一种杭白芍有效成分的提取方法与流程

本发明属于中药
技术领域：
，具体地说涉及一种杭白芍有效成分的提取方法。
背景技术：
：白芍为毛茛科植物芍药paeonialactiflorapall.的干燥根，是我国著名的传统中药，始载于《神农本草经》，列为中品，具有平肝止痛，养血调经和敛阴止汗的功效。目前全国药用芍药主产区为安徽亳州、浙江磐安、四川中江和山东菏泽，所产白芍分别习称亳白芍、杭白芍、川白芍和菏泽白芍。其中，杭白芍在药用白芍中种植历史最悠久，质量上乘，然而随着亳白芍的种植面积不断扩大，在价格方面相对于杭白芍的价格要低，这对杭白芍的销售产生了较大的威胁，且更令人担忧的是现今杭白芍生产极度萎缩，面临濒危，所以应尽快加强杭白芍的种质保护。杭白芍是“浙八味”之一，以浙江磐安地区的品质最佳(查良平,杨俊,彭华胜,胡海波.四大产地白芍的种质调查.中草药,2011,34(7):313-317.)，其所含成分复杂，除主要含有芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷等一系列单萜糖苷类化合物外，还含有苯甲酸、没食子酸、儿茶素等成分。其中，研究最多的是单萜糖苷类化合物，它们统称为白芍总苷(李彬,曾金香,李晶,于欢,李萍,李会军.杭白芍的化学成分.药学与临床研究,2009,17(3):204-206)(totalglycosidesofpaeony,tgp)。tgp为白芍的有效部位，现代药理研究表明，tgp具有抗炎、镇痛及抗病毒等药理作用，可用于治疗类风湿性关节炎(changy,weiw,zhangl,xuhm.effectsandmechanismsoftotalglucosidesofpaeonyonsynoviocytesactivitiesinratcollagen-inducedarthritis.jethnopharmacol,2009,121(1):43-48)、肝纤维化(jiy,wangt,weizf,lugx,jiangsd,xiayf,daiy.paeoniflorin,themainactiveconstituentofpaeonialactifloraroots,attenuatesbleomycin-inducedpulmonaryfibrosisinmicebysuppressingthesynthesisoftypeicollagen.jethnopharmacol,2013,149(3):825-832.)和心脑血管(jinsn,wenjf,wangtt,kangdg,leehs,chokw.vasodilatoryeffectsofethanolextractofradixpaeoniaerubraanditsmechanismofactionintherataorta.jethnopharmacol,2012,142(1):188-193.)等多种疾病。尽管关于白芍及其主要物质tgp的研究已经比较广泛，但是还远远不足以帮助全面揭示杭白芍的药效物质基础，尤其是对杭白芍的物质组成还了解不多。白芍主要物质成分的提取过程较为复杂，报道的提取方法包括超声提取(杨小英,闻杰,兰晓波,刘天龙.正交试验法优选芍药苷提取工艺分析.临床医药文献电子杂志,2015,2(31):6536-6538.)、加热回流(陈象青,屈建,卢今,张善堂,焦伟.田口实验设计法优选白芍中芍药苷的提取工艺.中国新药杂志,2013,22(15):1836-1839.)、煎煮法(彭晓霞,路莎莎,张振巍.混合均匀设计效应面法优选赤芍中芍药苷的提取工艺.中国药房,2011,22(11):994-996.)、闪式提取法(谢仲德,李文烈,方应权,刘自忍.白芍中芍药苷的闪式提取工艺研究.中成药,2013,35(09):2037-2039.)等。常用提取溶剂有水、乙醇和甲醇等，其中水和乙醇最常用。