用于测定生物试样中的分析对象物浓度的方法、试剂和芯片与流程

本发明涉及用于测定生物试样(例如血液样品)中含有的葡萄糖等分析对象物的浓度的方法、试剂和芯片。

背景技术：

一直以来，已知有在临床化学检查中通过电化学方法、光学方法(比色法)测定血液或尿等生物试样中包含的分析对象物(例如葡萄糖)的技术。

例如，在日本特开2008-148656号公报中记载了一种涉及干式分析元件的发明，该干式分析元件由点涂试样的一侧的面的细孔的尺寸大于检测显色的一侧的面的细孔的尺寸的各向异性膜构成，用于测定血液中的葡萄糖等。

技术实现要素：

在日本特开2008-148656号公报记载的发明中，使用了在点涂试样的一侧的面具有孔径大的孔、在检测显色的一侧的面具有孔径小的孔的各向异性膜。由此，来自血液的成分中像红细胞这样的尺寸大的成分无法到达检测各向异性膜的显色的一侧而被滤出。因此，日本特开2008-148656号公报所记载的发明中，在不存在像红细胞这样的尺寸大的成分的条件下进行显色反应。然而，在使用这样的各向异性膜的情况下，存在因来自试样的成分、杂质等导致细孔堵塞的可能性，由此可能影响测定精度。另外，从测定的迅速性的观点考虑，需要这样的来自血液样品的成分的分级的方法有时并不充分。

另一方面，已知如果不进行来自血液样品的成分的分级而通过光学方法进行分析对象物的测定，则基线变高(即，噪声变强)，难以进行高精度的测定。

因此，本发明是鉴于上述情况而进行的，其目的在于提供一种能够在不需要来自血液等生物试样的成分(生物成分)的分级的情况下高精度地测定分析对象物浓度的方法。

本发明人等为了解决上述的问题进行了深入研究。其结果，发现通过使用利用散射光调节剂使生物试样和显色试剂混合前后的散射光实质上相同的分析样品测定分析对象物的浓度，能够解决上述课题，从而完成了本发明。

本发明的第1方面涉及一种测定生物试样中的分析对象物浓度的方法，包括如下工序：

(1)准备上述生物试样，

(2)在上述生物试样中混合显色试剂、氧化还原酶和散射光调节剂，得到散射光与上述生物试样实质上相同的分析样品，

(3)使用上述分析样品测定上述分析对象物浓度。

本发明的第2方面涉及一种分析对象物浓度测定试剂，含有显色试剂、氧化还原酶和散射光调节剂。

本发明的第3方面涉及一种用于测定生物试样中的分析对象物浓度的芯片，具有反应部，上述反应部含有显色试剂、氧化还原酶和散射光调节剂。

附图说明

图1是表示相对于血细胞比容值为20和血中葡萄糖浓度为0mg/dl(bg0)、100mg/dl(bg100)和400mg/dl(bg400)的血液样品的实施例1的试剂在500～1000nm的波长范围的透射率(％t)的图。

图2是表示相对于血细胞比容值为40和血中葡萄糖浓度为0mg/dl(bg0)、100mg/dl(bg100)和400mg/dl(bg400)的血液样品的实施例1的试剂在500～1000nm的波长范围的透射率(％t)的图。

图3是表示相对于血细胞比容值为60和血中葡萄糖浓度为0mg/dl(bg0)、100mg/dl(bg100)和400mg/dl(bg400)的血液样品的实施例1的试剂在500～1000nm的波长范围的透射率(％t)的图。

图4是表示相对于血细胞比容值为20和血中葡萄糖浓度为0mg/dl(bg0)、100mg/dl(bg100)和400mg/dl(bg400)的血液样品的比较例1的试剂在500～1000nm的波长范围的透射率(％t)的图。

图5是表示相对于血细胞比容值为40和血中葡萄糖浓度为0mg/dl(bg0)、100mg/dl(bg100)和400mg/dl(bg400)的血液样品的比较例1的试剂在500～1000nm的波长范围的透射率(％t)的图。

图6是表示相对于血细胞比容值为60和血中葡萄糖浓度为0mg/dl(bg0)、100mg/dl(bg100)和400mg/dl(bg400)的血液样品的比较例1的试剂在500～1000nm的波长范围的透射率(％t)的图。

图7是示意性地表示安装有本方式涉及的测定用芯片的血糖仪(成分测定装置)的俯视图。图7中，10表示血糖仪，12表示测定用芯片，14表示测定部，18表示芯片主体部，40表示壳体，42表示控制部，44表示箱体部，46表示测光部，48表示电源按钮，50表示操作按钮，52表示显示器，以及54表示弹出杆。

图8是将图7的测定用芯片和装置主体的测光部放大表示的立体图。图8中，10表示血糖仪，12表示测定用芯片，14表示测定部，16表示装置主体，18表示芯片主体部，20表示空洞部，20a表示前端口部，20b表示基端口部，22表示长边，24表示短边，30表示板片，32表示隔离件，40表示壳体，46表示测光部，56表示弹出针，56a表示棒部，56b表示接受部，58表示插入孔，58a表示插入开口部，59表示测定用孔部，60表示芯片安装部，60a表示凸缘部，62表示壁部，68表示发光元件，70表示发光部，72表示受光元件，74表示受光部，以及76表示螺旋弹簧。

图9是表示图7的测定用芯片的侧视图。图9中，12表示测定用芯片，18表示芯片主体部，20表示空洞部，20a表示前端口部，20b表示基端口部，22表示长边，22a表示上侧长边，22b表示下侧长边，24表示短边，24a表示前端边，24b表示基端边，26表示试剂，28表示测定对象部，30表示板片，以及32表示隔离件。

图10a是表示图7的测定用芯片和装置主体的安装动作的第1俯视图。图10a中，12表示测定用芯片，14表示测定部，16表示装置主体，20表示空洞部，26表示试剂，28表示测定对象部，30表示板片，32表示隔离件，40表示壳体，46表示测光部，46a表示固定壁，56表示弹出针，56a表示棒部，56b表示接受部，58表示插入孔，58a表示插入开口部，59表示测定用孔部，60表示芯片安装部，60a表示凸缘部，62表示壁部，64表示元件收容空间，66表示导光部，68表示发光元件，68a表示第1发光元件，68b表示第2发光元件，70表示发光部，72表示受光元件，74表示受光部，以及76表示螺旋弹簧。

图10b是表示接着图10a的安装动作的第2俯视截面图。图10b中，12表示测定用芯片，14表示测定部，16表示装置主体，20表示空洞部，20a表示前端口部，26表示试剂，30表示板片，32表示隔离件，40表示壳体，46表示测光部，46a表示固定壁，56表示弹出针，56a表示棒部，56b表示接受部，60表示芯片安装部，60a表示凸缘部，62表示壁部，68表示发光元件，68a表示第1发光元件，68b表示第2发光元件，70表示发光部，72表示受光元件，74表示受光部，以及76表示螺旋弹簧。

图11a是实施例和比较例中使用的血糖仪传感器的示意图。图11a中，2表示试剂片，3表示试剂涂布面，4表示双面胶带，5表示pet膜，6表示流路，以及7表示pet膜。

图11b是用于说明图11a的血糖仪传感器的内表面的长度、宽度、厚度的图。图11b中，1表示测定芯片，2表示试剂片，3表示试剂涂布面，4表示双面胶带，5表示pet膜，以及7表示pet膜。

具体实施方式

本发明的第1方面涉及一种测定生物试样中的分析对象物浓度的方法，包括如下工序：

(1)准备上述生物试样，

(2)在上述生物试样中混合显色试剂、氧化还原酶和散射光调节剂，得到散射光与上述生物试样实质上相同的分析样品，

(3)使用上述分析样品测定上述分析对象物浓度。

本发明的第2方面涉及一种分析对象物浓度测定试剂，含有显色试剂、氧化还原酶和散射光调节剂。

本发明的第3方面涉及一种用于测定生物试样中的分析对象物浓度的芯片，具有反应部，上述反应部含有显色试剂、氧化还原酶和散射光调节剂。

本说明书中，关于上述的本发明的某一方面的记载可与其它方面相互适当地改变而应用。

根据本发明，能够在不需要来自血液等生物试样的成分(生物成分)的分级的情况下高精度地测定分析对象物浓度。本发明人等对不进行来自生物试样(例如，血液样品)的生物成分的分级而通过光学方法进行分析对象物的测定时基线变高使测定精度劣化的原因进行了各种研究。例如，本发明人等发现生物试样为血液样品时，如果不进行来自血液样品的成分的分级而通过光学方法进行分析对象物的测定，则因红血球与红血球外液(即，样品中存在的除红血球以外的成分)之间的折射率差引起散射光。由此，来自散射光的基线变高使测定精度下降。对于这样的问题，本发明人等发现通过使用散射光调节剂使散射光在生物试样和分析样品中实质上相同是有效的手段。以下，以生物试样为血液样品的情况为例进行详细说明。

通常，因为血红蛋白等的存在，红血球内的折射率比红血球外液的折射率高。如果在血液(全血)中添加显色试剂等试剂，则随着试剂的溶解红血球外液的渗透压上升。另一方面，伴随红血球外液的渗透压的上升，因红血球与红血球外液的渗透压差使红血球收缩，红血球内液的折射率进一步上升。这里，通过在试剂中进一步添加折射率高的物质，能够有意地促进红血球外液的折射率的上升使红血球内外的折射率几乎相同，从而调整红血球内外的折射率差。但是，生物试样为血液样品时，由于血细胞比容值的高低、红血球内液(水分)的放出带来的红血球外液的稀释效果，使红血球外液的折射率的下降程度产生不均。因此，对于具有范围广的血细胞比容值的血液样品，难以将红血球内外的折射率调整为相同。为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现将试剂混合前后的折射率差变化控制到最小限度是有效的。对上述方法进一步进行深入研究，结果发现通过使用散射光调节剂，将试剂添加前的红血球内的折射率(nrbc-1)与试剂添加后的红血球内的折射率(nrbc-2)的变化(即，δnrbc＝nrbc-1－nrbc-2)、以及试剂添加前的红血球外液的折射率(ns-1)与试剂添加后的红血球外液的折射率(ns-2)的变化(即，δns＝ns-1－ns-2)分别抑制得较低在血液样品的测定中有效。另外，本发明通过以使用散射光调节剂使试剂混合前后的红血球内的折射率变化量(δnrbc＝nrbc-1－nrbc-2)与红血球外液的折射率变化量(δns＝ns-1－ns-2)实质上为相同程度的方式调节红血球的收缩，能够使试剂混合前后的2个折射率变化量为相同程度。如此通过减少试剂混合前后的红血球/红血球外液的折射率差的变动，结果能够使试剂混合前后的散射光实质上相同(抑制光的散射变化)，因此能够减少测定误差。另外，在具有范围宽的血细胞比容值的血液样品中也能够提高分析对象物的测定精度。在将散射光调节剂与过渡金属化合物并用时能够特别有效地实现上述效果。应予说明，上述机理是推测的，不限制本发明的技术范围。

本说明书中，“红血球外液”是指红血球以外的组分(分画)，在试剂混合前是指红血球以外的来自血液样品的成分(血浆)，在试剂混合后是指含有红血球以外的来自血液样品的成分(血浆)、显色试剂、氧化还原酶、散射光调节剂和可任意使用的其它物质(例如，过渡金属化合物)的液体。另外，本说明书中，将含有显色试剂、氧化还原酶、散射光调节剂和可任意使用的其它的物质(例如，过渡金属化合物)的混合物也称为“分析对象物浓度测定试剂”或者简称为“试剂”。

以下，对本发明的实施方式进行说明。应予说明，本发明不限于以下的实施方式。另外，附图的尺寸比率为了方便说明而被放大，有时与实际的比率不同。

本说明书中，表示范围的“x～y”包含x和y，是指“x以上且y以下”。另外，只要没有特别说明，则操作和物性等的测定在室温(20～25℃)/相对湿度40～50％rh的条件下进行。

