsg2、hv307、iqga2、k1c14、k1c19、kv105、lamc1、mdhm、nqo2、perm、plst、pncb、ptprc、sept7、syrc、trxr2、txnl1、uggg1、wdr1或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受或可能已遭受轻度创伤性脑损伤(mtbi)。
条款11、根据条款10的方法，其中所述至少一种生物标志物在从健康受试者获得的样品中检测不到。
条款12、根据条款10的方法，其中所述至少一种生物标志物在从已遭受重度tbi(stbi)的受试者获得的样品中检测不到。
条款13、根据条款10至12中任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由所述样品中的ack1、acy1、plst、pncb、ptprc、uggg1或其任何组合组成的组；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受或可能已遭受亚类1的mtbi。
条款14、根据条款10至12中任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由所述样品中的aka12、hv307、perm、kv105、nqo2、sept7、syrc、trxr2或其任何组合组成的组；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受或可能已遭受亚类2的mtbi。
条款15、根据条款10至12中任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由所述样品中的1433b、argi1、cadh5、clh1、copg2、dpod2、dsg2、iqga2、k1c14、lamc1、mdhm、txnl1或其任何组合组成的组；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受或可能已遭受亚类3的mtbi。
条款16、根据条款10的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段进一步包含选自由ahnk、al1a1、ampn、capzb、catd、clip2、cmga、fscn1、gmpr2、grp78、gsh1、idhc、k1c20、krr1、mbl2、ntf2、pcbp2、pgk1、saa1、tfr1或其组合组成的组中的至少一种生物标志物。
条款17、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，所述组包括以下生物标志物中的至少一种：tpp2、cand1、ncor1、k22e、al9a1、abheb、dnm1l、inf2或其任何组合；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受或可能已遭受亚类4的轻度tbi。
条款18、根据条款17的生物标志物组，其中cand1、ncor1、k22e、abheb和dnm1l水平相比于从健康受试者获得的样品中的cand1、ncor1、k22e、abheb和dnm1l水平更高；和/或其中tpp2、al9a1和inf2水平相比于从健康受试者获得的样品中的tpp2、al9a1和inf2水平更低。
条款19、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，所述组包括以下生物标志物中的至少一种：tpp2、ncor1、hv103、inf2、ighd、ck054、m3k5、abheb、al9a1、dnm1l或其任何组合；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受或可能已遭受亚类3的轻度tbi。
条款20、根据条款19的生物标志物组，其中ncor1、hv103、ighd、abheb和dnm1l水平相比于从健康受试者获得的样品中的ncor1、hv103、ighd、abheb和dnm1l的水平更高；和/或其中tpp2、ighd、ck054、m3k5和al9a1水平相比于从健康受试者获得的样品中tpp2、ighd、ck054、m3k5和al9a1水平更低。
条款21、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，所述组包括以下生物标志物中的至少一种：ncor1、tpp2、k22e、abheb、inf2、sbsn、al9a1、ma2b2或其任何组合；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受或可能已遭受亚类2的轻度tbi。
条款22、根据条款21的生物标志物组，其中ncor1、k22e、abheb和sbsn水平相比于从健康受试者获得的样品中的ncor1、k22e、abheb和sbsn水平更高；和/或其中tpp2、inf2、al9a1和ma2b2水平相比于从健康受试者获得的样品中的tpp2、inf2、al9a1和ma2b2水平更低。
条款23、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，所述组包括以下生物标志物中的至少一种：k22e、dnm1l、diap1、abheb、plod1、syep、kv133、al9a1、ephb4或其任何组合；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受或可能已遭受亚类1的轻度tbi。
条款24、根据条款23的生物标志物组，其中k22e、dnm1l、diap1、abheb、plod1、syep和ephb4水平相比于从健康受试者获得的样品中的k22e、dnm1l、diap1、abheb、plod1、syep和ephb4水平更高；和/或其中kv133和al9a1水平相比于从健康受试者获得的样品中的kv133和al9a1水平更低。
