一种马钱子碱可溶性微针、制备方法及检测方法和应用与流程

本发明涉及医药发明领域，具体涉及一种马钱子碱可溶性微针、制备方法及检测方法和应用。

背景技术：

类风湿关节炎(ra)是当今社会对人类影响最大的疾病之一，有着致残率高(仅次于疟疾等疾病)、发病率高(在全世界平均约为0.5％～1.0％)、复发率高等特点，而且当前药物副作用大，至今尚无治疗ra的特效的药物及方法，因此，研究一种高效低毒的治疗类风湿性关节炎的药物是当今社会亟待解决的问题。

有学者研究表明马钱子碱(bru)在治疗炎症方面有显著疗效，是治疗ra的一种理想药物，对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞的增殖有良好的抑制作用。然而，bru具有毒性，虽然毒性仅为马钱子的1/20，但组织亲和性高，给药后能迅速向组织内分布至各个器官，特别是能穿透血脑屏障后引发中枢系统的毒性，严重中毒时会致患者死亡。

王绚.优化马钱子碱总生物碱的经皮给药制剂研究[d].南京中医药大学，2012(04)报道了经皮给药过程中，降低中枢毒性的同时也可能会降低中枢镇痛作用，但对外周镇痛作用的影响极小，因此经皮给药是使马钱子碱增效减毒的理想手段。

胡巍，陈军，蔡宝昌,等.马钱子碱经皮给药的镇痛作用[j].中华中医药学刊，2008，26(2):385-386但bru经皮吸收后即可被快速消除，半衰期(t1/2)短，极不利于其发挥药效。毒性大和半衰期短这两大特点限制了马钱子碱在临床上的应用。

吴玉，等.马钱子碱传递体的体外透皮与促渗性质研究[j].中国中药杂志，2016,41(16)：3009-3015有研究者将bru开发成贴剂、微乳、囊泡及脂质体。

经皮给药可延长药物的释放时间，克服了半衰期短的问题，然而角质层这层屏障始终还是阻止了部分药物透过皮肤，难以达到高效的目的。

微针阵列是新兴的一种经皮给药技术，它能刺穿皮肤角质层而不触及到疼痛神经，能提高患者依从性。微针可分为中空微针和实心微针两大类，中空微针相当于排成阵列的注射针头，刺入皮肤后药物从各针管内释放出来从而发挥药效。实心微针又可分为生物可降解性微针、皮肤预处理微针和药物涂层微针3种类型。

本发明设计采用高分子材料硫酸软骨素和聚乙烯吡咯烷酮为基质并采用真空减压法将马钱子碱制备成生物可降解微针，采用高效液相色谱法测定样品中马钱子碱含量和体外透皮效果,制备的马钱子碱可溶性微针形态学和机械性能良好，解决了药物难以透过角质层的难题、解决了马钱子碱在治疗类风湿性关节炎疾病方面有效剂量与中毒剂量十分接近、严重限制了其在临床上的应用的问题；本发明制备的马钱子碱可溶性微针能够显著减轻踝关节部位滑膜上皮增生与软骨侵蚀，维持关节间隙，对大鼠ra具有良好的治疗作用；建立的马钱子碱含量测定方法简单准确，可行度高。

技术实现要素：

本发明的目的是为了提供一种马钱子碱可溶性微针。

本发明的另一目的是为了提供一种马钱子碱可溶性微针的制备方法。

本发明的另一目的是为了提供一种马钱子碱可溶性微针的检测方法；

本发明的另一目的是为了提供一种马钱子碱可溶性微针在治疗类风湿性关节炎疾病方面的应用。

本发明所述的马钱子碱可溶性微针由以下成分按以下配比制成：马钱子碱0.012002份～0.012010份,硫酸软骨素0.998份～1.006份，聚乙烯吡咯烷酮0.997份～1.005份。

优选的，本发明所述的马钱子碱可溶性微针由以下成分按以下配比制成：马钱子碱0.012004份～0.012008份,硫酸软骨素1.000份～1.004份，聚乙烯吡咯烷酮0.999份～1.003份。

进一步优选的，本发明所述的马钱子碱可溶性微针由以下成分按以下配比制成：马钱子碱0.012006份、硫酸软骨素1.002份、聚乙烯吡咯烷酮1.001份。

本发明所述马钱子碱可溶性微针的制备方法由以下步骤制成：

1)称取配方量的马钱子碱，加入1.4ml～1.8ml纯净水，超声使其溶解，得马钱子碱药物水溶液；

2)称取配方量的聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素混匀后加入步骤1)马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液；