＜血液样品中的分析对象物检测方法＞

本发明的一个方面涉及一种测定生物试样中的分析对象物浓度的方法，包括如下工序：

(1)准备上述生物试样(工序(1))，

(2)在上述生物试样中混合显色试剂、氧化还原酶和散射光调节剂，得到散射光与上述生物试样实质上相同的分析样品(工序(2))，

(3)使用上述分析样品测定上述分析对象物浓度(工序(3))。

根据本发明的一个方面涉及的方法，即便是诱发光散射的生物试样(例如，含有红血球的样品)，也能够在不需要生物成分的分级的情况下高精度地检测分析对象物。

[工序(1)]

本工序中，准备生物试样。这里，生物试样(生物成分测定对象)只要含有目标分析对象物(生物成分)就没有特别限制。具体而言，可举出血液、以及尿、唾液、间质液等体液等。其中，作为生物试样，优选血液，特别是全血。另外，生物试样的来源没有特别限制。生物试样可以是来自人或者非人动物的试样。作为非人动物，可例示小鼠、大鼠、仓鼠等实验动物；狗、猫、兔子等宠物；猪、牛、山羊、绵羊、马、鸡等家畜类或家禽类，但不限于这些。优选生物试样来自人。即，生物试样优选为人的血液，特别优选为人的全血。

生物试样的准备方法没有特别限制。例如，可采用从血液中分离血浆等公知的方法，但也可以直接使用生物试样。特别优选的实施方式中，生物试样为从人采集的末梢血或者静脉血。

[工序(2)]

本工序中，在上述工序(1)准备的生物试样中混合显色试剂、氧化还原酶和散射光调节剂，得到散射光与上述生物试样实质上相同的分析样品。

本工序(2)中，通过使用散射光调节剂，能够使生物试样和分析样品中的散射光实质上相同。详细而言，例如，生物试样为血液样品时，如果在血液样品中添加显色试剂等试剂，则红血球内液与红血球外液的折射率差增加。与此相对，如果并用散射光调节剂，则将试剂混合前后的红血球内液和红血球外液的折射率变化抑制得较低，其结果，能够以试剂混合前后的红血球内的折射率变化(δnrbc)和红血球外液的折射率变化(δns实质上为相同程度的方式适当地调节红血球的收缩。因此，试剂混合前后的红血球/红血球外液的折射率差减少，结果能够使试剂混合前后的散射光实质上相同(抑制光的散射变化)。因此，在接下来的工序(3)中，能够以高精度测定生物试样中的分析对象物浓度。应予说明，上述机理是推测的，不限制本发明的技术范围。

本说明书中的“散射光调节剂”只要能够使分析样品的散射光与生物试样实质上相同就没有特别限制。这里，“分析样品的散射光与生物试样实质上相同”是指实质上没有受到构成试剂的成分(显色试剂、氧化还原酶、散射光调节剂和过渡金属化合物等可任意使用的其它的物质)、特别是显色试剂的影响的波长范围内的试剂混合前后的平均透射率实质上相同。这里，“实质上没有受到显色试剂的影响的波长范围”是指与被测定物质反应生成的色素成分的吸光度为测定波长的吸光度的3％以下、优选为1％以下的波长范围中，长波长侧的波长范围。本发明中，作为这样的波长范围，优选为800～1000nm，特别是在850～1000nm的波长范围，不会受到与被测定物质反应的显色试剂的影响(参照图1～6)。因此，本说明书中，将实质上不存在显色试剂的影响的波长范围设定为“850～1000nm”。从上述方面考虑，本说明书中的“分析样品的散射光与生物试样实质上相同”是指试剂混合后的分析样品在波长范围850～1000nm的平均透射率(avetanalyte(％))与试剂混合前的生物试样在波长范围850～1000nm的平均透射率(avetsample(％))的差(＝avetanalyte(％)-avetsample(％))大于-15.0％且小于15.0％。本说明书中，也将试剂混合后的分析样品在波长范围850～1000nm的平均透射率(avetanalyte(％))与试剂混合前的生物试样在波长范围850～1000nm的平均透射率(avetsample(％))的差(＝avetanalyte(％)-avetsample(％))简称为“平均透射率差”。上述平均透射率差优选为-10％～10％，更优选为-9.0％～9.0％，特别优选大于-7.5％且小于7.5％。即，在本发明的优选形态中，工序(2)中，分析样品在波长范围850～1000nm的平均透射率(tanalyte(％))与生物试样在波长范围850～1000nm的平均透射率(tsample(％))的差(＝avetanalyte(％)-avetsample(％))为-10％～10％。在本发明的更优选形态中，工序(2)中，分析样品在波长范围850～1000nm的平均透射率(tanalyte(％))与生物试样在波长范围850～1000nm的平均透射率(tsample(％))的差(＝avetanalyte(％)-avetsample(％))为-9.0％～9.0％。

本说明书中，对样品(生物试样、分析样品)在850nm～1000nm的波长范围中连续测定透射率光谱，在得到的光谱中测定每至少1nm(即，测定幅度≤1nm)的透射率。“平均透射率”是基于下述式(a)算出各波长处的透射率差，求出这些透射率差的平均值而确定的。

式(a)

透過率差(％)

＝tanalyte(％)-tsampe(％)

上記式(a)にぉいて、

tanalyteは、所定波長にぉける分析サソプルの透過率(％)を表わし；

tsampleは、所定波長にぉける生体試料の透過率(％)を表ゅす。

本说明书中，生物试样、分析样品的“透射率”和“吸光度”是以光程50μm测定的值或者校正为光程50μm的值。例如，可以使用血糖值检测用芯片(隔离件厚度：50μm)，通过以下的光谱解析求出。

<光谱解析>

以下示出光谱测定中使用的评价系统的概要。另外，以下示出评价系统的概要：

(评价系统的概要)

光源卤素光源spl-2h(klv株式会社)

光纤连接器sma

兼容光纤：纤芯直径＝200μ以上

分光计小型光纤分光器usb2000+

(oceanoptics公司)

检测器范围200～1100nm。

使用分析对象物浓度测定试剂，制作例如实施例中记载的血糖值检测用芯片(隔离件厚度(流路厚度)：50μm，试剂层厚度1μm～4μm)。使用该血糖值检测用芯片测定吸光度(实测值)。此时，实测值是获得流路厚度与试剂层厚度的差(间隙)作为光程的吸光度的实测值。将各测定波长(400～1000nm)处的吸光度(实测值)校正为光程50μm时，由校正后的吸光度(abs)根据下述式(b)求出透射率(t(％))。应予说明，吸光度的校正是通过各测定波长处的吸光度(实测值)除以各芯片中实测的间隙(cl)(μm)的值、再乘以50(μm)而进行的。

式(b)

上述式(b)中、abs表示校正后的吸光度。

接下来，在上述的血糖值检测用芯片点涂血液样品，进行点涂后5～15秒(例如，9秒)的光谱解析。基于得到的光谱解析结果，与点涂前同样地校正吸光度而求出透射率。

应予说明，本发明的一个方面涉及的方法并不限于实施例中记载的使用检测用芯片的方法。例如，使用光程10mm的比色皿分析时，可以根据朗伯-比尔定律，考虑测定比色皿内存在的血液样品中的分析对象物的浓度进行校正而求出吸光度，由该吸光度求出“透射率(％)”。

另外，如上所述，本发明中，平均透射率差大于-15.0％且小于15.0％，优选在实质上不存在构成试剂的成分、特别是显色试剂的影响的整个波长范围内试剂混合前后的透射率实质上相同。即，试剂混合后的分析样品在整个波长范围850～1000nm的透射率(tanalyte(％))与试剂混合前的生物试样在整个波长范围850～1000nm的透射率(tsample(％))的差(＝tanalyte(％)-tsample(％))的绝对值优选为10％以下，更优选为9.0％以下，特别优选小于7.5％。本说明书中，也将试剂混合后的分析样品在整个波长范围850～1000nm的透射率(tanalyte(％))与试剂混合前的生物试样在整个波长范围850～1000nm的透射率(tsample(％))的差(＝tanalyte(％)-tsample(％))的绝对值简称为“透射率差(绝对值)”或者“透射率差”。

本说明书中，透射率差(绝对值)是对样品(生物试样、分析样品)在850nm～1000nm的波长范围内连续测定透射率光谱，在得到的光谱中测定每至少1nm(即，测定幅度≤1nm)的透射率，基于下述式(c)以绝对值算出各波长处的透射率差，求出它们的最大值，评价该最大值是否在上述特定范围。即，本说明书中，“透射率差(绝对值)为10％以下”是指除测量误差、离群值以外，上述最大值为10％以下(上述全部测定点中，透射率差为10％以下)。

式(c)

透射率差(％)

＝|tanalyte(％)-tsaple(％)

上述式(c)中、

tanalyte表示规定波长处的分析样品的透射率(％)；

tsample表示规定波长处的生物试样的透射率(％)。

本发明中可使用的散射光调节剂如上所述只要使散射光在分析对象物浓度测定用试剂的混合前后实质上相同就没有特别限制。具体而言，可例示下述式(1)表示的色素、色原体、多糖类、糖醇、具有至少一个磺酸基的芳香族烃这样的具有离子性官能团的芳香族烃化合物等。这些化合物可以为盐的形态，更具体而言，可以为钠盐、钾盐、铵盐、甲胺盐、乙胺盐、二乙胺盐、三乙胺盐、单乙醇胺盐和氯化物等卤化物等，但并不限定于这些。优选上述的盐为钠盐或钾盐。上述散射光调节剂可以单独使用1种，或者以2种以上的混合物的形态使用。其中，散射光调节剂优选为选自下述式(1)表示的化合物、具有至少一个磺酸基的芳香族烃和二糖类、以及它们的盐中的1种以上，更优选为具有至少一个磺酸基的芳香族烃或其盐。如果为上述优选的散射光调节剂，则能够更适当地控制红血球的收缩，能够进一步使生物试样与分析对象物浓度测定用试剂在混合前后的散射光相同(能够进一步减小平均透射率差)，能够更高精度地测定分析对象物浓度。

作为上述散射光调节剂，可以使用下述式(1)表示的化合物。

q¹-n＝n-q²式(1)

其中，上述式(1)中，q¹和q²各自独立地表示可具有1个以上的取代基的芳基或者含氮杂环基。

式(1)表示的化合物中，作为“芳基”，可例示苯基、萘基、蒽基、和菲基等，优选选自苯基和萘基。

式(1)表示的化合物中，作为“含氮杂环基”，可例示吡咯烷基、吡咯基、哌啶基、吡啶基、咪唑基、吡唑基、吡唑啉酮基、唑基、噻唑基、吡嗪基、吲哚基、异吲哚基和苯并咪唑基等，优选选自咪唑基、吡唑基和吡唑啉酮基。

上述的芳基、含氮杂环基可以具有1个以上的取代基。这里，作为取代基，没有特别限制，例如，上述芳基、含氮杂环基可以具有1个以上选自卤素原子(例如，氟原子、氯原子、溴原子、碘原子)、羟基、碳原子数1～3的烷基(例如，甲基、乙基、正丙基和异丙基)、碳原子数1～3的烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基和异丙氧基)、羧基、磺基、氨基、氨基甲酰基、氨磺酰基、苯基、羧基苯基和磺基苯基中的取代基。另外，作为芳基、含氮杂环基的取代基的苯基可以进一步被选自上述卤素原子(例如，氟原子、氯原子、溴原子、碘原子)、羟基、碳原子数1～3的烷基(例如，甲基、乙基、正丙基和异丙基)、碳原子数1～3的烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基和异丙氧基)、羧基、磺基、氨基、氨基甲酰基、氨磺酰基、苯基、羧基苯基和磺基苯基中的1个以上的取代基取代。