研究报道主要以白芍中含量较高的芍药苷为指标优化白芍的提取工艺方法。吴巧凤等(吴巧凤,严云良,楼小红.白芍中芍药苷的提取工艺研究.中成药,2006(09):1379-1380.)以芍药苷含量为指标，采用索氏提取法，以乙醇浓度、溶媒倍数及提取时间作为考察因素，选用l9(3)正交表进行正交试验，优选出白芍的最佳提取工艺。黄天辉等(黄天辉,张祥民.均匀设计优选微波提取白芍中芍药苷的研究.中国药学杂志,2008(19):1464-1467)采用均匀设计方法、微波提取和高效液相色谱测定，分别考察了微波功率、提取时间、溶剂的浓度和料液比的选择对提取芍药苷的影响，研究结果筛选出微波功率、乙醇体积分数、料液比、提取时间等优化工艺条件。谢仲德等(谢仲德,李文烈,方应权,刘自忍.白芍中芍药苷的闪式提取工艺研究.中成药,2013,35(09):2037-2039)以芍药苷含量为指标，采用正交实验设计，对白芍闪式提取法的影响因素进行了考察，实验结果闪式提取的最优工艺是70％乙醇，料液比1：12，提取时间1min，闪式提取法提取的芍药苷的量高于乙醇回流提取法。以上研究可以看出，目前研究者已经开展了白芍主要物质成分提取工艺研究，但是大多研究主要以芍药苷为提取评价指标，还不足以反映白芍的物质基础及最佳提取条件。技术实现要素：本发明的目的是提供一种杭白芍有效成分的提取方法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：本发明的第一个方面提供了一种杭白芍有效成分的提取方法，包括以下步骤：将杭白芍饮片粉碎后过筛，精密称取杭白芍粉末，加入提取溶剂，超声提取，提取液过滤得滤液，滤液浓缩得浸膏，用提取溶剂溶解浸膏混匀，用hplc法定量分析浸膏中有效成分；所述提取溶剂为甲醇或乙醇；所述提取溶剂的浓度为50～85％；所述杭白芍粉末与提取溶剂的质量比为(50～200):1。所述筛的目数为50目。所述提取溶剂的浓度为50％、70％、85％。所述杭白芍粉末与提取溶剂的质量比为50:1、100:1、200:1。所述超声提取的温度为30～40℃(优选为35℃)，时间为1～30min，优选为10min、20min、30min。所述超声提取的最优条件为：提取溶剂为70％的乙醇，杭白芍粉末与提取溶剂乙醇的料液比为200ml/g，温度为35℃，超声提取时间为30min。所述hplc法定量分析浸膏中有效成分中，色谱条件：色谱柱为xb-c18柱(4.6×250mm，5μm)，流动相：0.1％磷酸水溶液(a相)-乙腈(c相)，线性梯度洗脱：0min10％c，5min15％c，25min22％c，45min70％c，46min80％c，48min80％c。流速0.8ml/min，检测波长230nm，柱温30℃，进样量10μl。所述hplc法定量分析浸膏中有效成分，样品需要进样前处理：用提取溶剂溶解浸膏混匀，精密量取上述溶液100μl置于1.5ml的离心管中，加入提取溶剂500μl稀释，混匀，取适量稀释好的样品，以0.22μm微孔膜滤过，弃去前两滴，得续滤液，采用hplc法进样分析。所述用hplc法定量分析浸膏中有效成分，分别为没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷、丹皮酚。由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：本发明提供的杭白芍有效成分的提取方法，为筛选中药杭白芍的最佳提取工艺提供基础，建立了hplc法用于同时定量分析杭白芍中9种主要成分没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷和丹皮酚的含量。然后运用超声提取法，以杭白芍9种主要成分总含量作为评价指标，运用3因素3水平的正交试验设计考察了提取溶剂种类、溶剂浓度、液料比和提取时间对杭白芍主要成分总含量的影响，优化杭白芍的提取工艺。