用于诊断粘多糖病Ⅱ型的生物标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体而言，涉及用于诊断粘多糖病ⅱ型的生物标志物及其应用。

背景技术：

粘多糖病ⅱ型(mucopolysaccharidosistypeⅱ，mpsⅱ)，即hunter综合征，为我国报道最为常见的mps类型，是由于溶酶体内艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，ids)缺陷，从而导致分解不完全的硫酸皮肤素(dermatinsulfate，ds)和硫酸类肝素(heparansulfate，hs)在全身各组织和器官中累积的伴x隐性遗传的代谢性疾病。该病的临床表现为全身骨骼发育不良、面容粗陋、肝脾肿大等。重型患儿多于18-36个月时发病，青春期时死亡，预后十分不良。由于早期诊断，特别是对婴儿诊断的不及时，会造成患者的发育、神经、生理的不可逆改变^[1]。同时，该病的致病机制尚未得到完全阐明，阻碍了疾病治疗方法的探索。因此，亟需简单可靠的诊断方法辅助早期诊断，并为寻求新的治疗方法提供实验基础。

蛋白质组学研究不仅有助于寻找特异性分子标志物，也能为疾病机制的阐明提供理论根据。尿液蛋白约30％来源于血浆蛋白，包含多种生物标志，可以间接反映血浆蛋白的组成。采用尿液作为蛋白质组学的研究对象具有以下优点：首先尿液收集是非侵入性的，便于多次留取，适合以此作为监测疾病进展和疗效的反映；其次尿液中包含的小分子蛋白和多肽不需过多的处理步骤便可直接分析，避免了由蛋白水解所带来的变异性与复杂性，；并且尿液是一种稳定的样本，因其储存在膀胱的过程中已被蛋白水解酶水解完全，所以合理冻存后蛋白成分不会发生太大改变。因此，利用蛋白质组学技术来检测患者尿液中的疾病标志物具有较强的可操作性与可行性。

双向凝胶电泳(twodimensionalgelelectrophoresis，2-de)是应用最为广泛的蛋白质复合物分离技术。第一向为等点聚焦电泳(isoelectricfocusingelectrophoresis，ife)，将蛋白质按等电点分离；第二向为聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，sds-page)，将蛋白质按分子量大小分离。经过近40年的发展，2-de仍然是蛋白质分析中的一项重要技术。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，maldi-tof-ms)技术，将电离的样品从离子源转送到质量分析器，根据飞行时间得到其分子量。该方法的优势在于高通量和高灵敏度，因此适用于分析微量蛋白质。

技术实现要素：

本发明通过2-de联合maldi-tof-ms方法，研究尿液中与mpsⅱ型相关的差异蛋白，寻找该病的特异性分子标志物，为其早期诊断，监测预后及寻求新的治疗方法提供研究依据，并为探讨该病的发生机制提供实验基础。

本发明首先涉及一组蛋白标志物在制备区分健康人和粘多糖病ⅱ型(mucopolysaccharidosistypeⅱ，mpsⅱ)患者的诊断试剂中的应用；

所述的蛋白标志物是：α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，aat)，gm2激活剂(gm2activator，gm2a)及脂质运载蛋白型前列腺素d合成酶(lipocalin-typeprostaglandindsynthase，l-pgds)；

更优选的，所述的蛋白标志物是尿液中的α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，aat)，gm2激活剂(gm2activator，gm2a)及脂质运载蛋白型前列腺素d合成酶(lipocalin-typeprostaglandindsynthase，l-pgds)；

所述的应用指单独或任意组合的制备所述的诊断试剂。

本发明还涉及一种检测粘多糖病ⅱ型(mucopolysaccharidosistypeⅱ，mpsⅱ)的试剂盒，所述的检测试剂盒中包括检测单独或任意组合的所述蛋白标志物的检测试剂，所述的检测试剂包括但不限于：

(1)特异性结合所述蛋白标志物的抗体，所述的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、功能性抗体片段、抗体fab区，纳米抗体、嵌合抗体、多特异性抗体等；

(2)特异性结合所述蛋白标志物的配体蛋白或多肽；

(3)特异性识别所述蛋白标志物的非蛋白类化合物；

优选的，所述的试剂盒是，

(1)酶联免疫法检测试剂盒；

(2)胶体金试纸检测试剂盒；

(3)化学发光检测试剂盒；

所述的蛋白标志物是：α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，aat)、gm2激活剂(gm2activator，gm2a)及脂质运载蛋白型前列腺素d合成酶(lipocalin-typeprostaglandindsynthase，l-pgds)；

更优选的，所述的蛋白标志物是尿液中的α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，aat)，gm2激活剂(gm2activator，gm2a)及脂质运载蛋白型前列腺素d合成酶(lipocalin-typeprostaglandindsynthase，l-pgds)。