从高精度地测定分析对象物浓度的观点考虑，在优选的一个实施方式中，q¹具有下述结构。

上述结构式中，r¹¹、r¹²、r¹³、r²¹、r²²和r²³各自独立地选自氢原子、卤素原子、羧基、羧酸盐的基团、磺基、磺酸盐的基团、氨基甲酰基、和氨磺酰基。

从高精度地测定分析对象物浓度的观点考虑，在优选的一个实施方式中，q²具有下述结构。

上述结构式中，r³¹、r³²和r⁴¹各自独立地选自氢原子、羟基、碳原子数1～3的烷基、羧基、羧酸盐的基团、磺基、磺酸盐的基团、氨基、氨基甲酰基和氨磺酰基；r³³和r⁴²各自独立地选自氢原子、羧基、羧酸盐的基团、磺基和磺酸盐的基团；r⁵¹、r⁵²、r⁵³和r⁵⁴各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、羧基、羧酸盐的基团、磺基、磺酸盐的基团、氨基甲酰基和氨磺酰基。

在更优选的一个实施方式中，q²具有下述结构(下述结构式中，r³¹、r³²和r³³如上所述。)。

在优选的一个实施方式中，式(1)表示的化合物具有下述结构(下述结构式中，r¹¹、r¹²、r¹³、r³¹、r³²、r³³、r⁴¹、r⁴²、r⁵¹、r⁵²、r⁵³和r⁵⁴如上所述。)。

作为上述的式(1)表示的化合物，更具体而言，可例示acidyellow11、acidyellow23、acidyellow49、acidyellow59、acidorange12、orangeg、acidred18、acidred26、acidred27、acidred88、solventyellow5、solventyellow6、solventyellow11、foodyellow3、foodyellow5等。其中，优选使用选自acidyellow11、acidyellow23、acidyellow49、acidyellow59和foodyellow3中的化合物。在更优选的一个实施方式中，acidyellow23用作散射光调节剂。

作为用作散射光调节剂的具有至少一个磺酸基的芳香族烃，只要为具有至少一个磺酸基的芳香族烃，就没有特别限制，可根据目的适当地选择。这里，作为芳香族烃，没有特别限制，例如，可举出苯、萘、蒽等，优选苯、萘，更优选苯。另外，上述芳香族烃具有的磺酸基的个数没有特别限制，根据芳香族烃的种类而不同，优选为1～3个，更优选为2～3个，特别优选为2个。此外，具有至少一个磺酸基的芳香族烃可以为水合物的形态。另外，具有至少一个磺酸基的芳香族烃中的磺酸基可以为盐的形态，此时，作为盐的形态，没有特别限制，例如，有钠盐、钾盐、铵盐、甲胺盐、乙胺盐、二乙胺盐、三乙胺盐、单乙醇胺盐和氯化物等卤化物等。上述的盐优选为钠盐或者钾盐，更优选为钠盐。即，作为具有至少一个磺酸基的芳香族烃的具体例，可例示苯磺酸、1,2-苯二磺酸、1,3-苯二磺酸、1,4-苯二磺酸、1,2,4-苯三磺酸、1,3,5-苯三磺酸、1-萘磺酸、2-萘磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2,7-二磺酸、萘-1,3,5-三磺酸、萘-1,3,6-三磺酸、蒽-1-磺酸、蒽-2-磺酸、蒽-3-磺酸、蒽-1,3,6-三磺酸等。

作为用作散射光调节剂的二糖类，例如，可例示蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、乳糖、海藻糖、三氯蔗糖、纤维二糖、乳果糖、松二糖、半乳蔗糖、海藻糖胺、麦芽糖醇、乳糖醇等，但不限定于这些。作为二糖类，优选使用蔗糖、海藻糖、三氯蔗糖、半乳糖蔗糖、海藻糖胺、麦芽糖醇、乳糖醇等非还原性糖，更优选使用海藻糖和/或三氯蔗糖。特别是从红细胞的收缩抑制效果大、能够大量溶解于分析样品的方面出发，优选渗透压低的三氯蔗糖。

这些散射光调节剂中，优选具有至少一个磺酸基的芳香族烃或其盐。散射光调节剂更优选选自1,2-苯二磺酸、1,3-苯二磺酸和1,4-苯二磺酸、以及它们的钠盐和钾盐。更进一步优选具有至少一个磺酸基的芳香族烃选自苯磺酸钠(bs)(参照下述结构式(1))、1,3-苯二磺酸二钠(dsb)(参照下述结构式(2))、1,3,5-苯三磺酸三钠(参照下述结构式(3))、萘-1,3,6-三磺酸三钠(tsn)(参照下述结构式(4))、蒽-1,3,6-三磺酸三钠(参照下述结构式(5))、以及它们的水合物。特别优选使用1,3-苯二磺酸二钠(dsb)、萘-1,3,6-三磺酸三钠(tsn)作为散射光调节剂。如果为这些散射光调节剂，则能够适当地控制红血球的收缩。即，能够使生物试样和分析对象物浓度测定用试剂在混合前后的散射光变化为相同的程度(能够使平均透射率差更小)。另外，由于这些散射光调节剂的血液溶解性优异，所以不仅能够抑制分析样品中的溶解残留，而且在血浆量少的高血细胞比容值的血液样品中的溶解性也好。因此，不会对散射光、分析对象物的测定造成影响。因此，能够更高精度地测定分析对象物。这些散射光调节剂可以单独使用1种，也可以并用2种以上。

散射光调节剂在生物试样中的混合量只要为能够使散射光在分析对象物浓度测定试剂的混合前后实质上相同的量，就没有特别限制，生物试样的水性组分中的散射光调节剂的量(浓度)例如为0.5～215mm，优选为1～150mm，更优选为2～60mm，特别优选超过3mm且小于40mm。上述散射光调节剂的混合量在生物试样是血细胞比容值为20～60的全血样品的情况下特别有效。如果为这样的量，则能够更有效地抑制试剂混合后的散射光，能够更高精度地检测分析对象物。应予说明，构成上述散射光调节剂等分析对象物浓度测定试剂的各成分的量为通过下述计算方法求出的值。

(构成分析对象物浓度测定试剂的各成分的量的测定方法)

本说明书中，根据下述方法测定构成试剂的各成分(显色试剂、氧化还原酶、散射光调节剂和可任意使用的其它物质(例如，过渡金属化合物))的量。详细而言，使用分析对象物浓度测定试剂制作例如实施例中记载的血糖值检测用芯片。在该芯片内加入1000μl的ro水(葡萄糖浓度0mg/1000μl)，将分析对象物浓度测定试剂完全溶解(溶出)(样品)。利用uplc(超高效液相色谱shimadzunexerax2，(株)岛津制作所制)测定该样品中的显色试剂浓度。基于涂布在各芯片的显色试剂的质量(mg)，算出ro水流入试剂部空间而溶解时的显色试剂的浓度。另外，对于显色色素以外的各成分，基于分析对象物浓度测定试剂的组成(各成分的浓度比)，计算ro水流入试剂部空间而充满试剂部空间体积时(即溶解时)的各成分的浓度。

应予说明，构成试剂的上述量(浓度)为溶解试剂的介质的量(浓度)，是假定生物试样全部为液体(水性组分)时的值。例如，生物试样为血液样品时，水性组分是除红血球以外的红血球外液。因此，上述各成分的量(浓度)需要考虑血液样品的血细胞比容值而换算成红血球外液中的数值。例如，通过上述方法测定血细胞比容值为40的血液样品(生物试样)中的散射光调节剂的浓度为a(mm)时，散射光调节剂的混合量(浓度)为a×5/3(＝a/(1－0.4))(mm)。

另外，本发明中，从更有效地抑制试剂混合后的散射光的观点考虑，适当地选择显色试剂也是有效的。具体而言，显色试剂优选为下述式(2)表示的2-取代苯并噻唑基-3-取代苯基-5-取代磺化苯基-2h-四唑盐。

另外，以下详细说明，本发明的第2方面涉及的分析对象物浓度测定试剂和本发明的第3方面涉及的芯片中，显色试剂优选为上述式(2)表示的2-取代苯并噻唑基-3-取代苯基-5-取代磺化苯基-2h-四唑盐。本说明书中，也将上述式(2)的2-取代苯并噻唑基-3-取代苯基-5-取代磺化苯基-2h-四唑盐简称为“本发明涉及的四唑盐”或者“四唑盐”。

由本发明涉及的四唑盐产生的甲臜化合物的最大吸收波长位于不与血液的吸收带重合的波长范围(600nm以上，特别是630nm以上)。因此，通过使用本发明涉及的四唑盐，能够减少来自生物试样的噪声。即，能够高灵敏度地检测与生物成分相关的信号。详细而言，本发明涉及的四唑盐的四唑骨架的2位的苯并噻唑基被烷氧基取代。因此，例如，进一步使用过渡金属化合物时，能够使由四唑盐产生的甲臜或者甲臜与过渡金属离子的螯合物的最大吸收波长向长波长侧位移。另外，利用存在于四唑环的2位的苯并噻唑基，由本发明涉及的四唑盐生成的甲臜能够与co²⁺、ni²⁺等过渡金属离子高效且迅速地形成螯合物。认为这是由苯并噻唑基的氮原子所带来的效果。这里，认为用烷氧基取代苯并噻唑基时，由于烷氧基为供电子性，所以苯并噻唑基的电子密度变高，甲臜与过渡金属离子的螯合物的形成更迅速地进行。因此，向存在于四唑环的2位的苯并噻唑基上导入烷氧基能够维持由四唑盐产生的甲臜与过渡金属化合物的螯合能力并使最大吸收波长向长波长侧位移。由此，根据本发明涉及的四唑盐，能够使由本发明涉及的四唑盐生成的甲臜化合物的最大吸收波长进一步向不与血色素的主要吸收带重合的波长范围(600nm以上，特别是630nm以上)位移。因此，能够在最大吸收波长不与血色素的主要吸收带重合的波长范围(600nm以上)测定生物成分浓度，通过使用本发明涉及的四唑盐，即便是全血样品中的生物成分浓度也能够精确地测定。

此外，本发明涉及的四唑盐中的四唑骨架的5位的苯基具有1或2个磺基(-so3^-)，并且，四唑骨架的3位的苯基具有0或1个磺基(-so3^-)。因此，四唑盐在化合物中具有1～3个磺基(-so3^-)。因此，四唑盐的水溶性和血液溶解性优异。另外，本发明涉及的四唑盐的稳定性优异。

因此，通过使用本发明涉及的四唑盐，能够高灵敏度地迅速地测定生物成分浓度。另外，通过使用本发明涉及的四唑盐，即便长时间保存后，也能够高灵敏度地测定生物成分浓度。应予说明，上述机理为推测的，不限制本发明的技术范围。

本发明涉及的四唑盐具有下述式(2)的结构。

上述式(2)中，在四唑骨架的2位存在取代苯并噻唑基。上述式(2)中，通过在四唑环的2位存在苯并噻唑基，例如进一步使用过渡金属化合物时，能够与过渡金属化合物高效地且迅速地形成螯合物(能够使甲臜化合物的最大吸收波长向长波长范围位移)。而且，通过在四唑骨架的2位的苯并噻唑基导入至少1个甲氧基或者乙氧基(-or³)，从而生成的甲臜与ni²⁺等过渡金属离子螯合时的最大吸收波长进一步向长波长侧位移。

其中，q为1或者2，优选为1。其中，q＝1时，r³为甲基或者乙基，从水溶性的观点考虑，优选为甲基。r³为碳原子数3以上的烷基时，四唑盐和由四唑盐产生的甲臜的水溶性差，故而不优选。

