细胞外囊泡的分离方法、以及检测细胞外囊泡表面标志物的方法和试剂盒与流程

本发明涉及生物监测领域，具体而言，涉及一种细胞外囊泡的分离方法、以及检测细胞外囊泡表面标志物的方法和试剂盒。

背景技术：

细胞外囊泡，是指由脂质双分子层包绕形成的球状膜性囊泡，其由细胞天然分泌并进入体液循环的微小囊泡，包括外泌体、膜微粒、微囊泡及凋亡小体等。这些细胞外囊泡的表面携带了许多能够预测疾病或反映疾病进程的蛋白标志物，是实现液体活检的重要检测对象。然而，细胞外囊泡在血液中的半衰期只有几个小时，同时来自病变组织的细胞外囊泡占比很小，因此需要极高灵敏的方法进行检测。

目前常采用的一种检测方法为:采用cd63、cd81等细胞外囊泡特异性抗体，从样品中捕获细胞外囊泡，再依次加入生物素标记的标志物抗体、链霉亲和素-辣根过氧化物酶和底物，进行酶促显色检测。然而，由于采用cd63、cd81等特异性抗体从样品中捕获细胞外囊泡的效率有限，且细胞外囊泡表面标志物的含量及其微小，导致这种酶促显色检测的灵敏度有限，不能对其进行准确检测。

鉴于此，特提出本申请。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种细胞外囊泡的分离方法，这种方法通过利用磷脂酰丝氨酸捕获分子特异性的结合细胞外囊泡的磷脂酰丝氨酸来捕获细胞外囊泡，分离效率高、特异性强。

本发明的第二目的在于提供一种细胞外囊泡表面标志物的检测方法，该方法通过利用偶联有荧光素酶的标志物抗体实现细胞外囊泡表面标志物的定量检测，灵敏度高。

本发明的第三目的在于提供一种用于检测细胞外囊泡表面标志物的试剂盒。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种细胞外囊泡的分离方法，其包括：

将预处理后的生物样品与磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白混合孵育后，再加入能与磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白中的亲和标签特异性结合的固相载体，形成载体-细胞外囊泡复合物；

再将载体-细胞外囊泡复合物从生物样品中分离。

一种细胞外囊泡表面标志物的检测方法，其包括：

将采用权利要求1～5任一项的分离方法得到的载体-细胞外囊泡复合物与偶联有荧光素酶的标志物抗体混合孵育，得到载体-细胞外囊泡-荧光素酶复合物；

裂解载体-细胞外囊泡-荧光素酶复合物，并加入荧光素酶的底物，检测荧光素酶催化的发光强度。

一种用于检测细胞外囊泡表面标志物的试剂盒，其包括：荧光素酶-抗体融合蛋白、磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白以及固相载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

相比于现有技术中采用cd63、cd81等细胞外囊泡特异性抗体从样品中捕获细胞外囊泡的方法，本申请中提供的这种细胞外囊泡的分离方法，通过利用磷脂酰丝氨酸捕获分子特异性的结合细胞外囊泡的磷脂酰丝氨酸来捕获细胞外囊泡，由于细胞外囊泡表面的的磷脂酰丝氨酸的含量远多于cd63、cd81等分子，本发明的这种方法的分离效率高、特异性强。

相比于现有技术中用生物素标记的标志物抗体、链霉亲和素-辣根过氧化物酶和底物进行酶促显色检测的方法，本申请提供的这种细胞外囊泡表面标志物的检测方法，由于荧光素酶的发光效率极高，特别是gaussialuciferase的效率是普通萤火虫荧光素酶的1000倍，因此实现优于普通酶促显色法的高灵敏检测。此外，通过选择不同底物或不同波长的荧光素酶，实现两种及以上标志物的同时检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明分子间相互结合的示意图。