3)溶胀2h～4h后浇注到微针模具，放入18℃～22℃真空干燥箱中，减压；

4)取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化3天～5天、脱模，得马钱子碱可溶性微针。

优选的，本发明所述马钱子碱可溶性微针的制备方法由以下步骤制成：

1)称取配方量的马钱子碱，加入1.6ml纯净水，超声使其溶解，得马钱子碱药物水溶液；

2)称取配方量的聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素混匀后加入步骤1)马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液；

3)溶胀3h后浇注到微针模具，放入20℃真空干燥箱中，减压；

4)取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化4天、脱模，得马钱子碱可溶性微针。

前述减压条件为0.07mpa～0.09mpa。

前述减压时间为25min～35min。

本发明所述的马钱子碱可溶性微针测定方法，照高效液相色谱法测定，具体方法为：

(一)色谱条件：agilentc184.6mm×250mm,5um，流动相a:流动相b按体积比为30:70，流动相a为甲醇，流动相b按体积比为水230：乙酸2.4：三乙胺0.3，检测波长为265nm，流速1ml/min，柱温30℃；

(二)溶液的制备

1)对照品溶液的制备

称取马钱子碱对照品0.00206g，精密称定，置于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得浓度为80μg/ml的马钱子碱对照品溶液；

2)供试品溶液的制备

精密称取马钱子碱可溶性微针0.1g，置于25ml容量瓶中，加25ml甲醇在功率200w、频率50khz下超声处理45min～50min，破坏微针的结构使包载于其中的药物充分释放出来，定容后经0.22μm微孔滤膜滤过，即得；

3)空白微针溶液的制备

精密称取空白微针0.1g，置于25ml容量瓶中，加25ml甲醇在功率200w、频率50khz下超声处理45min～50min，破坏微针的结构使包载于其中的药物充分释放出来，定容后经0.22μm微孔滤膜滤过，即得空白微针溶液；

(三)测定

1)专属性测定取第(二)项下的对照品溶液，供试品溶液，空白微针溶液各10μl，按第(一)项下色谱条件进样，测定；

2)线性关系测定

精密吸取第(二)项下马钱子碱对照品溶液0.5μl，2μl，4μl，6μl，8μl，10μl，按第(一)项下色谱条件进样，测定；

3)精密度测定

精密吸取第(二)项下马钱子碱对照品溶液2.0ml，用流动相定容至5ml，得浓度为0.032μg/μl的马钱子碱对照品溶液，精密吸取10μl进样，按第(一)项下色谱条件进样，测定；

4)重复性测定

称取同一批马钱子碱可溶性微针，置于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，精密吸取10μl，按第(一)项下色谱条件进样，测定；

5)稳定性测定

精密吸取同一份马钱子碱供试品溶液10μl于0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，48h按第(一)项下色谱条件进样，测定；

6)回收率的测定

称取适量马钱子碱可溶性微针粉末，按样品含量与对照品含量为1:1的比例加入对照品，精密吸取10μl按第(一)项下色谱条件测定；

7)样品含量测定

取第(二)项下的对照品溶液，供试品溶液，空白微针溶液各10μl，按第(一)项下色谱条件进样，测定样品中马钱子碱含量。

本发明所述空白微针的制备方法包括以下步骤：称取聚乙烯吡咯烷酮0.500g，硫酸软骨素0.500g，加入0.7ml～0.9ml纯净水，用玻璃棒迅速搅拌均匀，溶胀2h～4h后浇注于微针模具上，置于18℃～22℃的真空干燥箱中，抽真空至0.05mpa～0.09mpa，减压25min～35min，取出置于2℃～6℃冰箱内，静置过夜消泡后移至干燥器固化3～5天、脱模即得。