式(2)中，从与ni²⁺等过渡金属离子螯合时的最大吸收波长向长波长侧位移的效果考虑，优选存在于四唑骨架的2位的取代苯并噻唑基的-or³中的至少一个键合于苯并噻唑基的6位。

q＝1时，存在于四唑骨架的2位的苯并噻唑基的取代基即-or³的取代位置没有特别限定，可以为4位、5位、6位或者7位中的任一个位置。从与ni²⁺等过渡金属离子螯合时的最大吸收波长向长波长侧位移的效果考虑，优选-or³的取代位置键合于苯并噻唑基的6位。

q＝2时，r³为氢原子、甲基或者乙基，至少一个为甲基或者乙基。另外，q为2时，各or³邻接配置，各or³可以相互形成环。此时，作为优选的组合，r³为氢原子和甲基的组合、甲基和甲基的组合。q＝2时，存在于四唑骨架的2位的苯并噻唑基的取代基即-or³的取代位置只要2个-or³邻接配置就没有特别限定，可以为4,5位、5,6位或者6,7位中的任一个。从与ni²⁺等过渡金属离子螯合时的最大吸收波长向长波长侧位移的效果考虑，优选至少一个-or³的取代位置键合于苯并噻唑基的6位，即，2个-or³的取代位置优选为5,6位或者6,7位。具体而言，q为2时，存在于四唑骨架的2位的取代苯并噻唑基优选为以下任一个取代基。

此外，q为2时，存在于四唑骨架的2位的取代苯并噻唑基为上述任一个取代基时，从与ni²⁺等过渡金属离子螯合物时的最大吸收波长向长波长侧位移的效果考虑，优选存在于四唑骨架的3位的取代磺化苯基为4-甲氧基-5-磺基苯基。

式(2)中，在四唑骨架的5位存在取代磺化苯基。作为该磺化苯基的取代基的r¹为选自氢原子、羟基、甲氧基和乙氧基中的任一个。从提高四唑盐和由四唑盐产生的甲臜的水溶性的观点考虑，r¹优选为氢原子或者羟基，从能够在广泛的ph范围与过渡金属离子稳定地形成螯合物的角度出发，r¹更优选为氢原子。另外，r¹为羟基、甲氧基和乙氧基时的取代位置没有特别限定，优选为4位。

在四唑骨架的5位存在至少一个磺基(-so3^-)(m＝1或2)。由此，认为四唑盐和由四唑盐产生的甲臜的水溶性、血液溶解性提高。式(2)中，m为与四唑骨架的5位的苯基键合的磺基(-so3^-)的个数，为1或者2。特别是磺基位于2位或者4位时，进一步位于2,4位时，能够使水溶性进一步提高。并且磺基位于2,4位时，在用于合成的结构单元(buildingblocks)的合成容易的方面有利。从水溶性高、能够并且在广泛的ph范围与过渡金属离子稳定地形成螯合物、或者提高水溶性的角度出发，优选m＝2，更优选m＝2、r¹为氢原子。

其中，m＝2时，与四唑骨架的3位的苯基键合的磺基(-so3^-)的个数即p优选为1。通过选择这样的取代基个数，能够进一步提高四唑盐和由其产生的甲臜的水溶性、血液溶解性。

应予说明，从水溶性和血液溶解性的观点考虑，优选满足下述(1)～(4)中的任一个：(1)m＝2且p＝1，(2)m＝1且n＝0，(3)存在于四唑骨架的5位的苯基中，r¹为羟基，此时，磺基(so^3-)和羟基位于2,4位或者4,6位，(4)p＝0且至少一个r²为羧基，更优选(1)m＝2且p＝1，或者(4)p＝0且至少一个r²为羧基。另外，认为在上述(3)中，由于磺基(so^3-)和羟基不作为苯环上相邻的取代基存在，所以没有形成氢键或者较少，两个取代基能够有效地有助于水溶性。

这里，磺基(-so3^-)与存在于四唑骨架的5位的苯基的键合位置没有特别限制。从进一步提高四唑盐和由四唑盐产生的甲臜的水溶性的效果、能够使最大吸收波长向长波长侧位移的观点考虑，m＝2时，优选磺基(-so3^-)存在于苯基的2,4位、3,5位。特别优选磺基存在于苯基的2,4位，能够形成即便在高浓度的过渡金属离子的存在下也不会产生沉淀的四唑盐化合物。即，通过使用该四唑盐作为显色试剂，即便在生物成分为高浓度的情况下，也能够制备可定量的生物成分测定试剂组合物。即，在本发明的优选方式中，四唑骨架的5位的苯基优选为磺基(-so3^-)存在于2,4位的苯基。

式(2)中，在四唑骨架的3位存在取代苯基。由于苯基必须被取代，所以n+p为1以上。

作为四唑骨架的3位的苯基的取代基的r²，为选自硝基、-or⁴和羧基中的任一个。从甲臜与过渡金属离子的螯合物形成性的观点考虑，r²优选为硝基或者-or⁴，从水溶性、血液溶解性的观点考虑，优选为羧基。另外，n为与四唑骨架的3位的苯基键合的r²的个数，为0～2的整数。如下所述，通过导入r²，能够使化合物的最大吸收波长向长波长范围移动，能够提高化合物的稳定性，因此优选n＝1或者2，更优选n＝1。r²存在2个时，即n＝2时，r²可以相同，也可以不同。

n＝1或2时，至少一个r²优选为-or⁴基。即，本发明的优选方式是n为1或2，且至少一个r²为-or⁴基。通过导入烷氧基作为苯基的取代基，化合物的稳定性提高。从提高四唑盐和由四唑盐产生的甲臜的水溶性、血液溶解性的观点考虑，-or⁴基优选为甲氧基。其中，r⁴为甲基或者乙基，从水溶性、血液溶解性的观点考虑，优选为甲基。r⁴为碳原子数3以上的烷基时，四唑盐和由四唑盐产生的甲臜的水溶性、血液溶解性差，故而不优选。

n为1或2时的r²的取代位置没有特别限定，优选存在于四唑骨架的3位的取代磺基苯基的2位、3位、4位、5位或者6位，至少一个r²优选在2位或者4位，优选为2位和/或4位。通过成为这样的结构，水溶性、血液溶解性提高，并且能够提高四唑盐和由四唑盐产生的甲臜的稳定性。

p为与四唑骨架的3位的苯基键合的磺基(-so3^-)的个数，为0或者1。从提高四唑盐和由四唑盐产生的甲臜的水溶性、血液溶解性的观点考虑，优选p＝1。应予说明，p＝1时，磺基为吸电子性基团，因此如果存在其它的吸电子性基团(例如硝基)，则有时使四唑环上的氮原子的阳离子电荷不稳定化，化合物的稳定性下降。如上所述，通过导入烷氧基作为苯基的取代基，化合物的稳定性提高，但若同时导入硝基，则有时无法发挥由导入烷氧基所带来的稳定性的提高效果。因此，从提高稳定性的观点考虑，p＝1时，n为1或者2，优选n为1，且r²优选为选自-or⁴和羧基中的任一个，r²更优选为-or⁴。另外，从提高四唑盐和由四唑盐产生的甲臜的水溶性、血液溶解性的观点考虑，优选p＝0且至少一个r²为羧基。即，优选的实施方式是式(2)中p为1或者p＝0且至少一个r²为羧基。更优选m＝2且p＝1、或者p＝0且至少一个r²为羧基。

p＝1时，取代四唑骨架的3位的苯基的磺基(-so3^-)的取代位置没有特别限定，优选为3位或者5位，更优选为3位。通过使磺基在该位置取代，能够更有效地提高四唑盐和由四唑盐产生的甲臜的稳定性。

另外，式(2)中，存在于四唑骨架的3位的取代基优选为4-甲氧基-3-磺基苯基、2-甲氧基-5-磺基苯基、2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基、2-甲氧基-4-硝基苯基、4-磺基苯基、4-羧基-2-甲氧基苯基、5-羧基-2-甲氧基苯基、3-羧基-4-甲氧基苯基、或者4-甲氧基-5-磺基苯基，更优选为4-甲氧基-3-磺基苯基、2-甲氧基-5-磺基苯基、3-羧基-4-甲氧基苯基、或者4-甲氧基-5-磺基苯基，特别优选为4-甲氧基-3-磺基苯基、4-甲氧基-5-磺基苯基、或者2-甲氧基-5-磺基苯基。通过成为这样的结构，显色灵敏度提高，水溶性、血液溶解性提高，并且能够提高四唑盐和由四唑盐产生的甲臜的稳定性。另外，从能够使甲臜化合物本身的最大吸收波长成为更长的波长范围的角度出发，特别优选存在于四唑骨架的3位的苯基为4-甲氧基-3-磺基苯基。

从提高四唑盐和由四唑盐产生的甲臜的水溶性的观点考虑，式(2)中存在的磺基的总数(m+p)优选为2以上，更优选为3。

上述式(2)中，x表示氢原子或者碱金属。其中，x是为了中和阴离子(磺基(-so3^-))而存在的。因此，碱金属的种类没有特别限制，可以为锂、钠、钾、铷、铯中的任一个。

作为四唑盐的优选例，可举出以下的例子。应予说明，在下述结构中，x表示碱金属。

本发明涉及的四唑盐的制造方法没有特别限制，可以与一直以来公知的方法同样地进行或者适当地修饰后应用。例如，通过醛与肼的脱水缩合而合成腙，接下来，使对应的重氮盐在水性溶剂中、碱性条件下反应，得到甲臜。其中，作为碱性化剂，可使用氢氧化钠、氢氧化钾等。接下来可以使用亚硝酸乙酯、亚硝酸丁酯或者次氯酸钠等氧化剂将得到的甲臜在醇溶剂(例如甲醇、乙醇)中氧化，得到式(2)的四唑盐。举出一个实施方式，使具有下述结构的肼基取代苯并噻唑

与具有下述结构的取代磺化苯甲醛反应，

得到具有下述结构的腙化合物。

另一方面，将具有下述结构的取代磺化苯胺一边冰冷一边加入盐酸，进一步滴加亚硝酸钠溶液，

得到具有下述结构的氯化重氮苯化合物。

使上述得到的腙化合物与氯化重氮苯化合物在碱性条件(例如氢氧化钠、氢氧化钾存在)下反应，得到具有下述结构的甲臜化合物。

接下来，使用氧化剂(例如亚硝酸钠、亚硝酸乙酯、亚硝酸丁酯等亚硝酸酯)将这样得到的甲臜化合物在醇溶剂(例如甲醇、乙醇)中氧化，得到本发明涉及的四唑盐。

由本发明涉及的四唑盐生成的甲臜、或者甲臜与过渡金属离子(进一步使用过渡金属化合物时)的螯合物通过单独或者与过渡金属化合物形成螯合物，从而在不与血色素的主要吸收带重合的波长范围(600nm以上，特别是650nm以上)具有最大吸收波长。另外，本发明涉及的四唑盐具有高的水溶性。因此，通过使用本发明涉及的四唑盐，即便对生物试样、特别是全血样品也能够高灵敏度地测定生物成分浓度。具体而言，由本发明涉及的四唑盐生成的甲臜或者甲臜与过渡金属离子的螯合物的最大吸收波长(λmax)优选为600nm以上，更优选为630nm以上，特别优选为650nm以上。如果为具有这样的最大吸收波长的甲臜或者甲臜与过渡金属离子的螯合物(因此，能够生成这样的甲臜的四唑盐)，则不易受到血液的吸收的影响，能够高灵敏度地更精确地测定生物成分浓度。这里，由本发明涉及的四唑盐生成的甲臜或者甲臜与过渡金属离子的螯合物的最大吸收波长(λmax)的上限没有特别限制，通常为900nm以下，优选为800nm以下。应予说明，本说明书中，最大吸收波长(λmax)采用根据下述方法测定的值。

(最大吸收波长(λmax)的评价)

以各甲臜化合物的终浓度成为50～200mm的方式加入10mm的mops水溶液，制作100μl试样。另外制作1m的镍离子水溶液。在上述试样100μl中加入1m的镍离子水溶液10μl，迅速搅拌，制备混合溶液。用分光光度计(测定比色皿长度：10mm)对该混合溶液测定光谱(n＝1)。基于各光谱，求出各化合物的甲臜的最大吸收波长(λmax)(nm)。