图2为用本发明中的乳粘素c1/c2-fc、或非特异性igg、或cd63、或cd81，分别与已提纯的10μg荧光素酶标记的细胞外囊泡混合孵育后分离得到的细胞外囊泡的质量(平均值±标准误差)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

第一方面，本实施方式提供一种细胞外囊泡的分离方法。

其中，细胞外囊泡为细胞所分泌、脱落或破碎后产生的，具有脂质膜结构。细胞外囊泡包括外泌体(40～150nm)、微囊泡(100～1000nm)、凋亡小体和微粒(100～1000nm)。本实施方式中的生物样品包括血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、汗液、精液、组织积液、细胞或组织培养物上清液。

该分离方法包括以下步骤：

步骤1：将预处理后的生物样品与磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白混合孵育，形成细胞外囊泡-磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白复合物。

由于细胞外囊泡表面具有大量的磷脂酰丝氨酸，将生物样品与磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白混合孵育时，磷脂酰丝氨酸捕获分子与细胞外囊泡表面的磷脂酰丝氨酸特异性结合，从而将亲和标签偶联在细胞外囊泡表面，形成细胞外囊泡-磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白复合物，便于后续的固相载体分离步骤。

进一步地，该磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白中的磷脂酰丝氨酸捕获分子包括乳粘素(lactadherin，也称mfge8)、含有乳粘素的c1和/或c2结构域的多肽、膜粘蛋白-v(annexinv)中的至少一种。优选地，该磷脂酰丝氨酸捕获分子为人源乳粘素的c1和/或c2结构域的多肽、或膜粘蛋白-v，这三种捕获分子能与磷脂酰丝氨酸特异性高效结合，从而提高细胞外囊泡的分离效率。

进一步地，亲和标签包括iggfc序列、avi-tag、gst、六聚组氨酸。优选的，使用iggfc序列或avi-tag，其中avi-tag的氨基酸序列为：glndifeaqkiewhe。

进一步地，制备磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白采用常规的基因工程方法，优选的，使用大肠杆菌表达系统，利于大量生产。

进一步的，生物样品的预处理方法包括：将生物样品进行过滤或离心，以去除样品中的细胞、细胞碎片和团聚物，得到生物样品上清液。优选的，过滤时选用0.2～0.8μm的滤膜，或0.3～0.7μm的滤膜，或0.4～0.6μm的滤膜。优选地，在10000～16000g、4～25℃下离心10～30min，或者为在12000～14000g、3～7℃下离心15～25min。

进一步的，在生物样品与磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签混合孵育时的温度为4～37℃、孵育时间为10min～2h。

步骤2：再加入能与磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白中的亲和标签特异性结合的固相载体，形成载体-细胞外囊泡复合物。

进一步地，该固相载体的表面偶联有亲和分子，该亲和分子能够与亲和标签特异性结合，从而将步骤1中形成的细胞外囊泡-磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白复合物偶联在固相载体上，即形成载体-细胞外囊泡复合物，便于后续分离。

其中，亲和分子，包括proteina/g、亲和素、谷胱甘肽和ni离子中的至少一种。优选地，亲和分子为proteina/g或亲和素。

进一步地，固相载体包括磁珠、碳纳米管和聚合物微球中的至少一种。优选地，固相载体为磁珠。更为优选地，固相载体为表面偶联有proteina/g的磁珠。

步骤3：再将载体-细胞外囊泡复合物从生物样品中分离。

进一步的，将载体-细胞外囊泡复合物从生物样品中分离时，采用磁吸附法、离心法、或过滤法。

在本实施方式提供的这种分离方法中，不是采用现有技术中的针对囊泡表面广谱性抗原的抗体，而是采用能与磷脂酰丝氨酸特异性结合的乳粘素c1和/或c2结构域、膜粘蛋白v等分子。由于磷脂酰丝氨酸是细胞外囊泡磷脂双分子层的重要组成部分，含量远远超过cd63、cd81、cd9等表面广谱性抗原，因此这种方法对细胞外囊泡的分离效率更高。