研究结果发现提取溶剂浓度对杭白芍主要成分总含量的影响最大，其次是液料比，提取时间的影响最小。分析正交试验结果确定了杭白芍的最佳提取工艺条件为：提取溶剂70％乙醇，液料比200ml/g，超声提取时间30min。本发明筛选得到了一种提取方法简单、提取物质成分多、提取效率相对较高的杭白芍提取方法。本发明以杭白芍9种主要药效成分为综合评价指标，采用经典的正交试验设计，考察了重要因素提取溶剂、液料比和提取时间对杭白芍有效成分提取的影响，结果筛选出了杭白芍的最佳提取方法，相对于仅以芍药苷等少数一两个成分为主要评价指标的白芍提取方法，本发明确保了杭白芍有效成分提取的充分性和全面性，提高了杭白芍的提取效率。研究结果帮助揭示了杭白芍的物质基础，为杭白芍的药效评价、作用机制及体内过程研究提供了科学依据，也为中药杭白芍的质量控制和产品开发提供了参考信息。附图说明图1是提取溶剂为乙醇的hplc色谱图。图2是提取溶剂为甲醇的hplc色谱图。图3是混合对照品溶液的hplc色谱图。图4是杭白芍提取物的hplc色谱图。图5是甲醇提取有效成分总含量随甲醇浓度的变化趋势图。图6是甲醇提取有效成分总含量随液料比的变化趋势图。图7是甲醇提取有效成分总含量随超声时间的变化趋势图。图8是乙醇提取有效成分总含量随乙醇浓度的变化趋势图。图9是乙醇提取有效成分总含量随液料比的变化趋势图。图10是乙醇提取有效成分总含量随超声时间的变化趋势图。图11是对照品没食子酸在230nm信号下的hplc色谱图。图12是对照品羟基芍药苷在230nm信号下的hplc色谱图。图13是对照品儿茶素在230nm信号下的hplc色谱图。图14是对照品芍药内酯苷在230nm信号下的hplc色谱图。图15是对照品芍药苷在230nm信号下的hplc色谱图。图16是对照品五没食子酰葡萄糖在230nm信号下的hplc色谱图。图17是对照品苯甲酸在230nm信号下的hplc色谱图。图18是对照品苯甲酰芍药苷在230nm信号下的hplc色谱图。图19是对照品丹皮酚在230nm信号下的hplc色谱图。具体实施方式为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。实施例1本发明实施例中所用仪器设备：旋转蒸发器re52-99(上海亚荣生化仪器厂)；kq-50e型超声波清洗器；agilent高效液相色谱仪(1260infinity)；色谱柱：xb-c18柱(4.6×250mm，5μm)(批号：2101.104)；粉碎机；电子分析天平(xs105dualrange，mettlertoledo)；高速离心机cf-10；超纯水仪cascoda.ls；涡旋混合器(ikavortexgenius3)；shb-ⅲa循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。本发明实施例中所用试剂：杭白芍饮片，购于嘉兴东方国药饮片有限公司，产地为浙江磐安。对照品没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷、丹皮酚(规格20mg，纯度≥98％)购于上海融禾医药科技有限公司；甲醇和乙腈为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司)，去离子水由超纯水仪制备，其余试剂均为分析纯。本发明实施例中色谱条件：色谱柱为xb-c18柱(4.6×250mm，5μm)，流动相：0.1％磷酸水溶液(a相)-乙腈(c相)，线性梯度洗脱：0min10％c，5min15％c，25min22％c，45min70％c，46min80％c，48min80％c。流速0.8ml/min，检测波长230nm，柱温30℃，进样量10μl。