显色试剂(特别是上述式(2)的四唑盐)在生物试样中的混合量只要为能够测定所需的分析对象物(生物成分)浓度的量就没有特别限制，优选相对于所需的分析对象物的存在量含有足够量的四唑盐。如果考虑上述观点和通常要测定的生物成分浓度等，则生物试样的水性组分中的显色试剂的量(浓度)例如优选为10～150mm，更优选大于10mm且小于130mm。上述显色试剂的混合量在生物试样为血细胞比容值20～60的全血样品时特别有效。如果为这样的量，则显色试剂根据生物试样中含有的实质上全部(例如，95摩尔％以上，优选为98摩尔％以上，特别优选为100摩尔％)的分析对象物(生物成分)的量反应。另外，如果为上述量，则显色试剂在生物试样中实质上完全溶解。因此，抑制了由不溶物引起的散射，所以能够提高测定精度。因此，能够精确且高灵敏度地快速地测定所需的生物成分浓度。

另外，本发明中可使用的氧化还原酶没有特别限制，可根据被测定的对象即生物成分的种类适当地选择。具体而言，可举出葡萄糖脱氢酶(gdh)、以吡咯喹啉醌(pqq)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(pqq-gdh)、以黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(gdh-fad)、以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(gdh-nad)和以烟碱腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(gdh-nadp)等葡萄糖脱氢酶(gdh)，葡萄糖氧化酶(god)、乳酸脱氢酶(ldh)、胆固醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、尿酸脱氢酶等。其中，氧化还原酶可以单独使用1种，或者组合2种以上。例如，生物成分为葡萄糖时，氧化还原酶优选为葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶。另外，生物成分为胆固醇时，氧化还原酶优选为胆固醇脱氢酶、胆固醇氧化酶。

氧化还原酶在生物试样中的混合量没有特别限制，可以根据使用的酶或显色试剂的种类、目标分析对象物的范围适当地设定。氧化还原酶的混合量相对于显色试剂1摩尔，例如为0.20～1.0摩尔，优选为0.3～0.8摩尔。或者，氧化还原酶的混合量可以为分析样品中的氧化还原酶的浓度例如成为2～50mu(×10⁶u)/l、优选成为3～35mu/l的量。上述散射光调节剂的混合量在生物试样为血细胞比容值20～60的全血样品时特别有效。

另外，本工序中，可以在上述工序(1)准备的生物试样中混合显色试剂、氧化还原酶和散射光调节剂，优选进一步添加过渡金属化合物。通过将过渡金属化合物与散射光调节剂并用，能够使生物试样和分析样品中的散射光实质上更相同。这里，过渡金属化合物可以与显色试剂、氧化还原酶和散射光调节剂一起混合，或者在与显色试剂、氧化还原酶和散射光调节剂的混合前后混合。优选过渡金属化合物与显色试剂、氧化还原酶和散射光调节剂一起混合。

工序(2)中将过渡金属化合物混合于生物试样时可使用的过渡金属化合物只要以离子形态与显色试剂(特别是上述式(2)的四唑盐)生成螯合物就没有特别限制。另外，显色试剂为上述式(2)的四唑盐时，通过这样使过渡金属离子与显色试剂形成螯合物，能够使最大吸收波长进一步向长波长侧位移。例如，显色试剂为上述式(2)的四唑盐、且过渡金属离子为镍离子时，从其结构式考虑，镍离子与上述式(2)的四唑盐以1：2的摩尔比(镍离子：上述式(2)的四唑盐的摩尔比)形成螯合物。另外，即便为测定生物试样(全血样品)中的生物成分浓度的情况下，甲臜在不与血色素的主要吸收带重合的波长范围(600nm以上)也具有最大吸收波长。因此，对于生物试样、特别是全血样品而言，也能够进一步提高生物成分浓度的测定灵敏度。分析对象物浓度测定试剂含有过渡金属化合物时，作为可使用的过渡金属化合物，没有特别限制。具体而言，可使用能够生成镍离子(ni²⁺)、钴离子(co²⁺)、锌离子(zn²⁺)、铜离子(cu²⁺)等过渡金属离子的化合物。如果为这样的离子，则能够使甲臜的最大吸收波长向更长波长侧位移。其中，优选镍离子。镍离子不易受到氧化、还原作用，因此能够更有效地减少测定误差。即，根据本发明的优选形态，过渡金属化合物为镍化合物。另外，生成上述过渡金属离子的化合物没有特别限制，优选在水性液体(例如，水、缓冲液、血液、体液)中生成离子的化合物。例如，可举出上述过渡金属的氯化物、溴化物、硫酸盐、有机酸盐(例如葡糖酸盐、乙酸盐、草酸盐、柠檬酸盐)等。上述过渡金属化合物盐优选为过渡金属的有机酸盐。此时，容易控制对血球的影响。上述过渡金属化合物可以单独使用1种，或者并用2种以上。

上述形态中，过渡金属化合物在生物试样中的混合量只要在化学计量上比能够足以与显色试剂形成螯合物的量多就没有特别限制，可根据显色试剂的量而不同。例如，过渡金属化合物的量相对于显色试剂1摩尔，优选为4.0摩尔以上，更优选大于4.0摩尔，特别优选为4.5摩尔以上。即，本发明的优选形态中，工序(2)中，过渡金属化合物以相对于显色试剂1摩尔为4.0摩尔以上的比例混合。另外，在下述详细说明，本发明的第2方面涉及的分析对象物浓度测定试剂优选以相对于上述显色试剂1摩尔为4.0摩尔以上(更优选大于4.0摩尔，特别优选为4.5摩尔以上)的比例进一步含有过渡金属化合物。同样地，在本发明的第3方面涉及的芯片中，反应部优选以相对于上述显色试剂1摩尔为4.0摩尔以上(更优选大于4.0摩尔，特别优选为4.5摩尔以上)的比例进一步含有过渡金属化合物。上述过渡金属化合物的量在显色试剂为上述式(2)的四唑盐时特别有效。另外，上述散射光调节剂的混合量在生物试样为血细胞比容值20～60的全血时特别有效。如果为这样的量，则能够使甲臜化合物的最大吸收波长位移至所希望的波长范围。应予说明，过渡金属化合物的上述混合量的上限没有特别限制，但从抑制分析样品中的不溶物的效果等考虑，相对于显色试剂(特别是2-取代苯并噻唑基-3-取代苯基-5-取代磺化苯基-2h-四唑盐)1摩尔，优选为8摩尔以下，更优选为7摩尔以下。

上述形态中，从更有效地抑制试剂混合后的散射光的观点考虑，适当地调节散射光调节剂与过渡金属化合物的混合比也是有效的。具体而言，散射光调节剂相对于过渡金属化合物1摩尔，优选大于0摩尔且为0.24摩尔以下，更优选为0.03～0.12摩尔，特别优选为0.05～0.10摩尔。即，本发明的优选形态中，工序(2)中，将过渡金属化合物以散射光调节剂与过渡金属化合物的混合比(相对于过渡金属化合物1摩尔的散射光调节剂的摩尔)大于0摩尔且为0.24摩尔以下的比例进一步混合到生物试样中。另外，本发明的更优选形态中，工序(2)中，将过渡金属化合物以散射光调节剂与过渡金属化合物的混合比(相对于过渡金属化合物1摩尔的散射光调节剂的摩尔)成为0.03～0.12摩尔的比例进一步混合到生物试样中。本发明的特别优选的形态中，工序(2)中，将过渡金属化合物以散射光调节剂与过渡金属化合物的混合比(相对于过渡金属化合物1摩尔的散射光调节剂的摩尔)成为0.05～0.10摩尔的比例进一步混合在生物试样中。如果为这样的混合比，则能够将试剂混合前后的红血球内液和红血球外液的折射率变化抑制得更低，其结果，能够以试剂混合前后的红血球内的折射率变化量(δnrbc＝nrbc-1－nrbc-2)和红血球外液的折射率变化量(δns＝ns-1－ns-2)实质上为相同程度的方式更适当地调节红血球的收缩。因此，能够更高精度地测定分析对象物浓度。

除上述以外，从更有效地抑制试剂混合后的散射光的观点考虑，适当地调节散射光调节剂和过渡金属化合物的合计浓度是有效的。具体而言，生物试样的水性组分中的散射光调节剂和过渡金属化合物的合计浓度优选为810mmol/l以下，更优选为750mmol/l以下，更进一步优选为50～665mmol/l，特别优选大于100mmol/l且小于665mmol/l。通过成为这样较少的量，能够将试剂混合前后的红血球内液和红血球外液的折射率变化抑制得更低，其结果，能够以试剂混合前后的红血球内的折射率变化量(δnrbc＝nrbc-1－nrbc-2)和红血球外液的折射率变化量(δns＝ns-1－ns-2)实质上为相同程度的方式更适当地调节红血球的收缩。因此，能够更高精度地测定分析对象物浓度。

以这种方式制备分析样品。这里，分析样品的透射率只要使散射光与生物试样实质上相同(与生物试样的平均透射率差大于-15.0％且小于15.0％)，就没有限制。例如，分析样品在800nm～950nm的波长范围内的透射率优选小于50％。另外，在750nm～850nm的波长范围内，优选分析样品的透射率比生物试样的透射率低。这样的情况下，能够以与生物试样的散射光(透射率)的差异小的状态测定分析样品的散射光(透射率)(能够使与生物试样的平均透射率差更小)，因此能够提高分析精度。

应予说明，如上所述，本发明的特征在于通过组合散射光调节剂和过渡金属化合物而得到分析样品的散射光与生物试样实质上相同的分析样品，除上述以外，从更有效地抑制试剂混合后的散射光的观点考虑，优选进行下述(a)～(c)中的至少一个：

(a)使用上述式(2)的2-取代苯并噻唑基-3-取代苯基-5-取代磺化苯基-2h-四唑盐；

(b)工序(2)中，将过渡金属化合物以散射光调节剂与过渡金属化合物的混合比(相对于过渡金属化合物1摩尔的散射光调节剂的摩尔)大于0摩尔且为0.24摩尔以下(更优选为0.03～0.12摩尔，特别优选为0.05～0.10摩尔)的比例进一步混合到生物试样中；以及

(c)工序(2)中，将过渡金属化合物以相对于显色试剂1摩尔为4.0摩尔以上的比例混合。上述中，优选至少进行(a)，更优选进行(a)及(b)和/或(c)，更进一步优选至少进行(a)及(b)，特别优选进行(a)、(b)和(c)全部。

另外，进行上述(b)时，优选配合下述(d)进行：

(d)将散射光调节剂和过渡金属化合物的合计浓度设定为750mmol/l以下(更优选为50～665mmol/l，特别优选大于100mmol/l且小于665mmol/l)。

[工序(3)]

本工序中，使用上述工序(2)中得到的分析样品测定分析对象物浓度。由此，能够以高精度地测定生物试样中含有的特定的分析对象物(生物成分)浓度。这里，测定方法没有特别限制，可以根据作为测定对象的生物成分的种类适当地选择。例如，生物成分为β-d-葡萄糖(bg)、氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶(gdh)时，葡萄糖被gdh氧化而生成葡糖酸，但此时利用gdh的辅酶或者电子传递物质被还原的作用。具体而言，作为电子授受的结果，大致分成：光学测定被还原的四唑盐(因此为甲臜或者甲臜与过渡金属离子的螯合物)的呈色程度的方法(比色法)，和测定由氧化还原反应产生的电流的方法(电极法)。上述方法中，利用比色法进行的血糖值测定具有在算出血糖值时容易进行采用血细胞比容值的校正、制造工序简单等优点。因此，分析对象物浓度测定试剂可适用于比色法。特别是测定全血样品中的葡萄糖浓度时，可优选使用比色法，显色试剂特别优选使用上述式(2)的四唑盐。然而，电极法也可以在分析样品与生物试样的差异小的状态下进行测定。