第二方面，本实施方式提供一种细胞外囊泡表面标志物的检测方法。

该检测方法包括：

步骤s1：将通过上述分离方法得到的载体-细胞外囊泡复合物与偶联有荧光素酶的标志物抗体混合孵育，得到载体-细胞外囊泡-荧光素酶复合物。

进一步地，载体-细胞外囊泡复合物与偶联有荧光素酶的标志物抗体混合孵育时的温度为4～37℃、孵育时间为1～12h。

进一步地，偶联有荧光素酶的标志物抗体包括能够同时表达荧光素酶和标志物抗体的荧光素酶-抗体融合蛋白(荧光素酶与抗体在氨基酸序列上的前后位置可以互换)；当然，该偶联有荧光素酶的标志物抗体也包括通过化学方法将荧光素酶与标志物抗体偶联后的产物。

进一步地，采用基因工程中的常规方法来制备荧光素酶-抗体融合蛋白。优选的，使用大肠杆菌表达系统，利于大量生产。

进一步地，标志物抗体是能够识别细胞外囊泡表面标志物的小分子抗体，标志物抗体包括单链抗体、纳米抗体或fab片段。

进一步地，荧光素酶-抗体融合蛋白中，荧光素酶与标志物抗体之间由柔性短肽连接；优选的，柔性短肽的氨基酸序列为(ggggs)2、(ggggs)3、g(sgggg)2s、(ggs)4、(gsg)4、或a(eaaak)2a。

进一步地，较为优选的荧光素酶-抗体融合蛋白为“荧光素酶-柔性肽-单链抗体”融合蛋白。

荧光素酶来自于海肾、海萤、gaussia属、乳点水蚤属、长腹水蚤属以及oplophorus属中的至少一种。优选地，荧光素酶为gaussia荧光素酶，其与抗体的偶联方式优选为表达“荧光素酶-柔性肽-单链抗体”融合蛋白。gaussia荧光素酶的效率是普通萤火虫荧光素酶的1000倍，可大幅提高检测的灵敏度。

在该检测方法中，不是采用通常的荧光团、碱性磷酸酶、荧光素酶偶联的完整抗体，而是采用gaussia荧光素酶与单链抗体(singlechainvariablefragment，scfv)或纳米抗体(nanobody)(两者之间由柔性短肽连接)的重组融合蛋白。众所周知，荧光素酶的发光效率大于荧光团(fitc，罗丹明等)，gaussia荧光素酶的发光效率又是通常萤火虫荧光素酶的1000倍，且分子量更小。与完整抗体相比，单链抗体或纳米抗体分子量更小，易于与抗原结合，且结构简单，易于重组表达。将gaussia荧光素酶与单链抗体或纳米抗体通过柔性短肽连接成融合蛋白重组表达，其生产流程较通常的先生产抗体再偶联荧光团的方式更为简单。

步骤s2：裂解载体-细胞外囊泡-荧光素酶复合物，并加入荧光素酶的底物，检测荧光素酶催化的发光强度。

将载体-细胞外囊泡-荧光素酶复合物裂解后，使荧光素酶处于游离状态，并通过磁吸附法、离心法或过滤法除去固相载体，避免在荧光检测过程中固相载体对荧光信号产生干扰，从而提高检测的准确度。

进一步的，在裂解载体-细胞外囊泡-荧光素酶复合物时，加入0.1％～1％十二烷基硫酸钠(sds)，室温孵育10-30min。

在该检测方法中，通过将偶联有荧光素酶的标志物抗体与结合了细胞外囊泡的固相载体混合孵育，使荧光素酶-抗体将结合于载体上的细胞外囊泡，并洗脱未结合的荧光素酶；最后，加入裂解液，使荧光素酶游离出来。去除载体后，取上清，加入荧光底物，检测发光强度，并与标准曲线对比，得到细胞外囊泡上标志物的定量结果。由于荧光素酶的发光效率极高，特别是gaussia荧光素酶的发光效率是普通萤火虫荧光素酶的1000倍，因此实现优于了普通酶促显色法的高灵敏检测。此外，可以通过选择不同底物或不同波长的荧光素酶，实现两种及以上标志物的同时检测。