溶液配制：对照品储备液的配制：精密称取没食子酸1.39mg，羟基芍药苷0.53mg，儿茶素1.29mg，芍药内酯苷2.22mg，芍药苷4.31mg，五没食子酰葡萄糖1.60mg，苯甲酸2.19mg，苯甲酰芍药苷3.10mg，丹皮酚1.53mg，分别用80％甲醇溶液溶解并定容为1ml，制得各对照品储备液，4℃贮藏，备用。流动相的配制：精密量取超纯水1000ml，加入1ml磷酸，混匀，过滤，超声脱气20min，得水相(0.1％磷酸水)。有机相乙腈，使用前过滤及超声脱气20min。供试品制备：将杭白芍饮片粉碎后过筛，精密称取0.4g杭白芍粉末，置于锥形瓶中，加入提取溶剂，超声(100khz)提取或加热回流提取，过滤，得滤液，用旋转蒸发器旋蒸浓缩，得浸膏，用5ml提取溶剂溶解浸膏，混匀，所得供试品溶液4℃保存备用。供试品进样前处理：精密量取供试品溶液100μl置于1.5ml的离心管中，加入相应提取溶剂500μl稀释，混匀。取适量稀释好的样品，以0.22μm微孔膜滤过，弃去前两滴，得续滤液，进样分析。实验结果与分析方法学考察专属性：对比提取溶剂(乙醇和甲醇)、混合对照品溶液、杭白芍提取物的色谱图，结果分别如图1、图2、图3和图4所示。图1是提取溶剂为乙醇的hplc色谱图；图2是提取溶剂为甲醇的hplc色谱图；图1和2中，提取溶剂为乙醇和甲醇对杭白芍有效成分的测定均不存在干扰，说明方法的专属性良好。图3是混合对照品溶液的hplc色谱图，图3中：1：没食子酸69.5μg/ml，2：羟基芍药苷26.3μg/ml，3：儿茶素64.5μg/ml，4：芍药内酯苷111μg/ml，5：芍药苷215.5μg/ml，6：五没食子酰葡萄糖80.0μg/ml，7：苯甲酸109.5μg/ml，8：苯甲酰芍药苷155.0μg/ml，9：丹皮酚76.5μg/ml。图4是杭白芍提取物的hplc色谱图，图4中：1：没食子酸，2：羟基芍药苷，3：儿茶素，4：芍药内酯苷，5：芍药苷，6：五没食子酰葡萄糖，7：苯甲酸，8：苯甲酰芍药苷，9：丹皮酚。线性范围：各取对照品储备液没食子酸200μl、羟基芍药苷200μl、儿茶素40μl、芍药内酯苷100μl、芍药苷100μl、五没食子酰葡萄糖100μl、苯甲酸40μl、苯甲酰芍药苷40μl和丹皮酚12.5μl，置于1ml容量瓶中，加80％甲醇溶液定容，混匀，再将混合对照品溶液依次逐级稀释1倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍和64倍，得到一系列质量浓度的混合对照品溶液(各浓度混合对照品溶液中各成分浓度，没食子酸：278.0,139.0,69.5,34.8,17.4,8.7,4.3μg/ml；羟基芍药苷：106.0,53.0,26.5,13.3,6.6,3.3,1.7μg/ml；儿茶素：51.6,25.8,12.9,6.5,3.2,1.6,0.8μg/ml；芍药内酯苷：222.0,111.0,55.5,27.8,13.9,6.9,3.5μg/ml；芍药苷：431.0,215.5,107.8,53.9,26.9,13.5,6.7μg/ml；五没食子酰葡萄糖：160,80,40,20,10,5,2.5μg/ml；苯甲酸：87.6,43.8,21.9,11.0,5.5,2.7,1.4μg/ml；苯甲酰芍药苷：124.0,62.0,31.0,15.5,7.8,3.9,1.9μg/ml；丹皮酚：19.1,9.6,4.8,2.4,1.2,0.6,0.3μg/ml)将混合对照品溶液混匀后离心，取上清液，进样分析。以各成分的质量浓度为横坐标，以各成分峰面积为纵坐标作标准曲线，得各成分线性回归方程、相关系数(r2)和线性范围如表1所示。从表1可以看出，各成分在所分析的浓度范围内，线性关系良好。