＜分析对象物浓度测定试剂＞

如上所述，根据本发明的方法，能够更高精度地测定分析对象物浓度。因此，本发明的第2方面中，提供含有显色试剂、氧化还原酶和散射光调节剂的分析对象物浓度测定试剂。优选本发明的分析对象物浓度测定试剂含有显色试剂、氧化还原酶、过渡金属化合物和散射光调节剂。这里，显色试剂、氧化还原酶、过渡金属化合物和散射光调节剂的优选形态(种类、含量、混合比等)与上述第1方面同样，因此这里省略说明。

分析对象物(生物成分测定对象)只要含有目标生物成分就没有特别限制。具体而言，作为生物成分测定对象，可举出血液、以及尿、唾液、间质液等体液等。另外，生物成分没有特别限制，通常利用比色法或者电极法测定的生物成分可同样地使用。具体而言，可举出葡萄糖、胆固醇、中性脂肪、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)、尿酸等。即，根据本发明的第2方面中的优选形态，本发明的分析对象物浓度测定试剂用于测定血液或体液中的葡萄糖、胆固醇、中性脂肪、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)、尿酸的浓度。

本发明的分析对象物浓度测定试剂的使用形态没有特别限制，可以为固体、凝胶状、溶胶状或者液体中的任一形态。另外，本发明的分析对象物浓度测定试剂含有显色试剂、氧化还原酶和散射光调节剂，优选含有显色试剂、氧化还原酶、过渡金属化合物和散射光调节剂，但除上述以外可以进一步含有其它成分。这里，作为其它成分，通常可根据作为测定对象的生物成分的种类适当地选择，为了测定生物成分浓度而添加的成分可同样地使用。具体而言，可举出电子载体、缓冲剂、ph调节剂、表面活性剂、水(例如，ro水)等。其中，上述其它成分可以分别单独使用1种，或者可以组合2种以上。另外，上述其它成分各自可以单独使用1种，或者可以并用2种以上。

电子载体没有特别限制，可以使用公知的电子载体。具体而言，可举出黄递酶、吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulfate)(pms)、1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(1-methoxy-5-methylphenaziniummethylsulfate)(1-methoxypms或者m-pms)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)等。应予说明，电子载体并非必须含有，根据使用的氧化还原酶的种类，可以不配合电子载体。使用电子载体时，可以单独使用1种，或者可以组合2种以上。另外，分析对象物浓度测定试剂含有电子载体时的电子载体的含量没有特别限制，例如，可以根据显色试剂的量适当地选择。例如，电子载体的含量相对于显色试剂，优选为0.05～10质量％，更优选为0.1～5质量％。如果为这样的量，则能够更高效地进行还原反应。这里，例如，显色试剂为上述式(2)的四唑盐、生物成分为β-d-葡萄糖、过渡金属离子为镍离子、氧化还原酶是以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅酶的葡萄糖脱氢酶(gdh-fad)、电子载体为1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(m-pms)时，首先，β-d-葡萄糖和m-pms受到gdh-fad的作用，变成葡糖酸和还原型的m-pms，由该还原型的m-pms和四唑盐变成m-pms和甲臜而显色。并且，该甲臜与镍离子形成螯合物，最大吸收波长向更长的波长范围侧(例如600nm以上)位移。因此，通过使用本发明的分析对象物浓度测定试剂，能够减少血色素的吸收产生的影响，所以对于生物试样、特别是全血样品而言也能够高灵敏度地测定生物成分浓度。

缓冲剂(缓冲液)没有特别限制，通常在测定生物成分浓度时使用的缓冲液可同样地使用。具体而言，可使用磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、柠檬酸-磷酸缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷-hcl缓冲剂(tris-盐酸缓冲剂)、mes缓冲剂(2-吗啉乙磺酸缓冲剂)、tes缓冲剂(n-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲剂)、乙酸缓冲剂、mops缓冲剂(3-吗啉丙磺酸缓冲剂)、mops-naoh缓冲剂、hepes缓冲剂(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲剂)、hepes-naoh缓冲剂等good缓冲剂、甘氨酸-盐酸缓冲剂、甘氨酸-naoh缓冲剂、甘氨酰甘氨酸-naoh缓冲剂、甘氨酰甘氨酸-koh缓冲剂等氨基酸系缓冲剂、tris-硼酸缓冲剂、硼酸-naoh缓冲剂、硼酸缓冲剂等硼酸系缓冲剂、或者咪唑缓冲剂等。其中，优选磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、柠檬酸-磷酸缓冲剂、tris盐酸缓冲剂、mes缓冲剂、乙酸缓冲剂、mops缓冲剂、hepes-naoh缓冲剂。这里，作为缓冲剂的浓度，没有特别限制，优选为0.01～1.0m。应予说明，本发明中缓冲剂的浓度是指水性溶液中含有的缓冲剂的浓度(m，mol/l)。另外，优选缓冲液的ph对生物成分不产生作用。从上述观点考虑，缓冲液的ph优选在中性附近，例如为5.0～8.0左右。

另外，ph调节剂也没有特别限制，以成为通常测定生物成分浓度时使用的ph的方式适当地选择、使用酸(盐酸、硫酸、磷酸等)或者碱(氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠等)。另外，ph调节剂可以直接使用、或者以水溶液的形态使用。另外，ph调节剂的量没有特别限制，优选使试剂的ph在中性附近，例如成为5.0～8.0左右的量。

另外，表面活性剂、醇等溶剂也可以在制备试剂时根据目的适当地添加。

＜分析对象物浓度测定用芯片＞

本发明的分析对象物浓度测定试剂可以以现有的形态直接用于生物成分浓度的测定，但也可以设置于分析对象物(生物成分)浓度测定用芯片中。即，本发明还提供一种用于测定生物试样中的分析对象物浓度的芯片，其具有反应部，上述反应部含有显色试剂、氧化还原酶和散射光调节剂。优选本发明的芯片的反应部含有显色试剂、氧化还原酶、过渡金属化合物和散射光调节剂。

本发明的分析对象物浓度测定方法、测定用试剂可组装到自动分析机、测定试剂盒、简易血糖仪等中，用于日常的临床检查。另外，也可以将本发明的试剂组装于市售的生物传感器。应予说明，将分析对象物浓度测定试剂组装于分析对象物(生物成分)浓度测定用芯片时，每1个芯片中的试剂的含量没有特别限制，通常在该领域使用的量可同样地采用，优选相对于所需的生物成分的存在量含有足够量的显色试剂。如果考虑上述观点和通常要测定的生物成分浓度等，则每1个芯片中，显色试剂(特别是式(2)的四唑盐)的量(浓度)优选为2.5nmol以上，更优选为3.0～50.0nmol，特别优选为5～30nmol。如果为这样的量，则显色试剂根据生物试样中含有的实质上全部的生物成分的量进行反应。因此，能够高灵敏度地精确且快速地测定所需的生物成分浓度。

以下，参照附图对利用比色法测定血糖值时使用的本发明的测定用芯片(比色式血糖仪)的形态进行说明。然而，本发明的特征在于使用用于测定本发明的分析对象物(生物成分)的浓度的方法和该测定用的试剂，芯片的结构没有特别限制。因此，可以将本发明的分析对象物浓度测定试剂用于市售的测定用芯片、wo2014/04970和wo2016/051930等公报中记载的芯片。同样地，在下述实施方式中，对以血糖值的测定为目标的芯片的具体形态进行说明，但测定用芯片不限于该用途，也可以同样地或者进行适当的修饰而用于其它用途。另外，在附图说明中，对相同的要素标注相同的符号，省略重复的说明。另外，为了方便说明附图的尺寸比率被放大，有时与实际的比率不同。

图7是示意性地表示在使用本实施方式涉及的测定用芯片检测葡萄糖(血糖)中使用的血糖仪的俯视图。

图7中，血糖仪10构成为测定血液样品中的葡萄糖(血糖)的设备。该血糖仪10主要可用作使用者(受试者)操作的个人应用。使用者也可以测定餐前的血糖来进行自身的血糖管理。另外，医疗从业者为了评价受试者的健康状态，也可以使用血糖仪10，此时，也可适当地改变血糖仪10使其成为能够设置于医疗设施等的构成。

血糖仪10采用比色法原理，即光学测定血液样品中含有的葡萄糖的含量(血糖值)。特别是该血糖仪10利用对分析样品(血液)照射规定波长的测定光并接受透过分析样品的光的透射型测定部14进行血糖测定。

血糖仪10通过安装导入了血液的测定用芯片12、或者在安装有测定用芯片12的状态下向测定用芯片12中导入血液，利用测定部14检测葡萄糖。测定用芯片12可以构成为1次测定后丢弃的一次性类型。另一方面，血糖仪10优选构成为可携带且坚固的设备以使得使用者可简单地重复测定。

测定用芯片12如图8所示，具备形成为板状的芯片主体部18和在芯片主体部18的内部沿板面的面方向延伸的空洞部20(液体用空洞部)。

芯片主体部18如图8所示，形成为在血糖仪10的插入和脱离方向(血糖仪10的前端和基端方向，即图7中的b方向)具有长的长边22且在a方向具有短的短边24的长方形。例如，芯片主体部18的长边22的长度可以被设定成短边24的2倍以上的长度。由此可确保测定用芯片12相对血糖仪10具有充分的插入量。

另外，芯片主体部18的厚度以与形成为长方形的侧面相比极小(薄)的方式形成(图8中，有意以具有充分厚度的方式图示)。例如，芯片主体部18的厚度优选被设定为上述的短边24的1/10以下。该芯片主体部18的厚度可以根据血糖仪10的插入孔58的形状适当地设计。

测定用芯片12以具有空洞部20的方式由一对板片30和一对隔离件32构成了芯片主体部18。

图9是表示图7的测定用芯片的俯视图。在图9中，芯片主体部18的角部是尖的，但例如角部可以形成为圆角。另外，芯片主体部18不限定于薄板状，当然可以自由地设计其形状。例如，芯片主体部18在俯视时可以形成为正方形、其它的多边形或者圆形(包括椭圆形)等。

设置于芯片主体部18的内部的空洞部20位于芯片主体部18的短轴方向中间位置，在芯片主体部18的长边方向形成为直线状。该空洞部20分别与形成于芯片主体部18的前端边24a的前端口部20a和形成于基端边24b的基端口部20b连接，并与芯片主体部18的外侧连通。若空洞部20从前端口部20a导入使用者的血液，则可基于毛细管现象使血液沿着延伸方向流动。在空洞部20内流动的血液为少量的，即便移动至基端口部20b也可因张力而抑制漏出。应予说明，在芯片主体部18的基端边24b侧可以设置吸收血液的吸收部(例如，使后述的隔离件32的仅基端侧为多孔体等)。

另外，在空洞部20的规定位置(例如比图9中所示的前端口部20a与基端口部20b的中间点更靠近基端的位置)设定有利用血糖仪10进行测定的测定对象部28，在测定对象部28涂布有通过与血液中的葡萄糖(血糖)反应而显现出与血液中的葡萄糖(血糖)浓度对应的颜色的试剂(显色试剂)26。在空洞部20内向基端方向流动的血液与涂布在测定对象部28的试剂26接触，血液与试剂26发生反应而显色。应予说明，在空洞部20的长边方向上，试剂26的涂布位置与测定对象部28可以彼此错开，例如可以将涂布有试剂26的反应部设置在测定对象部28的血液流动方向上游侧。

测定用芯片12以具有以上的空洞部20的方式由一对板片30和一对隔离件32构成芯片主体部18。一对板片30从侧面看分别形成为上述的长方形，在层叠方向相互配置。也就是说，一对板片30构成了芯片主体部18的两个侧面(上表面和下表面)。各板片30的板厚非常小，例如，可以设定为5～50μm左右的相同尺寸。2个(一组)板片30的厚度可以相互不同。

一对板片30具有即便从与面方向正交的方向施加某种程度的按压力仍可维持板形状而不发生塑性变形的强度。另外，各板片30以能够透过测定光的方式具备透明部或者半透明部分。并且，各板片30优选形成为具有适当的亲水性的平坦状的板面以使的血液可在空洞部20中流动。