第三方面，本实施方式还提供一种用于检测细胞外囊泡表面标志物的试剂盒，该试剂盒可商品化，进行大规模生产。

该试剂盒，包括：荧光素酶-抗体融合蛋白、磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白以及固相载体。

进一步地，荧光素酶-抗体融合蛋白为荧光素酶-柔性肽-单链抗体；

优选地，荧光素酶为gaussia荧光素酶；

优选地，柔性肽的氨基酸序列为(ggggs)3；

进一步地，磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白中，磷脂酰丝氨酸捕获分子包括人源乳粘素的c1和/或c2结构域的多肽、或膜粘蛋白-v；亲和标签包括iggfc序列或avi-tag。

进一步地，固相载体的表面偶联有亲和分子，固相载体包括磁珠、碳纳米管和聚合物微球中的至少一种；亲和分子，包括proteina/g、亲和素、谷胱甘肽和ni离子中的至少一种。优选地，固相载体为表面偶联有proteina/g的磁珠。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：

实施例1

本实施例提供一种细胞外囊泡的分离方法，其包括：

a.通过商业化基因合成得到一段依次表达乳粘素c1/c2结构域和iggfc的dna序列(密码子优化为大肠杆菌表达)(该dna序列用于编码乳粘素c1/c2-fc蛋白，其氨基酸序列如seqidno.1所示)，并采用常规的分子克隆技术构建到pet-his质粒中，得到表达载体。通过常规的大肠杆菌表达系统，经ni柱纯化得到乳粘素c1/c2-fc融合蛋白；

b.将edta抗凝处理的肺癌病人血液于1000g的离心力、室温下离心15min，去除血液中的红细胞、白细胞、血小板等，得到血浆。将血浆进一步用孔径为0.8μm的滤膜过滤，去除其中的细胞碎片、蛋白团聚物和直径较大的囊泡，得到过滤液；

c.将1ml过滤液与2μg乳粘素c1/c2-fc融合蛋白混合，置于旋转混匀器上，于室温下孵育30min后，乳粘素c1/c2-fc融合蛋白与细胞外囊泡结合。再加入50μgproteina/g-磁珠，置于旋转混匀器上，于室温下孵育30min，形成细胞外囊泡-乳粘素c1/c2-磁珠复合物。磁力吸附细胞外囊泡-乳粘素c1/c2-磁珠复合物，弃去上清液，加入1mlpbs重悬复合物，重复三次，即得细胞外囊泡-乳粘素c1/c2-磁珠复合物。

实施例2

本实施例提供一种细胞外囊泡表面标志物的检测方法，其中，该标志物为pd-l1，检测的生物样品为血浆。

该检测方法包括：

a.通过商业化基因合成得到一段依次表达gaussia荧光素酶、(ggggs)3连接肽、pd-l1单链抗体的dna序列(密码子优化为大肠杆菌表达)(该dna序列用于编码gaussia荧光素酶-pd-l1单链抗体，其氨基酸序列如seqidno.2所示)，并采用常规的分子克隆技术构建到pet-his质粒中，得到表达载体。通过常规的大肠杆菌表达系统，经ni柱纯化得到gaussia荧光素酶-pd-l1单链抗体融合蛋白；

b.在实施例1所分离得到的细胞外囊泡-乳粘素c1/c2-磁珠复合物中，加入0.5μggaussia荧光素酶-pd-l1单链抗体，置于旋转混匀器上，于室温下孵育1h后，gaussia荧光素酶-pd-l1单链抗体结合到细胞外囊泡表面的pd-l1上。磁力吸附gaussia荧光素酶-pd-l1单链抗体-细胞外囊泡-乳粘素c1/c2-磁珠复合物，弃去上清液，加入1mlpbs重悬复合物，重复三次；