本发明所述马钱子碱可溶性微针在治疗类风湿性关节炎疾病方面的应用。

本发明所述聚乙烯吡咯烷酮可在聚乙烯吡咯烷酮k30、聚乙烯吡咯烷酮k25、聚乙烯吡咯烷酮k90中任选一种，优选为聚乙烯吡咯烷酮k30。

本发明制备方法中减压后优选为取一块无纺布直接平铺在经减压后的基质表面，置于干燥器使微针缓慢固化。

本发明有益效果：

1、本发明利用聚乙烯吡咯烷酮和硫酸软骨素为基质材料，采取真空减压法，制备的马钱子碱可溶性微针形态学和机械性能良好。

2、将马钱子碱制备成生物可降解微针，不仅起到缓释作用，患者不必屡次换药，提高了患者的依从性，解决半衰期短的问题，还能透过角质层，促进药物释放发挥药效，解决了药物难以透过角质层的难题。

3、采用高效液相色谱法测定样品中马钱子碱含量和体外透皮效果，马钱子碱的线性回归方程为y＝2e+06x+11263(r²＝0.9997)，线性范围为0.04μg～0.8μg；马钱子碱可溶性微针48小时内微针处理组的单位面积经皮渗透量为未经微针处理组的7.9406倍。

4、本发明建立的马钱子碱含量测定方法简单准确，可行度高。

5、本发明通过试验寻找出了质软、无刺激性的材料，由于采取真空减压法并在减压后取一块无纺布直接平铺在经减压后的基质表面，基质的干燥顺序是由针孔处缓慢到达背衬层，本发明制备的微针达到了针硬膜软的形态，使患者至自药开始就可以运动自如。

6、马钱子碱可溶性微针的制备工艺及原辅料经过严格的科学筛选，疗效显著，

无毒副作用，解决了马钱子碱在治疗类风湿性关节炎疾病方面有效剂量与中毒剂量十分接近、严重限制了其在临床上的应用的问题。

7、本发明制备的马钱子碱可溶性微针能够显著减轻大鼠关节肿胀，显著降低血清中tnf-ɑ和il-1β的水平，减轻踝关节部位滑膜上皮增生与软骨侵蚀，维持关节间隙，对大鼠ra具有良好的治疗作用。

8、本发明通过安全性试验证明，剂量范围内使用安全无毒副作用。

附图说明：

图1马钱子碱可溶性微针制备流程图

图2马钱子碱可溶性微针形态学考察图；a:显微镜俯视图；b.马钱子碱可溶性微针放大图；c.显微镜侧视图

图3马钱子碱可溶性微针穿刺试验图；a.铝箔穿刺实验；b.经亚甲基蓝溶液染色的皮肤穿刺实验；c.皮肤穿刺试验直观图

图4专属性试验中马钱子碱对照品hplc色谱图

图5专属性试验中马钱子碱可溶性微针hplc色谱图

图6专属性试验中去马钱子碱阴性hplc色谱图

图7马钱子碱可溶性微针体外经皮渗透试验曲线图a.微针穿刺皮肤组；b.微针溶液透皮试验组(皮肤未经微针处理)

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。

实施例1

空白微针的制备方法：

称取聚乙烯吡咯烷酮0.500g，硫酸软骨素0.500g，加入0.7ml纯净水，用玻璃棒迅速搅拌均匀，溶胀2h后浇注于微针模具上，置于18℃的真空干燥箱中，抽真空至0.05mpa，减压25min，取出置于2℃冰箱内，静置过夜消泡后移至干燥器固化3天、脱模，即得。

实施例2

空白微针的制备方法：

称取聚乙烯吡咯烷酮0.500g，硫酸软骨素0.500g，加入0.9ml纯净水，用玻璃棒迅速搅拌均匀，溶胀4h后浇注于微针模具上，置于22℃的真空干燥箱中，抽真空至0.09mpa，减压35min，取出置于6℃冰箱内，静置过夜消泡后移至干燥器固化5天、脱模，即得。

实施例3

空白微针的制备方法：

称取聚乙烯吡咯烷酮0.500g，硫酸软骨素0.500g，加入0.8ml纯净水，用玻璃棒迅速搅拌均匀，溶胀3h后浇注于微针模具上，置于20℃的真空干燥箱中，抽真空至0.07mpa，减压30min，取出置于4℃冰箱内，静置过夜消泡后移至干燥器固化4天、脱模，即得。

实施例4

马钱子碱可溶性微针

成分：马钱子碱0.012002g,硫酸软骨素0.998g，聚乙烯吡咯烷酮0.997g。

制备方法：

1)称取配方量的马钱子碱，加入1.4ml纯净水，超声使其溶解，得马钱子碱药物水溶液；

2)称取配方量的聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素混匀后加入步骤1)马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液；