条款25、根据条款1的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段进一步包含选自由mylk、samp或其组合组成的组中的至少一种生物标志物。
条款26、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，所述组包括以下生物标志物中的至少一种：cand1、ncor1、k22e、abheb、dnm1l、sbsn、glo2、syep或其任何组合；其中与健康受试者中至少一种生物标志物的水平相比，测量或检测到所述受试者中所述至少一种生物标志物的水平更高表明所述受试者已遭受或可能已遭受亚类4的轻度tbi。
条款27、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，所述组包含以下生物标志物中的至少一种：ncor1、hv103、ighd、abheb、dnm1l、albu、thim、igha2、kv139和/或其任何组合；其中与健康受试者中至少一种生物标志物的水平相比，测量或检测到所述受试者中所述至少一种生物标志物的水平更高表明所述受试者已遭受或可能已遭受亚类3的轻度tbi。
条款28、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状况的生物标志物组，所述组包括以下生物标志物中的至少一种：ncor1、k22e、abheb、sbsn、dnm1l、diap1、dyl1、psa、ephb4或其任何组合；其中与健康受试者中至少一种生物标志物的水平相比，测量或检测到所述受试者中所述至少一种生物标志物的水平更高表明所述受试者已遭受或可能已遭受亚类2的轻度tbi。
条款29、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，所述组包括以下生物标志物中的至少一种：k22e、dnm1l、diap1、abheb、plod1、syep、ephb4、fbln3或其任何组合；其中与健康受试者中至少一种生物标志物的水平相比，测量或检测到所述受试者中所述至少一种生物标志物的水平更高表明所述受试者已遭受或可能已遭受亚类1的轻度tbi。
条款30、根据条款10的方法，其中至少一种生物标志物或其片段进一步包含选自由anxa6、masp2、mylk、samp或其组合组成的组中的至少一种生物标志物。
条款31、一种用于确定受试者未遭受创伤性脑损伤(tbi)的生物标志物组，所述组包括以下生物标志物中的至少一种：actbl、aldh2、anxa5、camp、cpne3，crac1、cytc、dnpep、eif3i、gshb、icam1、hv323、hnrpd、kvd33、fa9、fhr4、frpd1、hs90b、ma2a1、pcyox、pnph、proc、rl3、sh3l3、srrm2、tbb1、tena、trap1或其任何组合；其中所述受试者中的至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者尚未遭受tbi。
条款32、一种测量或检测至少一种生物标志物的方法，所述方法包括：从实际或疑似头部损伤后的受试者获取样品；以及测量或检测所述样品中选自由al9a1、atpg、c1rl、cand1、epipl、glo2、igha2、pzp、sytc、syyc或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段；和/或测量或检测所述样品中选自由abheb、al9a1、dnm1l、fcn2、inf2、k22e、m3k5、ncor1、sbsn、syep、tpp2或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段。
条款33、根据条款32的方法，其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受创伤性脑损伤(tbi)。
条款34、根据条款32或条款33的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由al9a1、atpg、c1rl、epipl、igha2、pzp、sytc、syyc或其任何组合组成的组；并且其中所述至少一种生物标志物在从健康受试者获得的样品中检测不到。
条款35、根据条款32至34中任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由atpg、clrl、syyc或其任何组合组成的组。
条款36、根据条款32或条款33的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由cand1、glo2或其组合组成的组；并且其中cand1和glo2水平相比于从健康受试者获得的样品中的cand1和glo2水平更高。
条款37、根据条款32或条款33的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由abheb、al9a1、dnm1l或其组合组成的组；其中abheb水平相比于从健康受试者获得的样品中的abheb水平更高；和/或其中al9a1和dnm1l水平相比于从健康受试者获得的样品中的al9a1和dnm1l水平更低。
条款38、根据条款32或条款33的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由m3k5、sbsn、syep或其组合组成的组；其中sbsn和syep水平相比于从健康受试者获得的样品中的sbsn和syep水平更高；和/或其中m3k5水平相比于从健康受试者获得的样品中的m3k5水平更低。
条款39、根据条款32或条款33的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由inf2、syep或其组合组成的组。