c.磁力吸附gaussia荧光素酶-pd-l1单链抗体-细胞外囊泡-乳粘素c1/c2-磁珠复合物，弃去上清液，加入100μl0.5％sds裂解液，重悬沉淀，室温下静置20min；

d.磁力吸附磁珠，取50μl上清液加入96孔板中，置于带注射泵的酶标仪上待测。设置酶标仪参数：每孔加入50μl腔肠素(200ng/ml)，等待时间2s，曝光时间10s。与参考样品比对，得出1ml血浆中细胞外囊泡表面pd-l1的含量情况。

实施例3

本实施例提供一种细胞外囊泡的分离方法，其包括：

a.通过商业化基因合成得到一段依次表达膜粘蛋白-v和iggfc的dna序列(密码子优化为大肠杆菌表达)(该dna序列用于编码膜粘蛋白-v-iggfc，其氨基酸序列如seqidno.3所示)，并采用常规的分子克隆技术构建到pet-his质粒中，得到表达载体。通过常规的大肠杆菌表达系统，经ni柱纯化得到膜粘蛋白-v-fc融合蛋白；

b.将乳腺癌病人血清用孔径为0.8μm的滤膜过滤，去除其中的细胞碎片、蛋白团聚物和直径较大的囊泡，得到过滤液；

c.将1ml过滤液与2μg膜粘蛋白-v-fc融合蛋白混合，置于旋转混匀器上，于室温下孵育30min后，膜粘蛋白-v-fc融合蛋白与细胞外囊泡结合。再加入50μgproteina/g-碳纳米管，置于旋转混匀器上，于室温下孵育30min，形成细胞外囊泡-膜粘蛋白-v-碳纳米管复合物。离心后，弃去上清液，加入1mlpbs重悬复合物，重复三次，即得细胞外囊泡-膜粘蛋白-v-碳纳米管复合物。

实施例4

本实施例提供一种细胞外囊泡表面标志物的检测方法，其中，该标志物为her2，检测的生物样品为血清。

该检测方法包括：

a.通过商业化基因合成得到一段依次表达gaussia荧光素酶、g(sgggg)2s连接肽、her2单链抗体的dna序列(密码子优化为大肠杆菌表达)、(该dna序列用于编码gaussia荧光素酶-her2单链抗体，其氨基酸序列如seqidno.4所示)，并采用常规的分子克隆技术构建到pet-his质粒中，得到表达载体。通过常规的大肠杆菌表达系统，经ni柱纯化得到gaussia荧光素酶-her2单链抗体融合蛋白；

b.在实施例1所分离得到的细胞外囊泡-膜粘蛋白-v-碳纳米管复合物中，加入0.5μggaussia荧光素酶-her2单链抗体，置于旋转混匀器上，于室温下孵育1h后，gaussia荧光素酶-her2单链抗体结合到细胞外囊泡表面的her2上。离心后，弃去上清液，即得gaussia荧光素酶-her2单链抗体-细胞外囊泡-膜粘蛋白-v-碳纳米管复合物，加入1mlpbs重悬复合物，重复三次；

c.在gaussia荧光素酶-her2单链抗体-细胞外囊泡-乳粘素-碳纳米管复合物中，加入100μl0.5％sds裂解液，重悬沉淀，室温下静置20min；

d.离心去除碳纳米管，取50μl上清液加入96孔板中，置于带注射泵的酶标仪上待测。设置酶标仪参数：每孔加入50μl腔肠素(200ng/ml)，等待时间2s，曝光时间10s。与参考样品比对，得出1ml血清中细胞外囊泡表面her2的含量情况。