表1各成分的线性范围单个对照品：将每个对照品溶液，用80％甲醇溶液稀释20倍，离心，取上清液，进样量10μl。将混合对照品的色谱图与单个对照品的色谱图根据保留时间进行比较，确定每个对照品。如图11～19所示，图11是对照品没食子酸在230nm信号下的hplc色谱图，图12是对照品羟基芍药苷在230nm信号下的hplc色谱图，图13是对照品儿茶素在230nm信号下的hplc色谱图，图14是对照品芍药内酯苷在230nm信号下的hplc色谱图，图15是对照品芍药苷在230nm信号下的hplc色谱图，图16是对照品五没食子酰葡萄糖在230nm信号下的hplc色谱图，图17是对照品苯甲酸在230nm信号下的hplc色谱图，图18是对照品苯甲酰芍药苷在230nm信号下的hplc色谱图，图19是对照品丹皮酚在230nm信号下的hplc色谱图。进样精密度：配制适量一定浓度的(1：没食子酸69.5μg/ml，2：羟基芍药苷26.5μg/ml，3：儿茶素12.9μg/ml，4：芍药内酯苷55.5μg/ml，5：芍药苷107.8μg/ml，6：五没食子酰葡萄糖40.0μg/ml，7：苯甲酸21.9μg/ml，8：苯甲酰芍药苷31.0μg/ml，9：丹皮酚4.8μg/ml)混合对照品溶液，以hplc方法进样分析，连续进样6针，分别计算每个成分6针峰面积的rsd％值，结果9种成分：没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷和丹皮酚的rsd％分别为3.36％、6.80％、6.07％、6.16％、5.68％、4.82％、2.33％、1.80％和2.10％，说明仪器进样精密度良好。重复性：精密称取杭白芍粉末0.4g，在优化的最佳条件，即采用70％的乙醇为提取溶剂，液料比200ml/g，35℃超声提取30min，按上述供试品的制备方法处理，得供试品溶液。分别将供试品稀释3倍、4.5倍、6倍，每种浓度分别制备3份供试品溶液，按供试品进样前处理后进样分析，计算各成分质量浓度的rsd％，实验结果9种成分：没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷和丹皮酚稀释3倍的rsd％分别为3.18％、2.02％、6.61％、2.49％、2.44％、8.16％、6.34％、2.96％和5.34％；稀释4.5倍的rsd％分别为9.05％、8.10％、9.65％、7.67％、8.23％、13.89％、9.05％、7.81％和4.54％；稀释6倍的rsd％分别为9.00％、8.84％、8.64％、6.67％、4.80％、49.96％、4.14％、5.07％和15.61％；说明方法重现性良好。加样回收率：同重复性实验，分别制备3种不同浓度的供试品溶液，即将供试品溶液分别稀释3倍、4.5倍、6倍，各加入一定浓度(1：没食子酸69.5μg/ml，2：羟基芍药苷26.5μg/ml，3：儿茶素12.9μg/ml，4：芍药内酯苷55.5μg/ml，5：芍药苷107.8μg/ml，6：五没食子酰葡萄糖40.0μg/ml，7：苯甲酸21.9μg/ml，8：苯甲酰芍药苷31.0μg/ml，9：丹皮酚4.8μg/ml)的混合对照品溶液，混匀，按供试品进样前处理后以hplc方法进样分析，每种浓度平行4份，分别计算各成分的质量浓度，根据加入的各成分实际测定值与理论值的比值求算各成分的加样回收率。研究结果各成分加样回收率分别为：没食子酸95.2％～109.1％，羟基芍药苷107.5％～117.7％，儿茶素99.7％～109.4％，芍药内酯苷96.7％～105.9％，芍药苷96.5％～113.6％，五没食子酰葡萄糖108.3％～113.1％，苯甲酸99.0％～105.9％，苯甲酰芍药苷97.7％～104.1％，丹皮酚101.6％～108.0％，3种浓度平行4份的rsd％均小于3.0％，说明方法的加样回收率良好。