3)溶胀2h后浇注到微针模具，放入18℃真空干燥箱中，在0.07mpa条件下减压25min；

4)取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化3天、脱模，得马钱子碱可溶性微针。

应用：治疗类风湿性关节炎疾病。

实施例5

马钱子碱可溶性微针

成分：马钱子碱0.012002g,硫酸软骨素0.998g，聚乙烯吡咯烷酮0.997g。

1)称取配方量的马钱子碱，加入1.8ml纯净水，超声使其溶解，得马钱子碱药物水溶液；

2)称取配方量的聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素混匀后加入步骤1)马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液；

3)溶胀2h～4h后浇注到微针模具，放入22℃真空干燥箱中，在0.09mpa条件下减压35min；

4)取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化5天、脱模，得马钱子碱可溶性微针。

应用：治疗类风湿性关节炎疾病。

实施例6

马钱子碱可溶性微针

成分：马钱子碱0.012002g,硫酸软骨素0.998g，聚乙烯吡咯烷酮0.997g。

1)称取配方量的马钱子碱，加入1.6ml纯净水，超声使其溶解，得马钱子碱药物水溶液；

2)称取配方量的聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素混匀后加入步骤1)马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液；

3)溶胀3h后浇注到微针模具，放入20℃真空干燥箱中，0.08mpa条件下减压30min；

4)取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化4天、脱模，得马钱子碱可溶性微针。

应用：治疗类风湿性关节炎疾病。

实施例7

马钱子碱可溶性微针

成分：马钱子碱0.012010g,硫酸软骨素1.006g，聚乙烯吡咯烷酮1.005g。

制备方法：

1)称取配方量的马钱子碱，加入1.4ml纯净水，超声使其溶解，得马钱子碱药物水溶液；

2)称取配方量的聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素混匀后加入步骤1)马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液；

3)溶胀2h后浇注到微针模具，放入18℃真空干燥箱中，在0.07mpa条件下减压25min；

4)取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化3天、脱模，得马钱子碱可溶性微针。

应用：治疗类风湿性关节炎疾病。

实施例8

马钱子碱可溶性微针

成分：马钱子碱0.012010g,硫酸软骨素1.006g，聚乙烯吡咯烷酮1.005g。

1)称取配方量的马钱子碱，加入1.8ml纯净水，超声使其溶解，得马钱子碱药物水溶液；

2)称取配方量的聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素混匀后加入步骤1)马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液；

3)溶胀4h后浇注到微针模具，放入22℃真空干燥箱中，在0.09mpa条件下减压35min；

4)取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化5天、脱模，得马钱子碱可溶性微针。

应用：治疗类风湿性关节炎疾病。

实施例9

马钱子碱可溶性微针

成分：马钱子碱0.012010g,硫酸软骨素1.006g，聚乙烯吡咯烷酮1.005g。

1)称取配方量的马钱子碱，加入1.6ml纯净水，超声使其溶解，得马钱子碱药物水溶液；

2)称取配方量的聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素混匀后加入步骤1)马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液；

3)溶胀3h后浇注到微针模具，放入20℃真空干燥箱中，0.08mpa条件下减压30min；

4)取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化4天、脱模，得马钱子碱可溶性微针。

应用：治疗类风湿性关节炎疾病。

实施例10

马钱子碱可溶性微针

成分：马钱子碱0.012004g,硫酸软骨素1.000g，聚乙烯吡咯烷酮0.999g。

制备方法：

1)称取配方量的马钱子碱，加入1.4ml纯净水，超声使其溶解，得马钱子碱药物水溶液；

2)称取配方量的聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素混匀后加入步骤1)马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液；

3)溶胀2h后浇注到微针模具，放入18℃真空干燥箱中，在0.07mpa条件下减压25min；

4)取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化3天、脱模，得马钱子碱可溶性微针。

应用：治疗类风湿性关节炎疾病。

实施例11

马钱子碱可溶性微针

成分：马钱子碱0.012004g,硫酸软骨素1.000g，聚乙烯吡咯烷酮0.999g。

1)称取配方量的马钱子碱，加入1.8ml纯净水，超声使其溶解，得马钱子碱药物水溶液；

2)称取配方量的聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素混匀后加入步骤1)马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液；