条款40、根据条款32至39中任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段进一步包含选自由anxa6、erap1、ezri、fa5、g6pi、mylk、samp或其组合组成的组中的至少一种生物标志物。
条款41、根据条款32至39中任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段进一步包含选自由mylk、samp或其组合组成的组中的至少一种生物标志物。
条款42、一种测量或检测至少一种生物标志物的方法，所述方法包括：从实际或疑似头部损伤后的受试者获得样品；以及测量或检测所述样品中选自由1433g、ack1、acy1、aka12、argi1、cadh5、clh1、copg2、dpod2、dsg2、hv307、iqga2、k1c14、k1c19、kv105、lamc1、mdhm、nqo2、perm、plst、pncb、ptprc、sept7、syrc、trxr2、txnl1、uggg1、wdr1或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段。
条款43、根据条款42的方法，其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受创伤性脑损伤(tbi)。
条款44、根据条款42或条款43的方法，其中所述至少一种生物标志物在从健康受试者获得的样品中检测不到。
条款45、根据条款42至44中任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物在从已遭受重度tbi的受试者获得的样品中检测不到。
条款46、根据条款42至44中任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由所述样品中的ack1、acy1、plst、pncb、ptprc、uggg1或其任何组合组成的组；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受亚类1的轻度tbi。
条款47、根据条款42至44中任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由所述样品中的aka12、hv307、perm、kv105、nqo2、sept7、syrc、trxr2或其任何组合组成的组；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受亚类2的轻度tbi。
条款48、根据条款42至44中任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段选自由所述样品中的1433b、argi1、cadh5、clh1、copg2、dpod2、dsg2、iqga2、k1c14、lamc1、mdhm、txnl1或其任何组合组成的组；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受亚类3的轻度tbi。
条款49、根据条款42至48中任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段进一步包含选自由ahnk、al1a1、ampn、capzb、catd、clip2、cmga、fscn1、gmpr2、grp78、gsh1、idhc、k1c20、krr1、mbl2、ntf2、pcbp2、pgk1、saa1、tfr1或其组合组成的组中的至少一种生物标志物。
条款50、根据条款42至48中任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物或其片段进一步包含选自由anxa6、masp2、mylk、samp或其组合组成的组中的至少一种生物标志物。
条款51、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，所述组包括以下生物标志物中的至少一种：tpp2、cand1、ncor1、k22e、al9a1、abheb、dnm1l、inf2或其任何组合；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受亚类4的轻度tbi。
条款52、根据条款51的生物标志物组，其中cand1、ncor1、k22e、abheb和dnm1l水平相比于从健康受试者获得的样品中的cand1、ncor1、k22e、abheb和dnm1l水平更高；和/或其中tpp2、al9a1和inf2水平相比于从健康受试者获得的样品中的tpp2、al9a1和inf2水平更低。
条款53、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，所述组包括以下生物标志物中的至少一种：tpp2、ncor1、hv103、inf2、ighd、ck054、m3k5、abheb、al9a1、dnm1l或其任何组合；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受亚类3的轻度tbi。
条款54、根据条款53的生物标志物组，其中ncor1、hv103、ighd、abheb和dnm1l水平相比于从健康受试者获得的样品中的ncor1、hv103、ighd、abheb和dnm1l的水平更高；和/或其中tpp2、ighd、ck054、m3k5和al9a1水平相比于从健康受试者获得的样品中tpp2、ighd、ck054、m3k5和al9a1水平更低。
条款55、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，所述组包含以下生物标志物中的至少一种：ncor1、tpp2、k22e、abheb、inf2、sbsn、al9a1、ma2b2或其任何组合；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受亚类2的轻度tbi。
