基于羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇的阿霉素荧光检测方法与流程

本发明基于羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇荧光材料，提供一种新型阿霉素（多柔比星）快速及超灵敏的检测方法，属于分析化学和纳米技术领域。

背景技术：

众所周知阿霉素是蒽醌类化合物，广泛用于治疗白血病、乳腺癌等的治疗。虽然阿霉素已被证明是一种有效药物，但它的治疗指数低，长期用药或者剂量稍大便会引发一些严重的副作用，包括骨髓抑制和心脏毒性。

许多的分析方法，包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、质谱、电化学方法等，都被报道可用于阿霉素的检测。但是，这些方法都存在某些缺陷，比如昂贵的仪器和有毒的试剂，复杂的前处理过程，重现性差，以及响应时间长等。因此，开发简单、准确、灵敏、快速测定阿霉素的方法相当重要。

金纳米团簇（goldnanoclusters,auncs）是一种新型的荧光纳米材料，其具有尺寸小、无毒、水溶性好、光稳定性好、stokes位移大、比表面积大、制备条件温和、表面易于修饰以及荧光性质随尺寸可调等突出优点，是近年来的研究热点，其已被广泛应用于催化、传感检测、纳米标记、医学成像和光电子学等领域。

本发明以羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇荧光材料作为荧光探针，提供了一种简便、灵敏的阿霉素检测的新方法。

技术实现要素：

鉴于上述的现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种基于羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇的阿霉素荧光检测方法。其中包括利用阿霉素与羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇之间强烈的光致电子转移作用，猝灭金纳米团簇的荧光，实现对阿霉素快速、灵敏检测，并且用于实际样品的检测。

为了实现上述检测方法的目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇的阿霉素荧光检测方法，其特征是利用金纳米团簇与阿霉素的特异性相互作用后发生强烈光致电子转移，导致金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而实现阿霉素的测定；所述的金纳米团簇由以下步骤制成的：将1ml浓度为0.4mol/l氢氧化钠溶液和1.6ml浓度为20mg/ml氯金酸预先混合，而后加入7.4ml浓度为50mg/ml羧化壳聚糖溶液和10ml浓度为0.1mol/l的二硫苏糖醇溶液，摇匀后置于37℃水浴锅中恒温反应8小时得到羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇；将反应后的金纳米团簇用截留分子量3500的透析袋在双蒸水中透析24小时，得到纯化后的羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇。

所述的一种基于羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇的阿霉素荧光检测方法，其特征是能根据荧光光谱的最大发射波长645nm处的荧光强度来判断阿霉素的浓度。

所述的一种基于羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇的阿霉素荧光检测方法，其特征阿霉素的测定步骤如下：取0.1ml羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇溶液加入到1.9ml含不同浓度阿霉素的浓度为20mmol/l，ph=6.0的磷酸盐缓冲液中，混合均匀；反应结束后测定其在645nm处的激发波长为285nm的荧光强度值f；根据空白荧光强度值f0与含有阿霉素的荧光强度f的比值（f0/f）绘制标准曲线进行定量；阿霉素测定的线性范围为0.05~2μmol/l，最低检测限为0.005μmol/l。

本发明所述的一种基于羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇快速测定血清样品中阿霉素的方法，其特征是包括如下步骤：取0.1ml羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇溶液加入到1.9ml人血清样品溶液中，混合均匀，反应结束后测定其在645nm处的激发波长为285nm的荧光强度值f；结合阿霉素测定的标准曲线计算阿霉素的含量，人血清样品的加标回收率在95.7~102.5%，相对标准偏差为1.12~1.62%。

所述的金纳米团簇由以下步骤制成的：将1ml浓度为0.4mol/l氢氧化钠溶液和1.6ml浓度为20mg/ml氯金酸预先混合，而后加入7.4ml浓度为50mg/ml羧化壳聚糖溶液和10ml浓度为0.1mol/l的二硫苏糖醇溶液，摇匀后置于37℃水浴锅中恒温反应8小时得到羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇；将反应后的金纳米团簇用截留分子量3500的透析袋在双蒸水中透析24小时，得到纯化后的羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇。