3)溶胀2h～4h后浇注到微针模具，放入22℃真空干燥箱中，在0.09mpa条件下减压35min；

4)取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化5天、脱模，得马钱子碱可溶性微针。

应用：治疗类风湿性关节炎疾病。

实施例12

马钱子碱可溶性微针

成分：马钱子碱0.012004g,硫酸软骨素1.000g，聚乙烯吡咯烷酮0.999g。

1)称取配方量的马钱子碱，加入1.6ml纯净水，超声使其溶解，得马钱子碱药物水溶液；

2)称取配方量的聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素混匀后加入步骤1)马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液；

3)溶胀3h后浇注到微针模具，放入20℃真空干燥箱中，0.08mpa条件下减压30min；

4)取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化4天、脱模，得马钱子碱可溶性微针。

应用：治疗类风湿性关节炎疾病。

实施例13

马钱子碱可溶性微针

成分：马钱子碱0.012008g,硫酸软骨素1.004g，聚乙烯吡咯烷酮1.003g。

制备方法：

1)称取配方量的马钱子碱，加入1.4ml纯净水，超声使其溶解，得马钱子碱药物水溶液；

2)称取配方量的聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素混匀后加入步骤1)马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液；

3)溶胀2h后浇注到微针模具，放入18℃真空干燥箱中，在0.07mpa条件下减压25min；

4)取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化3天、脱模，得马钱子碱可溶性微针。

应用：治疗类风湿性关节炎疾病。

实施例14

马钱子碱可溶性微针

成分：马钱子碱0.012008g,硫酸软骨素1.004g，聚乙烯吡咯烷酮1.003g。

1)称取配方量的马钱子碱，加入1.8ml纯净水，超声使其溶解，得马钱子碱药物水溶液；

2)称取配方量的聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素混匀后加入步骤1)马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液；

3)溶胀4h后浇注到微针模具，放入22℃真空干燥箱中，在0.09mpa条件下减压35min；

4)取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化5天、脱模，得马钱子碱可溶性微针。

应用：治疗类风湿性关节炎疾病。

实施例15

马钱子碱可溶性微针

成分：马钱子碱0.012008g,硫酸软骨素1.004g，聚乙烯吡咯烷酮1.003g。

1)称取配方量的马钱子碱，加入1.6ml纯净水，超声使其溶解，得马钱子碱药物水溶液；

2)称取配方量的聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素混匀后加入步骤1)马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液；

3)溶胀3h后浇注到微针模具，放入20℃真空干燥箱中，0.08mpa条件下减压30min；

4)取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化4天、脱模，得马钱子碱可溶性微针。

应用：治疗类风湿性关节炎疾病。

实施例16

马钱子碱可溶性微针

成分：马钱子碱0.012006g、硫酸软骨素1.002g、聚乙烯吡咯烷酮1.001g。

1)称取配方量的马钱子碱，加入1.6ml纯净水，超声使其溶解，得马钱子碱药物水溶液；

2)称取配方量的聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素混匀后加入步骤1)马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液；

3)溶胀3h后浇注到微针模具，放入20℃真空干燥箱中，0.07mpa条件下减压30min；

4)取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化4天、脱模，得马钱子碱可溶性微针。

应用：治疗类风湿性关节炎疾病。

实施例4-实施例16按以下任一实施例的测定方法测定

实施例17：测定方法(一)：

(一)色谱条件：agilentc184.6mm×250mm,5um，流动相a:流动相b按体积比为30:70，流动相a为甲醇，流动相b按体积比为水230：乙酸2.4：三乙胺0.3，检测波长为265nm，流速1ml/min，柱温30℃；

(二)溶液的制备

1)对照品溶液的制备

称取马钱子碱对照品0.00206g，精密称定，置于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得浓度为80μg/ml的马钱子碱对照品溶液；

2)供试品溶液的制备

精密称取马钱子碱可溶性微针0.1g，置于25ml容量瓶中，加25ml甲醇在功率200w、频率50khz下超声处理45min，破坏微针的结构使包载于其中的药物充分释放出来，定容后经0.22μm微孔滤膜滤过，即得；

3)空白微针溶液的制备

精密称取空白微针0.1g，置于25ml容量瓶中，加25ml甲醇在功率200w、频率50khz下超声处理45min，破坏微针的结构使包载于其中的药物充分释放出来，定容后经0.22μm微孔滤膜滤过，即得空白微针溶液；