杭白芍提取方法的初步筛选：分别精密称取两份杭白芍粉末各0.4g，置于具塞锥形瓶中，各加入40ml50％甲醇溶液，称定质量，其中一份采用加热回流提取1.5h，另一份在35℃，功率为100khz的条件下，超声提取30min。提取液冷却至室温，称定补足质量，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，按hplc方法进样分析。比较不同提取方法的共有峰的总峰面积。对比实验结果显示：超声提取的共有峰峰面积大于加热回流提取的共有峰峰面积，所以初步筛选结果采用超声提取法。对比了两种供试品制备方法即超声提取未浓缩和超声提取浓缩对各成分总含量的影响，具体为：分别精密称取两份杭白芍粉末各0.4g，置于具塞锥形瓶中，各加入40ml50％甲醇溶液，35℃超声提取30min，过滤，其中一份直接进样分析，另一份用旋转蒸发器旋蒸浓缩，得浸膏，用5ml50％甲醇溶剂溶解浸膏，混匀，按供试品进样前处理后进样分析。分别测出未浓缩和浓缩两种提取物中各成分的含量，结果见表2。表2超声提取未浓缩和浓缩提取物中各成分的含量表2结果显示，杭白芍超声提取未浓缩和超声提取浓缩测得的主要成分总含量相差不大，但考虑到超声提取未浓缩提取物中五没食子酰葡萄糖和丹皮酚的含量过低，较难准确检测到，所以实验结果选择供试品制备方法为超声提取并浓缩。正交试验优化结果正交试验数据处理结果(1)极差计算：ij表示第j列“1”水平所对应总含量数据之和；iij表示第j列“2”水平所对应总含量数据之和；iiij表示第j列“3”水平所对应总含量数据之和；kj表示第j列同一水平出现的次数。ij/kj表示第j列“1”水平所对应总含量平均值；iij/kj表示第j列“2”水平所对应总含量平均值；iiij/kj表示第j列“3”水平所对应总含量平均值；dj表示第j列的极差。其等于第j列各水平所对应总含量平均值中的最大值减去最小值。(2)方差计算：sj表示第j列的极差偏差平方和。计算公式：fj表示自由度。其等于第j列的水平数减去1。vj表示方差。vj＝sj/fj。fj表示方差之比。fj＝vj/ve，ve是误差列的方差。以甲醇为提取溶剂的提取优化结果：以甲醇为溶剂进行超声提取，主要考察a(甲醇浓度/％)、b(液料比ml/g)、c(超声时间/min)三个因素，根据每个因素设置了三个水平(如表3)，此设置考察了不同提取条件对杭白芍提取物主要成分总含量的影响，选用l9(34)表设计正交实验(如表4)。将杭白芍粉碎，精密称取0.4g杭白芍粉末，置于锥形瓶中，按表3各因素水平分别采用一定料液比和浓度的甲醇为提取溶剂，35℃超声提取一定时间后，过滤，得滤液，用旋转蒸发器旋蒸，得浸膏，用5ml相应浓度的甲醇溶解浸膏，混匀，溶液4℃保存待测。按表4正交试验设计共提取制备了9份甲醇提取物供试品溶液，将各溶液按供试品进样前处理后，进样分析，分别测出各份提取物中主要成分的总含量，结果见表4。表3因素水平表4因素水平甲醇提取物l9(34)正交实验结果根据表4中9份甲醇提取物主要成分总含量结果分别进行极差计算和方差计算，结果分别见表5和表6。表5甲醇提取物主要成分总含量极差分析由表5极差分析可得，甲醇浓度对总含量的影响最大，其次是液料比。表6甲醇提取物主要成分总含量方差分析根据表6甲醇提取物主要成分总含量方差分析结果，查《f分布数值表》(国家标准化管理委员会.bg4086.4-1983统计分布数值表f分布.北京:中国标准出版社,1984.)可知：f(α＝0.05，f1＝2，f2＝2)＝19>f1，f(α＝0.1，f1＝2，f2＝2)＝9<f1；f(α＝0.1，f1＝2，f2＝2)＝10>f2，f(α＝0.2，f1＝2，f2＝2)＝4<f2；f(α＝0.2，f1＝2，f2＝2)＝4>f3，f(α＝0.25，f1＝2，f2＝2)＝3<f3。