构成各板片30的材料没有特别限定，可以应用热塑性树脂材料、玻璃、石英等。作为热塑性树脂材料，例如，可举出聚烯烃(例如聚乙烯、聚丙烯等)、环烯烃聚合物、聚酯(例如聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯等)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、abs树脂、丙烯酸树脂、聚酰胺、氟树脂等高分子材料或它们的混合物。

另外，一对隔离件32以被夹在一对板片30之间的方式配置，通过规定的接合方法(粘接剂等)被牢固地粘接在各板片30的相对面。也就是说，各隔离件32是以使一对板片30彼此分离的方式配置在一对板片30之间，在一对板片30和一对隔离件32自身之间形成空孔部20的部件。这种情况下，一个隔离件32以与图9中的芯片主体部18的上侧长边22a相接并沿着该上侧长边22a在前端和基端方向延伸的方式配置。另一个隔离件32以与图9中的芯片主体部18的下侧长边22b相接且沿着该下侧长边22b在前端和基端方向延伸的方式配置。

构成一对隔离件32的材料(基材)没有特别限定，例如，可举出苯乙烯系、聚烯烃系、聚氨酯系、聚酯系、聚酰胺系、聚丁二烯系、反式聚异戊二烯系、氟橡胶系、氯化聚乙烯系等各种热塑性弹性体。或者，除了热塑性弹性体以外，也可以使用可弹性变形的各种材料，另外还可以使用可弹性变形的多孔体(例如海绵)等结构体。此外，可以用作在基材的一面或两面具有通过在一对板片30间变成固化状态或半固化状态而将板片30彼此粘接的粘接剂的隔离件32。另外，隔离件32可以是通过含有试剂26而向空洞部20溶出试剂26的构成。

板片30、隔离件32可以是经亲水化处理的部件。作为亲水化处理的方法，例如可举出利用浸渍法或喷雾法等涂布含有表面活性剂、聚乙二醇、聚丙二醇、羟丙基纤维素、水溶性有机硅、以及聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺等亲水性高分子的水溶液的方法；等离子体照射、辉光放电、电晕放电、紫外线照射(例如准分子光照射)等方法等，这些方法可以单独使用或者组合使用。

接下来，对血糖仪10的装置主体16进行说明。如图7所示，血糖仪10具有构成外观的壳体40。壳体40包括箱体部44和筒状的测光部46，上述箱体部44为使用者容易把持操作的大小，在其内部收纳有血糖仪10的控制部42；上述筒状的测光部46从箱体部44的一边(前端侧)向前端方向突出，在内部收纳有光学系统的测定部14。另外，在箱体部44的上表面设置有电源按钮48、操作按钮50、显示器52，在测光部46的上表面设置有弹出杆54。

电源按钮48在使用者的操作下可切换血糖仪10的启动和启动停止。操作按钮50在成为启动状态的血糖仪10中，作为根据使用者的操作进行血糖值的测定或显示、切换测定结果(包括以前的测定结果)的显示等的操作部发挥功能。显示器52由液晶、有机el等构成，以测定结果的显示、错误显示等方式在测定操作中显示向使用者提供的信息。

弹出杆54被设置成能够向前端和基端方向移动，通过解除设置于测光部46内的未图示的弹出针的锁定，允许弹出针向前端方向推进。

另一方面，为了将前端推到使用者的手指等，装置主体16的测光部46从箱体部44向前端方向延伸。如图8所示，在该测光部46设置有具有插入孔58的芯片安装部60和光学检测血中的葡萄糖(血糖)的测定部14。

芯片安装部60利用具有高的硬质性(刚性)的材料(例如不锈钢)形成为在前端侧具备向外方向突出的凸缘部60a且在轴向具有规定长度的筒状。该芯片安装部60被定位固定在由树脂材料构成的测光部46的前端面和轴心部(中心部)。在测光部46的内表面，如图10a所示，突出形成有牢固地固定芯片安装部60的固定壁46a。

作为构成芯片安装部60的材料，例如，可举出不锈钢、钛等金属，经防蚀铝被膜处理的铝，液晶聚合物，添加玻璃、云母等填充剂的塑料、通过镀镍等在表面进行固化而形成被膜的塑料，碳纤维、精细陶瓷等硬质且尺寸不容易变化，并且即使反复插拔测定用芯片也不容易磨损，且能够进行尺寸精度好的加工的材料。其中若使用金属材料，则在芯片安装部60的制造(注塑成型、冲压成型等)时，能够高尺寸精度且容易地将插入孔58成型。应予说明，装置主体16可以通过由硬质材料(例如金属材料)构成测光部46本身而将芯片安装部60一体成型。

在芯片安装部60的轴心部，通过被该芯片安装部60的壁部62包围而设置插入孔58。插入孔58形成为在插入方向(b方向)长且在左右宽度方向(a方向)短的截面长方形。插入孔58在芯片安装部60被固定于测光部46的状态下，从其前端面向内部(基端方向)具有规定深度。

在芯片安装部60的前端侧形成与插入孔58连接且与外部连通的插入开口部58a。该插入开口部58a的插入方向(b方向)的尺寸与测定用芯片12的短边24的尺寸(a方向的长度)一致。另外，插入开口部58a的左右宽度方向的尺寸，即构成插入孔58的侧面的一对壁部62的间隔如图10a所示，与测定用芯片12的层叠方向的厚度(图10a中的tall)实质上相同。

芯片安装部60在插入孔58(测定用孔部59)延伸的中途位置与测光部46的固定壁46a配合地形成一对元件收容空间64。一对元件收容空间64为测定部14的一部分，以夹持插入孔58的方式设置于相互对置的位置，经由由芯片安装部60形成的各导光部66与测定用孔部59连通。

测定部14通过在一个元件收容空间64收容发光元件68而构成发光部70，通过在另一个元件收容空间64收容受光元件72而构成受光部74。芯片安装部60的导光部66通过形成为具有适当直径的圆形孔而发挥所谓的光圈的作用。

发光部70的发光元件68包括将具有第1波长的测定光向测定用芯片12照射的第1发光元件68a和将具有与第1波长不同的第2波长的测定光向测定用芯片12照射的第2发光元件68b(图8中省略图示)。第1发光元件68a和第2发光元件68b并列设置在面对元件收容空间64的导光部66的位置。

发光元件68(第1和第2发光元件68a、68b)可由发光二极管(led)构成。第1波长是用于检测与血糖量对应的试剂26的呈色浓度的波长，例如，为600nm～680nm。第2波长是用于检测血液中的红细胞浓度的波长，例如，为510nm～540nm。箱体部44内的控制部42供给驱动电流，使第1和第2发光元件68a、68b分别在规定时刻发光。这种情况下，使用由红细胞浓度得到的血细胞比容值校正由呈色浓度得到的血糖值，求出血糖值。应予说明，可以通过进一步在其它测定波长进行测定来校正由血细胞引起的噪声。

受光部74通过在面对元件收容空间64的导光部66的位置配置一个受光元件72而构成。该受光部74接受来自测定用芯片12的透射光，例如可由光电二极管(pd)构成。

另外，在插入孔58的底部(基端面)设置有与弹出杆54连接的弹出针56(弹出部)。弹出针56具备沿测光部46的轴向延伸的棒部56a和在棒部56a的前端部向径向外侧的大直径的接受部56b。接受部56b与被插入到插入孔58的测定用芯片12的基端边24b接触。另外，在插入孔58的底部与弹出针56的接受部56b之间设置有以非接触的方式包围弹出针56的螺旋弹簧76。螺旋弹簧76弹性支承弹出针56的接受部56b。

测定用芯片12的插入结束时，如图10b所示，测定用芯片12的测定对象部28配置于与导光部66重合的位置。

随着使用者插入测定用芯片12，接受部56b被按压而向基端方向位移，弹出针56被设置于壳体40内的未图示的锁定机构锁定(固定)。螺旋弹簧76根据接受部56b的位移发生弹性收缩。然后，通过使用者的弹出杆54的操作，弹出针56稍微移动，锁定机构的锁定被解除，利用螺旋弹簧76的弹性恢复力而向前端方向滑动。由此，测定用芯片12被弹出针56推出，从插入孔58取出。

返回图7，装置主体16的控制部42例如由具有未图示的运算部、存储部、输入输出部的控制电路构成。该控制部42可以使用公知的计算机。控制部42例如在使用者的操作按钮50的操作下，驱动控制测定部14检测和计算血中的葡萄糖，并在显示器52上显示算出的血糖值。

例如，在使测定光透射测定用芯片12而测定分析对象物(例如葡萄糖)的血糖仪10中，控制部42基于以下的式(d)表示的beer-lambert定律计算测定结果。

式(d)：

log10(i；/ig)＝-αl

上述式(d)中，l0为入射到血液样品之前的光的强度，l1为从血液样品出射后的光的强度，α为吸光系数，l为测定光通过的距离(比色皿长度)。

实施例

利用以下的实施例和比较例对本发明的效果进行说明。但是，本发明的技术范围不限于以下的实施例。应予说明，在下述实施例中，只要没有特殊说明，则操作在室温(25℃)下进行。另外，只要没有特殊说明，则“％”和“份”分别表示“质量％”和“质量份”。

制造例1：四唑化合物1的合成

按照以下的方法，合成具有下述结构的化合物(2-(6-甲氧基苯并噻唑基)-3-(3-磺基-4-甲氧基-苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2h-四唑盐：四唑化合物1)(分子量(mw)＝693)。

四唑化合物1

1.腙化合物1的合成

使4-甲酰苯-1,3-二磺酸二钠(disodium4-formylbenzene-1,3-disulfonate)(东京化成工业株式会社制)1.59g和(6-甲氧基苯并噻唑-2-基)肼(2-hydrazino-6-methoxy-1,3-benzothiazole)(santacruzbiotechnology公司制)1.0g悬浮于ro水60ml中。将该悬浮液在乙酸酸性下在水浴中于60℃加热搅拌2小时。在加热搅拌结束后，除去溶剂。将其残渣用异丙醇清洗后，滤出沉淀。在通风中干燥该沉淀，得到腙化合物1。回收1.8g，收率为70质量％。

2.甲臜化合物1的合成

使0.76g上述1.的腙化合物1溶解于ro水10ml和n,n-二甲基甲酰胺(dmf)10ml的混合液中，制备腙化合物1溶液。使对茴香胺-3-磺酸(p-anisidin-3-sulfonicacid)(东京化成工业株式会社制)0.264g悬浮于ro水4.09ml中，加入10n的naoh130μl使其溶解。边将该溶液保持在0℃，边加入9.6n的hcl280μl，滴加亚硝酸钠溶液，进行重氮化。将该重氮化溶液保持在-20℃，滴加到腙化合物1溶液中。滴加结束后，滴加10n的naoh300μl，在室温(25℃)下搅拌2小时，制备含有甲臜化合物1的溶液(甲臜化合物1溶液)。用9.6n的hcl将该甲臜化合物1溶液的ph调节成中性，除去溶剂。将得到的残渣用异丙醇清洗后，滤出沉淀。干燥该沉淀，得到甲臜化合物1。

3.甲臜化合物1的纯化和四唑化合物1的合成

使上述2.的甲臜化合物1溶解于ro水10ml中，制作甲臜化合物1溶液。在一次性色谱柱(大小：20cm×5cm)中填充柱色谱用填充剂(nacalaitesque株式会社制，cosmosil40c18-prep)，安装于色谱柱分离提取系统(日本buchi公司制，商品名：sepacore)。使用该色谱柱系统，将甲臜化合物1溶液纯化。除去采取的馏分的溶剂，在得到的固体成分中加入甲醇15ml、9.6n的hcl250μl、15％亚硝酸乙酯(ch3ch2no2)-乙醇溶液5ml，在室温(25℃)遮光下搅拌72小时。

4.四唑化合物1的回收

向上述3.的反应溶液中加入二乙醚，使四唑化合物1沉淀。对该沉淀进行离心分离，除去上清液后，进一步用二乙醚清洗。使得到的沉淀在通风橱中干燥，得到四唑化合物1(120mg，收率：11.8质量％)。对如此得到的四唑化合物1测定最大吸收波长(λmax)，结果为630nm。