附图说明

图1、尿样的2d凝胶：(1a，1b，1c)为健康人对照样品，(2d，2e，2f)为mpsⅱ患者样品。

图2、采用elisa法检测mpsⅱ和正常尿液中3种蛋白质的含量，2a为、2b为、2c分别为α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，aat)、gm2激活剂(gm2activator，gm2a)及脂质运载蛋白型前列腺素d合成酶(lipocalin-typeprostaglandindsynthase，l-pgds)。

图3、三种蛋白质的auc曲线下面积图，3a为、3b为、3c分别为α1-抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，aat)、gm2激活剂(gm2activator，gm2a)及脂质运载蛋白型前列腺素d合成酶(lipocalin-typeprostaglandindsynthase，l-pgds)。

具体实施方式

实施例1、收集mpsⅱ患者和健康指标的尿样，通过2d-page结合maldi-tof/tof鉴定差异表达蛋白。

1、丙酮法沉淀蛋白：

(1)在样品中加入3-5倍体积的含丙酮溶液(含0.07％的β巯基乙醇)，-20℃2hr或静置过夜；

(2)12000g低温离心5min，80％丙酮(含0.07％的β巯基乙醇)清洗3次，加入裂解液适量，低温超声促溶5min，4℃静置2hr以上。

2、bradford法蛋白样品定量：

bradford工作液配方为(500ml)：(1)425ml双蒸水、(2)15ml95％乙醇、(3)30ml85％磷酸、(4)30mlbradford储液(100mg考马斯亮蓝+50ml95％乙醇+100ml85％正磷酸，加双蒸水定容至1000ml，4℃保存)，过滤后使用。

表1、蛋白标准液和样品配方表

每个样品均加入1mlbradford工作液，混匀，静置5min，测定a595吸光度

3、双向电泳流程

3.1、第一向固相ph梯度等电聚焦电泳

3.1.1、计算样品体积(银染120ug，考染1.0mg)，加入dtt9ul，ipgbuffer2.25ul，以重泡涨液补齐到450ul，votex混合均匀，高速离心5min待用。

3.1.2、将重泡涨液均匀地加入到泡涨盘的凹槽中，取24cmipg胶条，撕掉表面的保护膜，胶面向下覆盖于泡涨盘的凹槽中，表面铺满覆盖油drystripcoverfluid，静置过夜(室温12－16hr，避免气泡)。

3.1.3、选用清洗好的ief槽holder中，将泡涨好的胶条胶面向上静置于槽中，两边覆盖湿润的滤纸片，铺满覆盖油，将电极加在滤纸条(每边加80ul超纯水)。(如聚焦过夜，中途应补加覆盖油)。

3.1.4、以酒精棉球清理ipgphor的金属电极表面，干燥后将数个胶槽平行放置于等电聚焦仪上(注意电极位置)。

3.1.5、设置聚焦参数(温度20℃，电流保护：50ua/strip，24cm胶一般需要23～24hr)。

3.2、第二向垂直平板sds—page

3.2.1、制胶：t＝13％(amresco24cm胶板，x2x4)配方如下表2所示

表2、sds-page胶配方

配制时加入aps和temed时都应同时搅拌，以防止胶凝结不均。

3.2.2、配置好灌胶槽，将胶灌入槽中，灌胶时应迅速，连续，几乎与板面上沿平齐时停止，立即用乙醇(水饱和正丁醇的效果更好)压胶，乙醇干后可加少量水。(灌第二块胶时注意导流棒不要接触到小块玻璃的上沿，以防止胶漏出模具)。室温放置直到使用，(凝固后可加水用保鲜膜覆盖)4℃保存过夜。

3.2.3、平衡：2n个长的带塞试管，各加入8ml平衡液，其中一半各加入160ul的dtt，另一半稍后再加入0.148g碘乙酰铵。从holder中取出ipg胶条，胶面向上置于润湿的滤纸上，在干滤纸上蹭去胶条背面和两边的覆盖油，背面贴壁置于盛有含dtt的平衡液的试管中，轻柔震荡15min，擦干，换入含碘乙酰胺的平衡液的试管中。擦去背面和两侧的平衡液，将胶条剪掉两头突出的塑料片，轻推入两玻璃板的夹层中，但应小心勿使胶面被接触。适当的赶出气泡。取3ulmarker点在2mm见方的滤纸片上，置于正极端。斜置胶板，在一侧加入熔化的封胶溶液尽快赶尽气泡。

3.2.4、将胶板转移到电泳仪中，再次加琼脂糖封胶液封胶。冷却后加入上下电极缓冲液，连通恒温水浴20℃(电泳前预冷电泳液)。电泳时恒功率4w40min，加大功率至10w，待溴酚蓝下沿涌动至玻璃板下沿时即可停止电泳。扣出两边的封条，翘起玻璃板，取出胶块