实施例5

本实施例提供一种细胞外囊泡的分离方法，其包括：

a.通过商业化基因合成得到一段依次表达乳粘素和avi-tag的dna序列(密码子优化为大肠杆菌表达)、(该dna序列用于编码乳粘素-avi-tag，其氨基酸序列如seqidno.5所示)，并采用常规的分子克隆技术构建到pet-his质粒中，得到表达载体。通过常规的大肠杆菌表达系统，经ni柱纯化得到乳粘素-avi-tag融合蛋白。其中avi-tag已被生物素连接酶bira所生物素化；

b.将膀胱癌病人尿液于1000g的离心力、室温下离心15min，去除尿液中的细胞、较大的颗粒物等。进一步用孔径为0.8μm的滤膜过滤，去除其中的细胞碎片、蛋白团聚物和直径较大的囊泡，得到过滤液；

c.将10ml过滤液用100kd超滤管浓缩到1ml，与2μg乳粘素-avi-tag融合蛋白混合，置于旋转混匀器上，于室温下孵育30min后，乳粘素-avi-tag融合蛋白与细胞外囊泡结合。再加入50μg亲和素-聚合物微球，置于旋转混匀器上，于室温下孵育30min，形成细胞外囊泡-乳粘素-聚合物微球复合物。离心后，弃去上清液，加入1mlpbs重悬复合物，重复三次，即得细胞外囊泡-乳粘素-聚合物微球复合物。

实施例6

本实施例提供一种细胞外囊泡表面标志物的检测方法，其中，该标志物为ctla-4，检测的生物样品为尿液。

该检测方法包括：

a.通过商业化基因合成得到一段依次表达ctla-4纳米抗体、(ggs)4连接肽、gaussia荧光素酶的dna序列(密码子优化为大肠杆菌表达)、(该dna序列用于ctla-4纳米抗体-gaussia荧光素酶，其氨基酸序列如seqidno.6所示)，并采用常规的分子克隆技术构建到pet-his质粒中，得到表达载体。通过常规的大肠杆菌表达系统，经ni柱纯化得到ctla-4纳米抗体-gaussia荧光素酶融合蛋白；

b.在实施例1所分离得到的细胞外囊泡-乳粘素-聚合物微球复合物中，加入0.5μgctla-4纳米抗体-gaussia荧光素酶，置于旋转混匀器上，于室温下孵育1h后，ctla-4纳米抗体-gaussia荧光素酶结合到细胞外囊泡表面的ctla-4上。离心后，弃去上清液，即得聚合物微球-乳粘素-细胞外囊泡-ctla-4纳米抗体-gaussia荧光素酶复合物，加入1mlpbs重悬复合物，重复三次；

c.在聚合物微球-乳粘素-细胞外囊泡-ctla-4纳米抗体-gaussia荧光素酶复合物中，加入100μl0.5％sds裂解液，重悬沉淀，室温下静置20min；

d.离心去除聚合物微球，取50μl上清液加入96孔板中，置于带注射泵的酶标仪上待测。设置酶标仪参数：每孔加入50μl腔肠素(200ng/ml)，等待时间2s，曝光时间10s。与参考样品比对，得出10ml尿液中细胞外囊泡表面ctla-4的含量情况。

实验例1

本实验例提供了本发明提供细胞外囊泡分离方法与现有技术中采用cd63、cd81抗体分离的效率的比较。

一、实验过程：

a.在hek293t细胞中稳定转染pdisplay-gluc，从而在细胞膜上表达gaussia荧光素酶，再从细胞培养液用金标准的超速离心法分离细胞外囊泡，得到gaussia荧光素酶标记的细胞外囊泡标准品，并进行蛋白定量。

b.使用1μg本发明所述乳粘素c1/c2-fc，或1μgcd63抗体，或1μgcd81抗体，或1μg非特异性igg(作为对照)，与10μggaussia荧光素酶标记的细胞外囊泡标准品混合，置于旋转混匀器上，于室温下孵育30min。再分别加入50μgproteina/g-磁珠，置于旋转混匀器上，于室温下孵育30min，形成细胞外囊泡-磁珠复合物。磁力吸附细胞外囊泡-磁珠复合物，弃去上清液，加入1mlpbs重悬复合物，重复三次。加入100μl0.5％sds裂解液，重悬沉淀，室温下静置20min。

c.磁力吸附磁珠，取50μl上清液加入96孔板中，置于带注射泵的酶标仪上待测。设置酶标仪参数：每孔加入50μl腔肠素(200ng/ml)，等待时间2s，曝光时间10s。与标准样品比对，得出所分离的细胞外囊泡的量。