实施例1～6、比较例1：血糖仪传感器中的评价

＜涂布液(涂覆液)的制备＞

首先，以成为下述表1所示的组成的方式制备含有作为氧化还原酶的葡萄糖脱氢酶(gdh-fad)(表中记为“gdh”)、作为散射光调节剂的1,3-苯二磺酸二钠(dsb，alfaaear制)、作为显色色素的上述制造例1中合成的四唑化合物1、作为过渡金属化合物的乙酸镍(表中记为“乙酸ni”)以及作为ph调节剂的氢氧化钠水溶液(适量)的试剂水溶液(ph6.5～7)，得到涂布液1～6(分别为实施例1～6)和比较涂布液1(比较例1)。

[表11

表1:血糖值测定试剂的制备

＜血糖值测定芯片的制作＞

1.试剂片的制备

使用喷墨装置(microjet株式会社制，labojet-500bio)，以±5μm以内的图案精度用1pl～1000pl的喷出液量的喷头将上述＜涂布液(涂覆液)的制备＞中制备的涂布液1～6和比较涂布液1分别涂布在载置于平台上的聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)膜(制造公司名：东丽株式会社，商品名：lumirrort60，厚度188μm，8mm×80mm)上，在常温(25℃)下干燥1晩。干燥后，将形成有试剂层的pet膜切成规定的大小而制作试剂片。

2.涂布的各成分量的测定

如下求出涂布于上述1.中制作的各试剂片的各成分量(浓度)。详细而言，以组装于后述的血糖仪传感器(芯片形状)的状态，向芯片内加入1000μl的ro水使血糖值测定试剂完全溶解，制成样品。利用uplc(超高效液相色谱shimadzunexerax2，株式会社岛津制作所制)求出该样品中的显色试剂浓度。由涂布于各芯片的显色试剂的质量(mg)求出向试剂部空间流入ro水而溶解时的显色试剂(四唑化合物1)的浓度，将其结果示于表2。另外，由上述表1中记载的涂布液(涂覆液)的浓度比对显色色素以外的成分算出ro水流入试剂部空间而充满试剂部空间体积时(即溶解时)的试剂成分的浓度，将其结果示于表2。应予说明，每一个血糖值测定芯片中的各成分的质量可以由试剂部空间体积和下述表2中记载的浓度算出。

[表2]

表2:血糖值测定试剂的各成分量(ro水)

3.血糖仪传感器(血糖值测定芯片)的组装

图11a是表示血糖仪传感器(血糖值测定芯片)的组装的示意图。图11a中，制作在作为第2基材的pet膜5(制造公司名：3m公司，商品名：亲水处理聚酯膜9901p，厚度：100μm)的两侧形成双面胶带(制造公司名：日东电工株式会社，商品名：双面粘性胶带，厚度：50μm)4作为隔离件和粘接部的芯片基座。在该芯片基座上以试剂层(试剂涂布面)3与成为芯片基座的pet膜5对置且成为流路6的中心的方式贴附上述1.中制作的试剂片2。

图11a中，使试剂片2的试剂涂布面3朝下面而设置在配置于pet膜5的两端的作为隔离件的一对双面胶带4上。接下来，准备与pet膜5相同形状的pet膜。在pet膜的与试剂片2对置的面的长边方向两侧贴上双面胶带(制造公司名：3m公司，商品名；双面粘性胶带，厚度：80μm)(未图示)，制成pet膜7。将该pet膜7从试剂片2的上方贴在隔离件和双面胶带(粘合部)4上，由此得到内表面的血液流路6为阶梯形状的血糖值测定芯片1～6(分别为实施例1～6)和比较血糖值测定芯片1(比较例1)。图11b是血糖仪传感器(测定芯片)的纵向或横向的截面图。其中，作为图11b所示的流路部(流路6)的流路长度(l1)、流路宽度(w)、流路厚度(t1)和相当于试剂涂布部的试剂部(测定部)3的流路长度(l2)、流路宽度(w)、流路厚度(t2)，采用下述表3的尺寸。图11b中，血糖仪传感器(测定芯片)的流路由配置有试剂涂布面的试剂部和未在流路配置试剂涂布面的流路即流路部构成。

[表3]

这里，测定部的容积是划分流路6的内壁中被形成有由血糖值测定试剂构成的试剂层3的流路内的面即试剂形成面和在试剂层3的厚度方向与试剂层3对置的对置面夹持的间隙(即，血糖值测定试剂与血液成为溶解状态的区域)的容积b。即，容积b在图11b中为由l2×w×t2算出的空间。

应予说明，作为流路部的与芯片厚度方向正交的方向(流路长边方向)的长度l1，没有特别限制，可根据目的适当地选择，但优选为5～10mm。其中，若长度l1较长，则在向成分测定装置安装(插入)容易的方面和减少干扰光进入光学测定部的方面有利。若长度l1较短，则在能够减少检测样品量方面有利。因此，可以考虑向成分测定装置的安装(插入)的容易性、干扰光的影响和检测样品量的平衡来决定长度l1的上限和下限。作为试剂部的流路的与芯片厚度方向正交的方向(流路长边方向)的长度l2，没有特别限制，可根据目的适当地选择，但优选为1～4mm。其中，长度l2较长因在长度方向获取更大的照射斑点的面积而能够以良好的精度进行测定，是有利的，较短在能够减少检测样品量的方面有利。因此，从测定精度和检测样品量的平衡考虑来决定长度l2的上限和下限。

在制作的各血糖仪传感器的流路入口将人全血样品1(ht20、bg0)(血细胞比容值20％、葡萄糖浓度0mg/dl)、全血样品2(ht20、bg400)(血细胞比容值20％、葡萄糖浓度400mg/dl)、全血样品3(ht40、bg0)(血细胞比容值40％、葡萄糖浓度0mg/dl)、全血样品4(ht40、bg400)(血细胞比容值40％、葡萄糖浓度400mg/dl)、全血样品5(ht60、bg0)(血细胞比容值60％、葡萄糖浓度0mg/dl)和全血样品6(ht60、bg400)(血细胞比容值60％、葡萄糖浓度400mg/dl)分别点涂4μl。应予说明，上述表2中示出的血糖值测定试剂的各成分量是向血糖仪传感器内导入血细胞比容值为0的样品(葡萄糖浓度0mg的水溶液，即ro水)时的容积b的空间的浓度。如上所述，各成分量需要考虑血液样品的血细胞比容值而换算成血浆中的数值。例如，实施例1的乙酸镍在血细胞比容值为0的样品中为62.5mm，因此在血细胞比容值为40的全血样品中，实施例1的乙酸镍约为104.17(＝62.5×1/0.6)mm。将上述各全血样品中的换算后的试剂的各成分量示于下述表4～6(血细胞比容值分别为20(ht20)、40(ht40)和60(ht60))。

[表4]

表4：血糖值测定试剂的各成分量(ht20)

[表5]

表5：血糖值测定试剂的各成分量(ht4o)

[表6]

表6:血糖值测定试剂的各成分量(ht6o)

各全血样品如下制作：首先，在装入了肝素的采血管中采集全血，测定该全血样品的血细胞比容值，以适当地加入预先分离得到的血浆或者取出全血样品的血浆使全血样品的血细胞比容值成为规定的值(ht20、40和60)的方式制备全血样品。接下来，在调节了上述血细胞比容值的全血样品中适当地添加高浓度葡萄糖溶液(40g/dl)，制作血中葡萄糖浓度为400mg/dl的全血样品(ht20、40和60、400mg/dl)。另外，与上述同样地制作血中葡萄糖浓度为100mg/dl的全血样品(ht20、40和60)。向上述各血细胞比容值的全血样品(ht20、40和60、100mg/dl)1ml中添加0.1mg的葡萄糖氧化酶(东洋纺株式会社制，glo-201)。添加后在室温(25℃)放置5分钟，制作血中葡萄糖浓度为0mg/dl的全血样品(ht20、40和60、0mg/dl)。

在将各全血样品1～6分别点涂到上述制作的芯片的试剂部9秒后，根据上述＜光谱解析＞中记载的方法，使用光纤分光光度计，测定400～1000nm的波长范围的光谱。

基于这些光谱，算出平均透射率差，将结果示于表7。这里，“平均透射率差”是分析样品(试剂混合后)在波长范围850～1000nm的平均透射率(avetanalyte(％))与全血样品(试剂混合前)在波长范围850～1000nm的平均透射率(avetsample(％))的差(＝avetanalyte(％)－avetsample(％))。

另外，算出关于全血样品3、4的透射率差(绝对值)，将结果示于表8。这里，“透射率差(绝对值)”是分析样品(试剂混合后)在波长范围850～1000nm的透射率(tanalyte(％))与全血样品(试剂混合前)在波长范围850～1000nm的透射率(tsample(％))的差(＝tanalyte(％)－tsample(％))的绝对值中的最大值。

另外，将使用实施例1的试剂的全血样品(ht20)1、2的光谱示于图1，将使用实施例1的试剂的全血样品(ht40)3、4的光谱示于图2，将使用实施例1的试剂的全血样品(ht60)5、6的光谱示于图3，将使用比较例1的试剂的全血样品(ht20)1、2的光谱示于图4，将使用比较例1的试剂的全血样品(ht40)3、4的光谱示于图5，将使用比较例1的试剂的全血样品(ht60)5、6的光谱示于图6。应予说明，图中，“t％”表示“透射率(％)”。

根据这些结果，研究出通过使用实施例1～6的试剂，与使用比较例1的试剂的情况相比较，能够显著减少红血球内外的平均透射率差。即，能够使试剂混合后的分析样品中产生的散射光与生物试样中产生的散射光成为接近的状态。因此，通过使用实施例1～6的试剂，减少来自散射光的基线变动的影响，能够以高精度测定生物试样中的分析对象物浓度。本方法在采用基于血细胞比容值、血色素量等血液的信息的校正时，能够进一步提高精度。另外，根据表8的结果，表明了使用本发明的试剂时，在850～1000nm的整个波长范围内，透射率差为10％以内(即，在上述整个波长范围内试剂前后的散射光实质上相同)。

实施例7～12、比较例2：溶解性的评价

如下评价血细胞比容值为60％的全血样品的溶解性。与上述实施例1～6、比较例1同样地制作血糖值测定芯片7～12(分别为实施例7～12)和比较血糖值测定芯片2(比较例2)。

在制作的各血糖值测定芯片的流路入口点涂血浆2μl。使用实际的全血样品时，因红血球的存在实质上难以确认溶解性。因此，假设点涂了血细胞比容值为60％的全血样品5μl中含有的血浆(2μl)的情况评价溶解性。通过目视观察点涂该血浆9秒后的试剂的溶解状态。将结果示于下述表9。应予说明，表中，〇表示试剂完全溶解，×表示存在试剂的溶解残留。

[表9]

试剂的溶解状态、实施例、比较例

本申请基于2018年3月7日申请的日本专利申请号2018-040887号，以参照的方式整体引入其公开内容。

符号说明

1血糖仪传感器(测定芯片)、

2试剂片、

3试剂涂布面、

4双面胶带、

5pet膜、

6流路、

7pet膜、

10血糖仪、

12测定用芯片、

14测定部、

16装置主体、

18芯片主体部、

20空洞部、

20a前端口部、

20b基端口部、

22长边、

22a上侧长边、

22b下侧长边、

24短边、

24a前端边、

24b基端边、

26试剂、

28测定对象部、

30板片、

32隔离件、

40壳体、

42控制部、

44箱体部、

46测光部、

48电源按钮、

50操作按钮、

52显示器、

54弹出杆、

56弹出针、

56a棒部、

56b接受部、

58插入孔、

58a插入开口部、

59测定用孔部、

60芯片安装部、

60a凸缘部、

62壁部、

64元件收容空间、

66导光部、

68发光元件、

70发光部、

72受光元件、

74受光部、

76螺旋弹簧。