条款56、根据条款55的生物标志物组，其中ncor1、k22e、abheb和sbsn水平相比于从健康受试者获得的样品中的ncor1、k22e、abheb和sbsn水平更高；和/或其中tpp2、inf2、al9a1和ma2b2水平相比于从健康受试者获得的样品中的tpp2、inf2、al9a1和ma2b2水平更低。
条款57、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，所述组包括以下生物标志物中的至少一种：k22e、dnm1l、diap1、abheb、plod1、syep、kv133、al9a1、ephb4或其任何组合；其中所述至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者已遭受亚类1的轻度tbi。
条款58、根据条款57的生物标志物，其中k22e、dnm1l、diap1、abheb、plod1、syep和ephb4水平相比于从健康受试者获得的样品中的k22e、dnm1l、diap1、abheb、plod1、syep和ephb4水平更高；和/或其中kv133和al9a1水平相比于从健康受试者获得的样品中的kv133和al9a1水平更低。
条款59、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，所述组包括以下生物标志物中的至少一种：cand1、ncor1、k22e、abheb、dnm1l、sbsn、glo2、syep或其任何组合；其中与健康受试者中至少一种生物标志物的水平相比，测量或检测到所述受试者中所述至少一种生物标志物的水平更高表明所述受试者已遭受亚类4的轻度tbi。
条款60、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，所述组包括以下生物标志物中的至少一种：ncor1、hv103、ighd、abheb、dnm1l、albu、thim、igha2、kv139和/或其任何组合；其中与健康受试者中至少一种生物标志物的水平相比，测量或检测到所述受试者中所述至少一种生物标志物的水平更高表明所述受试者已遭受亚类3的轻度tbi。
条款61、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，所述组包括以下生物标志物中的至少一种：ncor1、k22e、abheb、sbsn、dnm1l、diap1、dyl1、psa、ephb4或其任何组合；其中与健康受试者中至少一种生物标志物的水平相比，测量或检测到所述受试者中所述至少一种生物标志物的水平更高表明所述受试者已遭受亚类2的轻度tbi。
条款62、一种用于确定受试者的创伤性脑损伤(tbi)状态的生物标志物组，该组包括以下生物标志物中的至少一种：k22e、dnm1l、diap1、abheb、plod1、syep、ephb4、fbln3或其任何组合；其中与健康受试者中至少一种生物标志物的水平相比，测量或检测到所述受试者中所述至少一种生物标志物的水平更高表明所述受试者已遭受亚类1的轻度tbi。
条款63、一种用于确定受试者未遭受创伤性脑损伤(tbi)的生物标志物组，所述组包括以下生物标志物中的至少一种：actbl、aldh2、anxa5、camp、cpne3，crac1、cytc、dnpep、eif3i、gshb、icam1、hv323、hnrpd、kvd33、fa9、fhr4、frpd1、hs90b、ma2a1、pcyox、pnph、proc、rl3、sh3l3、srrm2、tbb1、tena、trap1或其任何组合；其中所述受试者中的至少一种生物标志物的测量或检测表明所述受试者尚未遭受tbi。
条款64、一种测量或检测至少一种生物标志物的方法，所述方法包括：从实际或疑似头部损伤后的受试者获得样品；以及测量或检测所述样品中选自由pzp、epipl、igha2、al9a1、g6pi、sytc、ezri、fa5或其组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段的至少一种肽；其中所述至少一种生物标志物的至少一种肽选自由seqidno：4-260组成的组。
条款65、选自由seqidno：4-260组成的组中的至少一种肽在分离或鉴定选自由pzp、epipl、igha2、al9a1、g6pi、sytc、ezri、fa5或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段中的用途。
条款66、一种测量或检测至少一种生物标志物的方法，所述方法包括：从实际或疑似头部损伤后的受试者获得样品；以及测量或检测所述样品中选自由ncor1、abheb、anxa6、dnm1l、fcn2、hba、mylk、sbsn、ahnk、k22e或其组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段的至少一种肽；其中所述至少一种生物标志物的至少一种肽选自由seqidno：261-698组成的组。
条款67、选自由seqidno：261-698组成的组中的至少一种肽在分离或鉴定选自由ncor1、abheb、anxa6、dnm1l、fcn2、hba、mylk、sbsn、ahnk、k22e或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段中的用途。
条款68、一种测量或检测至少一种生物标志物的方法，所述方法包括：从实际或疑似头部损伤后的受试者获取样品；以及测量或检测所述样品中选自由cand1、syep、glo2、diap1、dyl1、psa、ephb4、plod1、fbln3、hv103、ighd、thim、igha2、kv105、masp2或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段的至少一种肽；其中所述至少一种生物标志物的至少一种肽选自由seqidno：699-926组成的组。