(三)测定

1)专属性测定取第(二)项下的对照品溶液，供试品溶液，空白微针溶液各10μl，按第(一)项下色谱条件进样，测定；

2)线性关系测定

精密吸取第(二)项下马钱子碱对照品溶液0.5μl，2μl，4μl，6μl，8μl，10μl，按第(一)项下色谱条件进样，测定；

3)精密度测定

精密吸取第(二)项下马钱子碱对照品溶液2.0ml，用流动相定容至5ml，得浓度为0.032μg/μl的马钱子碱对照品溶液，精密吸取10μl进样，按第(一)项下色谱条件进样，测定；

4)重复性测定

称取同一批马钱子碱可溶性微针，置于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，精密吸取10μl，按第(一)项下色谱条件进样，测定；

5)稳定性测定

精密吸取同一份马钱子碱供试品溶液10μl于0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，48h按第(一)项下色谱条件进样，测定；

6)回收率的测定

称取适量马钱子碱可溶性微针粉末，按样品含量与对照品含量为1:1的比例加入对照品，精密吸取10μl按第(一)项下色谱条件测定；

7)样品含量测定

取第(二)项下的对照品溶液，供试品溶液，空白微针溶液各10μl，按第(一)项下色谱条件进样，测定样品中马钱子碱含量。

实施例18：测定方法(二)：

(一)色谱条件：agilentc184.6mm×250mm,5um，流动相a:流动相b按体积比为30:70，流动相a为甲醇，流动相b按体积比为水230：乙酸2.4：三乙胺0.3，检测波长为265nm，流速1ml/min，柱温30℃；

(二)溶液的制备

1)对照品溶液的制备

称取马钱子碱对照品0.00206g，精密称定，置于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得浓度为80μg/ml的马钱子碱对照品溶液；

2)供试品溶液的制备

精密称取马钱子碱可溶性微针0.1g，置于25ml容量瓶中，加25ml甲醇在功率200w、频率50khz下超声处理50min，破坏微针的结构使包载于其中的药物充分释放出来，定容后经0.22μm微孔滤膜滤过，即得；

3)空白微针溶液的制备

精密称取空白微针0.1g，置于25ml容量瓶中，加25ml甲醇在功率200w、频率50khz下超声处理50min，破坏微针的结构使包载于其中的药物充分释放出来，定容后经0.22μm微孔滤膜滤过，即得空白微针溶液；

(三)测定

1)专属性测定取第(二)项下的对照品溶液，供试品溶液，空白微针溶液各10μl，按第(一)项下色谱条件进样，测定；

2)线性关系测定

精密吸取第(二)项下马钱子碱对照品溶液0.5μl，2μl，4μl，6μl，8μl，10μl，按第(一)项下色谱条件进样，测定；

3)精密度测定

精密吸取第(二)项下马钱子碱对照品溶液2.0ml，用流动相定容至5ml，得浓度为0.032μg/μl的马钱子碱对照品溶液，精密吸取10μl进样，按第(一)项下色谱条件进样，测定；

4)重复性测定

称取同一批马钱子碱可溶性微针，置于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，精密吸取10μl，按第(一)项下色谱条件进样，测定；

5)稳定性测定

精密吸取同一份马钱子碱供试品溶液10μl于0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，48h按第(一)项下色谱条件进样，测定；

6)回收率的测定

称取适量马钱子碱可溶性微针粉末，按样品含量与对照品含量为1:1的比例加入对照品，精密吸取10μl按第(一)项下色谱条件测定；

7)样品含量测定

取第(二)项下的对照品溶液，供试品溶液，空白微针溶液各10μl，按第(一)项下色谱条件进样，测定样品中马钱子碱含量。

为了进一步验证本发明的可行性，发明人进行了一系列的试验，具体如下：

1仪器、试剂与试药

1.1仪器

dzf-6050型真空干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)、hf-50数显维拉力计(福州艾普仪器有限公司)、岛津lc-2010型高效液相色谱仪(日本岛津公司)、安捷伦c18色谱柱、微针模具、ryj-12b型药物透皮扩散仪(上海黄海药检仪器有限公司)、sk8210hp型超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)、显微镜(舜宇恒平仪器)、铝箔、ja2003型十万分之一分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)、千分之一分析天平(shimadzu/岛津)。