3.3、染色

取出凝胶板，置于固定染色液中至少2hr，弃固定液，换染色液，染色液染色(煮胶并晃动——防止气泡影响染色)过夜，脱色液脱色2hr两次，水洗两次后扫描仪扫胶。

3.4、图像比对

使用imagemaster7.0对图像进行比对。选点参数“smooth”为3，“minarea”为65,“salience”为250。

4、酶解

将切下的胶块置于0.5ml小管中，200ul超纯水37℃浸泡30min，100ul脱色液(acn：100mmnh4hco3＝3：7)震荡30min重复2－3遍，直到胶块和脱色液无色为止。超纯水清洗2次，加入100ulacn脱水15min，吸去溶液，干燥5min。10ultrypsin冰上45min吸涨，吸去多余的酶液，补充10ul工作液(5％乙腈，25mmnh4hco3)，37℃9-11hr，吸取并保留工作液含33％acn和0.1％tfa水溶液摇振半小时，吸取并保留溶液含66％acn和0.1％tfa水溶液摇振半小时，吸取并保留溶液含100％acn和0.1％tfa水溶液摇振10min，吸取并保留溶液合并三次保留液，真空冷冻抽干至剩余5-6ul。

每组运行3个银染凝胶以确保重现性(图1)。通过maldi-tof/tof分析2d凝胶结果，共找到25个蛋白斑点，发现15个蛋白质在患者和对照的尿样中表现出差异表达(表3)。其中，mpsⅱ患者中7种蛋白如α1-抗胰蛋白酶表达上调；而脂质运载蛋白型前列腺素d合成酶等8种蛋白质被下调。

表3、差异表达的蛋白列表

¹2-de凝胶中出现的斑点数；²mw＝分子量；³蛋白评分高于67分作为参考；⁴正数数值代表患者尿液中蛋白质表达上调，而负值代表患者尿液中蛋白质表达下调。

5、质谱：

质谱上样：取样品0.5-1ul点靶，烤干，重复2-3次

点基质(hcca2.5mg/ml)0.3-0.4ul，干燥后可上机打靶

质谱仪：brukerultraflextrememaldi-tof/tof质谱仪(德国)

扫描方式：反射式

扫描范围：1000-4000da

每个一级质谱自动选多个母离子做二级质谱。检索人数据库(p<0.05)。

实施例2、elisa检测目标蛋白在病理样本和正常样本中的表达差异

选择表达差异较大的三个蛋白，alpha1-antitrypsin(aat)，gm2activator(gm2a)及lipocalin-typeprostaglandindsynthase(l-pgds)，检测目标蛋白在病理样本和正常样本中的表达差异

1、aat含量检测

(1)取α1-at标准品(400ng/ml)，用标准品稀释液配成浓度分别为200、100、50、25、12.5、6.25ng/ml溶液，用于建立标准曲线。

(2)－80℃冰箱中取出尿液标本，4℃12000r/min离心3min，取上清液。

(3)设标准孔7孔，依次加入100μl不同浓度的标准品，空白孔加100μl超纯水。

(4)将稀释10倍后的样品100μl加入酶标板底部。

(5)酶标板加上覆膜，温育。

(6)弃去孔内液体，每孔用350μl的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体。

(7)每孔加检测溶液b工作液100μl，加覆膜，37℃温育30min。重复洗板5次，每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜，37℃避光显色。

(8)每孔加终止溶液50μl，终止反应。

(9)用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度。

若计算样本浓度不在标准曲线范围内，将样本稀释后重复检测。

2、gm2a含量检测

取gm2a标准品(20ng/ml)，用标准品稀释液配成浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156ng/ml溶液，用于建立标准曲线。取500μl上清液与500μl超纯水充分混合，将稀释2倍后的样品100μl加入酶标板底部。其余步骤同1。

3、l-pgds含量检测

取l-pgds标准品(480pg/ml)，用标准品稀释液配成浓度分别为240、120、60、30、15、7.5、3.75pg/ml溶液，用于建立标准曲线。样品不用稀释。其余步骤同1。

通过elisa方法测量的结果见图2，

(1)mpsⅱ组中aat/cr值为0.79±0.10mg/mmol，显著高于健康对照组0.42±0.05mg/mmol；

(2)mpsⅱ组中gm2a/cr的值为1.30±0.12ng/mmol，显着低于健康对照组2.19±0.19ng/mmol；

(3)mpsⅱ组中l-pgds/cr的值为9.86±1.16pg/mmol，显着低于健康对照组13.98±1.48pg/mmol；

上述elisa结果与蛋白质组学检查一致。

绘制roc曲线，并分析曲线下面积(auc)，对比敏感度和特异性，结果见图3，aat/cr，gm2a/cr和l-pgds/cr的auc分别为0.833、0.896和0.750。

上述结果说明，aat、gm2a、l-pgds有作为诊断mpsⅱ的分子标志物的能力。

最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做的本发明保护范围的限定。