条款69、选自由seqidno：699-926组成的组中的至少一种肽在分离或鉴定选自cand1、syep、glo2、diap1、dyl1、psa、ephb4、plod1、fbln3、hv103、ighd、thim、igha2、kv105、masp2或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段中的用途。
条款70、一种测量或检测至少一种生物标志物的方法，所述方法包括：从实际或疑似头部损伤后的受试者获取样品；以及测量或检测所述样品中选自由samp、1433b、fibb、rs28、trfe或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段的至少一种肽；其中所述至少一种生物标志物的至少一种肽选自由seqidno：927-968组成的组。
条款71、选自由seqidno：927-968组成的组中的至少一种肽在分离或鉴定选自由samp、1433b、fibb、rs28、trfe或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段中的用途。
条款72、一种测量或检测至少一种生物标志物的方法，所述方法包括：从实际或疑似头部损伤后的受试者获得样品；以及测量或检测所述样品中选自由dyl1、fbln3、psa、hv103、ighd或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段的至少一种肽；其中所述至少一种生物标志物的至少一种肽选自由seqidno：969-996组成的组。
条款73、选自由seqidno：969-996组成的组中的至少一种肽在分离或鉴定选自由dyl1、fbln3、psa、hv103、ighd或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段中的用途。
条款74、一种测量或检测至少一种生物标志物的方法，所述方法包括：从实际或疑似头部损伤后的受试者获得样品；以及测量或检测所述样品中选自由fcn2、hba、ahnk或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段的至少一种肽；其中所述至少一种生物标志物的至少一种肽选自由seqidno：997-1182组成的组。
条款75、选自由seqidno：997-1182组成的组中的至少一种肽在分离或鉴定选自由fcn2、hba、ahnk或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段中的用途。
条款76、一种测量或检测至少一种生物标志物的方法，所述方法包括：从实际或疑似头部损伤后的受试者获取样品；以及测量或检测所述样品中选自由hv103、ighd、thim、igha2、kv105、masp2、diap1、plod1、ephb4、fbln3、dyl1、psa或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段的至少一种肽，其中所述至少一种生物标志物的至少一种肽选自由seqidno：1183-1319组成的组。
条款77、选自由seqidno：1183-1319组成的组中的至少一种肽在分离或鉴定选自由hv103、ighd、thim、igha2、kv105、masp2、diap1、plod1、ephb4、fbln3、dyl1、psa或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段中的用途。
条款78、一种测量或检测至少一种生物标志物的方法，所述方法包括：从实际或疑似头部损伤后的受试者获得样品；以及测量或检测所述样品中选自由cand1、glo2、erap1、syyc、c1rl、atpg或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段的至少一种肽；其中所述至少一种生物标志物的至少一种肽选自由seqidno：1320-1438组成的组。
条款79、选自由seqidno：1320-1438组成的组的至少一种肽在分离或鉴定选自由cand1、glo2、erap1、syyc、c1rl、atpg或其任何组合组成的组中的至少一种生物标志物或其片段中的用途。
条款80、一种测量或检测至少一种生物标志物的方法，所述方法包括：从实际或疑似头部损伤后的受试者获得样品；以及测量或检测所述样品中选自由actbl、aldh2、anxa5、camp、cpne3，crac1、cytc、dnpep、eif3i、gshb、icam1、hv323、hnrpd、kvd33、fa9、fhr4、frpd1、hs90b、ma2a1、pcyox、pnph、proc、rl3、sh3l3、srrm2、tbb1、tena、trap1或其任何组合组成的组中至少一种生物标志物或其片段的至少一种肽；其中所述至少一种生物标志物的至少一种肽选自由seqidno：1439-1923组成的组。
条款81、选自由seqidno：1439-1923组成的组中的至少一种肽在分离或鉴定选自由actbl、aldh2、anxa5、camp、cpne3，crac1、cytc、dnpep、eif3i、gshb、icam1、hv323、hnrpd、kvd33、fa9、fhr4、frpd1、hs90b、ma2a1、pcyox、pnph、proc、rl3、sh3l3、srrm2、tbb1、tena、trap1或其任何组合组成的组中至少一种生物标志物或其片段中的用途。
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