所以在甲醇提取物中，甲醇浓度在α＝0.1水平上显著；液料比在α＝0.2水平上显著；超声提取时间在α＝0.25水平上显著。各因素、水平对甲醇提取物中主要成分总含量的影响变化趋势如图5～7所示。图5是甲醇提取有效成分总含量随甲醇浓度的变化趋势图，可以看出随着提取溶剂甲醇浓度的增大，总含量先升高后降低，甲醇浓度为70％时，提取有效成分总含量最高；图6是甲醇提取有效成分总含量随液料比的变化趋势图，可以看出随着液料比的增大，总含量升高，液料比为200ml/g时，提取有效成分总含量最高；图7是甲醇提取有效成分总含量随超声时间的变化趋势图，可以看出随着超声提取时间的增长，总含量先降低后升高，超声时间为30min时，提取有效成分总含量最高。以乙醇为提取溶剂的提取优化结果：以乙醇为溶剂进行超声提取，主要考察a(乙醇浓度/％)、b(液料比ml/g)、c(超声时间/min)三个因素，根据每个因素设置了三个水平(如表7)，此设置考察了不同提取条件对杭白芍提取物主要成分总含量的影响，选用l9(34)表设计正交实验(如表8)将杭白芍粉碎，精密称取0.4g杭白芍粉末，置于锥形瓶中，按表7各因素水平分别采用一定料液比和浓度的乙醇为提取溶剂，35℃超声提取一定时间后，过滤，得滤液，用旋转蒸发器旋蒸，得浸膏，用5ml相应浓度的乙醇溶解浸膏，混匀，溶液4℃保存待测。按表8正交试验设计共提取制备了9份乙醇提取物供试品溶液，将各溶液按供试品进样前处理后，进样分析，分别测出各份提取物中主要成分的总含量，结果见表8。表7因素水平表8因素水平乙醇提取物l9(34)正交实验结果根据表8中9份乙醇提取物主要成分总含量结果分别进行极差计算和方差计算，结果分别见表9和表10。表9乙醇提取物主要成分总含量极差分析abcdeij0.07830.05120.05140.0569iij0.07690.05710.05860.0605iiij0.01780.06470.06300.0557kj3333ij/kj0.02610.01710.01710.0190iij/kj0.02560.01900.01950.0202iiij/kj0.00590.02160.02100.0186极差dj0.02020.00450.00390.0016由表9极差分析可得，乙醇浓度对总含量的影响最大，其次是液料比。表10乙醇提取物主要成分总含量方差分析根据表10乙醇提取物方差分析结果，查《f分布数值表》可知：f(α＝0.005，f1＝2，f2＝2)＝199>f1，f(α＝0.01，f1＝2，f2＝2)＝99<f1；f(α＝0.1，f1＝2，f2＝2)＝9>f2，f(α＝0.15，f1＝2，f2＝2)＝5.667<f2；f(α＝0.15，f1＝2，f2＝2)＝5.667>f3，f(α＝0.2，f1＝2，f2＝2)＝4<f3。所以在乙醇提取物中，乙醇浓度在α＝0.005水平上显著；液料比在α＝0.15水平上显著；超声提取时间在α＝0.2水平上显著。各因素、水平对乙醇提取物中主要成分总含量的影响变化趋势如图8～10所示。图8是乙醇提取有效成分总含量随乙醇浓度的变化趋势图，可以看出随着提取溶剂乙醇浓度的增大，总含量先升高后降低，乙醇浓度为70％时，提取有效成分总含量最高；图9是乙醇提取有效成分总含量随液料比的变化趋势图，可以看出随着液料比的增大，总含量升高，液料比为200ml/g时，提取有效成分总含量最高；图10是乙醇提取有效成分总含量随超声时间的变化趋势图,可以看出随着超声提取时间的增长，总含量升高，超声时间为30min时，提取有效成分总含量最高。综上所述，根据图5～7和图8～10各因素水平变化趋势、表5和表9极差分析、表6和表10方差分析结果显示，提取溶剂的浓度因素对杭白芍中主要有效成分总含量有较显著影响，各因素作用主次为a>b>c。