具体地说，本发明采用下述技术方案：

（一）金纳米团簇的制备

将1ml氢氧化钠（0.4mol/l）和1.6ml氯金酸（20mg/ml）预先混合，加入7.4ml羧化壳聚糖溶液（50mg/ml），混匀，随后加入10ml二硫苏糖醇（0.1mol/l），37℃水浴孵育8小时。取出反应液，用截留分子量为3500的透析袋在双蒸水中透析24小时，得到纯化后的羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇。制备过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。

（二）阿霉素的测定

将0.1ml步骤（一）制备的金纳米团簇溶液加入到1.9ml含不同浓度阿霉素的磷酸盐缓冲液（20mmol/l，ph=6.0）中，混合均匀后测定其在645nm处的荧光强度值f（激发波长为285nm）。根据f0（空白）与f（含有阿霉素）的比值（f0/f）绘制标准曲线进行定量。阿霉素测定的线性范围为0.05~2μmol/l，最低检测限为0.005μmol/l。

本发明的优点：

（1）本发明利用羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇与阿霉素特异性相互作用后发生光致电子转移，使得金纳米团簇的荧光受到抑制，从而表现出荧光光谱特征的变化，可以用于阿霉素的含量检测。

（2）本发明所使用的羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇，其制备过程简单快速，量子产率高。

（3）本发明对样品的处理要求低，对阿霉素的检测特异性高，方法简便、快速。

（4）本发明检测阿霉素的检测线性范围为0.05~2μmol/l，检测的灵敏度高，检测限为0.005μmol/l，优于或者接近于其他检测方法的灵敏度。此外，加标回收率在95.7%~102.5%之间，可用于实际样品检测。

本发明的测定方法，可以通过荧光分光光度计测定出样本中阿霉素的浓度水平，测试灵敏度高，特异性好，精确度好。检测过程简便，稳定性好，具有操作简便、检测时间短、灵敏度高、特异性强等优点，易于推广使用。

附图说明

图1为羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇的荧光发射光谱图。

图2为羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇与浓度为5μmol/l的阿霉素发生作用后的荧光发射光谱图。

图3为羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇与浓度为5μmol/l的阿霉素发生作用前（a）和后（b）在紫外灯照射下的外观对照图。

图4为反应时间对阿霉素猝灭羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇荧光强度的影响图。纵坐标表示f0（空白）与f（含有阿霉素）的比值。

图5为体系ph值对阿霉素猝灭羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇荧光强度的影响图。纵坐标表示f0（空白）与f（含有阿霉素）的比值。

图6为不同浓度阿霉素存在时羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇荧光发射光谱图。阿霉素浓度由上到下依次为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5和5.0μmol/l。

图7为阿霉素测定的标准曲线图，纵坐标表示f0（空白）与f（含有阿霉素）的比值。

图8为阿霉素检测的干扰性实验，对比了除阿霉素外的13种不同的干扰物质，纵坐标表示f0（空白）与f（含干扰物质）的比值关系图。横坐标0~14分别代表空白、阿霉素、zn²⁺、ca²⁺、hco3^-、k⁺、na⁺、mg²⁺、fe³⁺、fe²⁺、谷胱甘肽、半胱氨酸、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤和环磷酰胺。

具体实施方式

本发明的一个方面在于提供一种基于羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇的阿霉素的荧光检测方法。其中包括利用阿霉素与羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇的光致电子转移作用，抑制金纳米团簇的荧光，随着阿霉素浓度的增加，荧光体系在最大发射波长645nm处的荧光强度（f）降低。取一系列含有不同浓度阿霉素的标准样品加入体系中反应，根据最大发射波长645nm处的荧光强度f0（空白）与f（含有阿霉素）的比值（f0/f）绘制标准曲线，从而实现阿霉素的检测。