二、实验结果

结果如图2所示，采用cd63、cd81抗体分离出的细胞外囊泡的量分别为5μg和3.8μg左右，而采用本发明提供的技术，以乳粘素c1/c2-fc分离出的细胞外囊泡的量高达8.5μg左右。由此可见，使用乳粘素c1/c2-fc来分离细胞外囊泡，能够获得比现有技术更好的分离效率。

实验例2

本实验例提供了本发明提供的细胞外囊泡检测方法与现有技术中采用生物素标记的标志物抗体、链霉亲和素-辣根过氧化物酶和底物，进行酶促显色检测方法的比较。

一、实验方法

收集her2阳性的乳腺癌病人血浆，用孔径为0.8μm的滤膜过滤。将1ml过滤液与2μg乳粘素c1/c2-fc融合蛋白混合，置于旋转混匀器上，于室温下孵育30min后，乳粘素c1/c2-fc融合蛋白与细胞外囊泡结合。再加入50μgproteina/g-磁珠，置于旋转混匀器上，于室温下孵育30min，形成细胞外囊泡-乳粘素c1/c2-磁珠复合物。磁力吸附细胞外囊泡-乳粘素c1/c2-磁珠复合物，弃去上清液，加入1mlpbs重悬复合物，重复三次，即得细胞外囊泡-乳粘素c1/c2-磁珠复合物。

随后采用本发明的方法、以及市售的her2elisa检测试剂盒对该细胞外囊泡表面her2含量进行检测：

a.本发明的方法检测：加入0.5μggaussia荧光素酶-her2单链抗体，置于旋转混匀器上，于室温下孵育1h后，gaussia荧光素酶-her2单链抗体结合到细胞外囊泡表面的her2上。离心后，弃去上清液，加入1mlpbs重悬复合物，重复三次。加入100μl0.5％sds裂解液，重悬沉淀，室温下静置20min。磁力吸附磁珠，取50μl上清液加入96孔板中，置于带注射泵的酶标仪上待测。设置酶标仪参数：每孔加入50μl腔肠素(200ng/ml)，等待时间2s，曝光时间10s。

b.elisa试剂盒检测：采用市售的her2elisa检测试剂盒(杭州联科生物公司生产)进行对比实验。向a中所得的细胞外囊泡-磁珠复合物，加入试剂盒包含的生物素标记的her2抗体，用试剂盒包含的洗涤液洗三次后，加入试剂盒包含的链霉亲和素-辣根过氧化物酶。洗三次后，加入底物，进行酶促显色。

二、实验结果：

采用本发明提供的方法，对细胞外囊泡表面her2含量进行检测，通过与标准样品比对，得出病人血浆中的细胞外囊泡表面her2含量为3.2±1.7ng/ml。而采用市售的her2elisa检测试剂盒进行检测(即采用生物素标记的标志物抗体、链霉亲和素-辣根过氧化物酶和底物，进行酶促显色检测方法)，在进行酶促显色后结果读值很低，与标准曲线比对，得出her2含量小于0.1ng/ml。由此可见，本申请提供的这种检测方法相比于普通酶促显色法，灵敏度显著提高。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

sequencelisting

<110>周明、马英淙、范松、李劲松

<120>细胞外囊泡的分离方法、以及检测细胞外囊泡表面标志物的方法和试剂盒

<160>6

<170>patentinversion3.5

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