甲醇提取物中a因素以70％甲醇为浓度提取时的总含量最大，b因素中k3>k2>k1，c因素中超声时间为30min时总含量最大，所以甲醇为溶剂的最佳提取条件是a2b2c3或a2b3c3。乙醇提取物中a因素以50％或70％乙醇为浓度提取时总含量最大，b因素中k3≈k2>k1，c因素中超声时间为30min时总含量最大，所以乙醇为溶剂的最佳提取条件是a1b3c3或a2b3c3。综合比较显示乙醇提取物中主要有效成分总含量比甲醇提取物高，其次考虑到溶剂乙醇较甲醇低毒、经济，所以筛选结果选择乙醇作为最终提取溶剂。筛选结果显示以乙醇为溶剂的最佳提取条件为a1b3c3和a2b3c3，这两个条件得到的有效成分总含量结果相差不大，为了验证并确定最优的提取条件，将杭白芍药材以乙醇为提取溶剂按照a1b3c3和a2b3c3两个条件分别进行提取，再次验证并比较两种提取方法得到的有效成分总含量。按a1b3c3提取条件的验证方法：采用50％的乙醇为提取溶剂，液料比200ml/g，35℃超声提取30min，按上述供试品的制备方法处理，得供试品溶液，再按供试品进样前处理后，采用hplc法进样分析，根据随行标曲计算各成分的质量浓度，并求算各成分的含量。按a2b3c3提取条件的验证方法：采用70％的乙醇为提取溶剂，液料比200ml/g，35℃超声提取30min，按上述供试品的制备方法处理，得供试品溶液，再按供试品进样前处理后，采用hplc法进样分析，根据随行标曲计算各成分的质量浓度，并求算各成分的含量。实验结果(见表11)表明，以70％乙醇作为提取溶剂获得杭白芍有效成分的总含量为0.0292g/g，大于以50％乙醇作为提取溶剂获得的有效成分总含量0.0238g/g。因此，结果选择a2b3c3条件作为杭白芍有效成分提取的最优提取条件，即采用70％乙醇为提取溶剂，液料比200ml/g，超声提取时间30min。表11乙醇为溶剂的两种提取条件a1b3c3和a2b3c3的提取结果结论：本研究建立了一种同时测定杭白芍9种主要成分的hplc法(所述hplc法定量分析浸膏中有效成分中，色谱条件：色谱柱为xb-c18柱(4.6×250mm，5μm)，流动相：0.1％磷酸水溶液(a相)-乙腈(c相)，线性梯度洗脱：0min10％c，5min15％c，25min22％c，45min70％c，46min80％c，48min80％c。流速0.8ml/min，检测波长230nm，柱温30℃，进样量10μl。)，经方法学验证表明所建立的方法具有较高的专属性、灵敏度和准确性，可以用于杭白芍的主要有效成分分析。基于所建立的hplc方法，本研究以杭白芍9种主要成分总含量为指标对杭白芍的提取工艺条件进行了优化。首先，比较了超声提取和回流提取两种方法，结果显示超声提取法获得的9种成分总含量高于回流提取法。然后，基于超声提取法，运用3因素3水平的正交试验设计，分别考察了溶剂的种类(甲醇和乙醇)、溶剂的浓度(50％、70％、85％甲醇和50％、70％、85％乙醇)、液料比(50:1、100:1、200:1)和超声时间(10min、20min、30min)对杭白芍9种主要成分总含量的影响，研究结果发现溶剂的浓度对杭白芍主要物质的提取效果影响最大，其次是液料比，超声时间对杭白芍主要物质的提取效果影响最小。最后，根据正交试验结果分析并确定杭白芍的最佳提取工艺条件，即提取溶剂为70％乙醇，液料比200ml/g，超声提取时间30min。本研究建立hplc法同时测定杭白芍9种主要成分的含量，通过正交试验设计筛选优化杭白芍主要有效成分的提取工艺，最后确定了一种提取方法简单、提取物质成分多、提取效率相对较高的杭白芍提取方法。本研究结果帮助揭示了杭白芍的物质基础，为杭白芍的药效评价、作用机制及体内过程研究提供了科学依据，也为中药杭白芍的质量控制和产品开发提供了参考信息。以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。当前第1页12