以下结合附图及若干实施例对本发明检测方法的技术方案作进一步的说明。

实施例1：

将1ml浓度为0.4mol/l氢氧化钠溶液和1.6ml浓度为20mg/ml氯金酸预先混合，而后加入7.4ml浓度为50mg/ml羧化壳聚糖溶液和10ml浓度为0.1mol/l的二硫苏糖醇溶液，摇匀后置于37℃水浴锅中恒温反应8小时得到羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇。将反应后的金纳米团簇用截留分子量3500的透析袋在双蒸水中透析24小时，得到纯化后的羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇。所得的羧化壳聚糖/二硫苏糖醇-金纳米团簇具有强烈的荧光，其最大激发和发射波长分别为285nm和645nm（见图1）。

实施例2：

取0.1ml实施例1制得的金纳米团簇溶液加入到1.9ml含5μmol/l阿霉素的磷酸盐缓冲液（20mmol/l，ph=6.0）中，混合均匀。由图2可知，加入阿霉素后，体系在645nm的发射光强度值明显减低（激发波长为285nm）。

实施例3：

取0.1ml实施例1制得的金纳米团簇溶液加入到1.9ml含5μmol/l阿霉素的磷酸盐缓冲液（20mmol/l，ph=6.0）中，混合均匀。同时设置一组不含阿霉素的空白对照组（图3中的a）。反应结束后置于紫外灯下观察颜色变化。如图3所示，加入阿霉素后，金纳米团簇的红色荧光几乎被完全猝灭（图3中的b）。

实施例4：

取0.1ml实施例1制得的金纳米团簇溶液加入到1.9ml含5μmol/l阿霉素的磷酸盐缓冲液（20mmol/l，ph=6.0）中，混合均匀后反应0.5~3分钟，测定其在645nm处的荧光强度值f（激发波长为285nm）。由图4可知，反应0.5分钟后，荧光强度比值f0/f变化趋于平稳。

实施例5：

取0.1ml实施例1制得的金纳米团簇溶液加入到1.9ml含5μmol/l阿霉素的磷酸盐缓冲液（20mmol/l，ph=5.0~11.0）中，混合均匀，测定其在645nm处的荧光强度值f（激发波长为285nm）。由图5可知，当反应体系的ph值为6.0时，荧光强度比值f0/f变化达到最大。

实施例5：

取0.1ml实施例1制得的金纳米团簇溶液加入到1.9ml含不同浓度阿霉素的磷酸盐缓冲液（20mmol/l，ph=6.0）中，混合均匀。反应结束后测定其荧光发射光谱图（激发波长为285nm）。如图6所示，随着阿霉素浓度的增加，金纳米团簇的荧光逐渐受到抑制。

实施例6：

取0.1ml实施例1制得的金纳米团簇溶液加入到1.9ml含不同浓度阿霉素的磷酸盐缓冲液（20mmol/l，ph=6.0）中，混合均匀。反应结束后测定其在645nm处的荧光强度值f（激发波长为285nm）。根据f0（空白）与f（含有阿霉素）的比值（f0/f）绘制标准曲线进行定量。如图7所示，阿霉素测定的线性范围为0.05~2μmol/l，最低检测限为0.005μmol/l。

实施例7：

取0.1ml实施例1制得的金纳米团簇溶液加入到1.9ml含不同干扰物（均为5μmol/l）的磷酸盐缓冲液（20mmol/l，ph=6.0）中，混合均匀。反应结束后测定其在645nm处的荧光强度值f（激发波长为285nm）。如图8所示，与阿霉素产生的荧光猝灭作用相比，其他干扰物的影响均可忽略不计。

实施例8：

取0.1ml实施例1制得的金纳米团簇溶液加入到1.9ml人血清样品溶液中，混合均匀，反应结束后测定其在645nm处的荧光强度值f（激发波长为285nm）。结合实施例6的标准曲线计算阿霉素的含量，人血清样品的加标回收率在95.7~102.5%，相对标准偏差为1.12~1.62%。