1.2试药

马钱子碱对照品(纯度：99.27％，北京中科质检生物技术有限公司，批号：17091910)、甲醇(天津市恒光化学试剂制造有限公司，批号：20150307)、三乙胺(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20150120)、异丙醇(天津市致远化学试剂有限公司，批号：20150901)、乙酸、95％乙醇、纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)、聚乙烯吡咯烷酮k30(河南博纳生物科技有限公司)、硫酸软骨素(湖南天丰生物科技有限公司)、亚甲基蓝溶液(天津市科密欧化学试剂有限公司)、生理盐水(贵州科伦药业有限公司)。

2制备工艺研究

2.1空白微针的制备

2.1.1基质的选择

表1各基质对微针成型性的影响

从表1可知，cs+pvp穿刺效果好、外形美观，因此作为本发明的优选基质。

2.1.2加水量的影响

称取聚乙烯吡咯烷酮0.500g，硫酸软骨素0.500g，等量称取6份，分别混匀，以微针成型性为考察指标，分别加入0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml纯净水，用玻璃棒迅速搅拌均匀，溶胀3h后浇注于微针模具上，置于20℃的真空干燥箱中，抽真空至0.07mpa，减压30min，取出置于冰箱内(4℃，下同)，静置过夜消泡后移至干燥器固化脱模即得。

结果表明：加水量低于0.7ml的时基质粘度过大，减压过程产生气泡后不易消除，加水量为0.9ml时干燥过程中易缩水，0.8ml时加水量时无粘度、减压过程产生气泡后容易消除、且干燥过程不易缩水，因此最终确定加水量为0.7ml～0.9ml，加水量优选方案为0.8ml，即基质质量的80％；较好方案为0.9ml,可行方案为0.7ml。

2.1.3基质比例的影响

分别按表2称取聚乙烯吡咯烷酮，硫酸软骨素，混合均匀，加入0.48ml的纯净水，用玻璃棒快速搅拌均匀，溶胀3h后浇注于微针模具，置于20℃真空干燥箱中，抽真空至0.07mpa，减压30min，取出置于冰箱静置过夜消泡后移至干燥器中固化脱模，得空白微针。以微针的形态和穿刺效果为考查指标，显微镜下观察微针成型性，并用铝箔穿刺试验来考察微针的机械性能，以“优”“良”两个等级进行评价，结果如下表所示，最终确定的优选基质配比为1:1。

表2马钱子碱可溶性微针不同配料比考察

2.2.制备工艺筛选说明

2.2.1本研究在马钱子碱可溶性微针制备方法的筛选中，最初使用真空减压法，结果表明负压能使基质渗入微孔，但由于聚乙烯吡咯烷酮与硫酸软骨素制备的基质材料的黏度大，基质渗入微孔后留下的缝隙不能及时填补从而形成气泡，然后使用水平转子的低速离心机(最高转速5000rpm)制备的微针也能顺利使基质渗入微孔，且不会形成气泡，但由于离心过程中同时受离心力和重力的影响，基质容易溢出模具，造成马钱子碱可溶性微针贴片重量差异大，基质溢出过多的情况下甚至会导致离心时朝上的部分无材料渗入形成微针，即使加大基质粘度也无法解决此问题。后来经过反复试验发现真空减压后在潮湿的环境下静置过夜，形成的气泡会自动消除，此即为最终确定的方法。

2.1.2含量测定实验中马钱子碱的出峰时间后移了约4min，原因可能与气候变化有关。

2.1.3关于背衬材料的筛选，本发明的目的是要寻找质软、无刺激性的材料，将微针制备成针硬膜软的形态，以使患者至自药开始就可以运动自如，曾考察过羧甲基纤维素钠、卡波姆、壳聚糖、硫酸软骨素、明胶等作为背衬材料，实验方法是先注模减压使基质渗入微孔后，再用金属药匙刮去微孔上层的基质，加入待考察的背衬材料后减压使其与微针材料紧贴，最后固化脱模。发现微针的数目均明显减少，针形也不清晰完整，但由于基质粘度过大，刮去针孔上层的过程中极易牵动针孔中的基质，致使微针的数目均明显减少，针形也不清晰完整。为了避免上述问题，随后取一块无纺布直接平铺在经减压后的基质表面，置于干燥器使微针缓慢固化。结果发现基质的干燥顺序是由针孔处缓慢到达背衬层，本发明制备的微针达到了针硬膜软的目的。

2.3马钱子碱可溶性微针的制备

2.3.1药物剂量的确定

何晓玮，范晓萍，钟涛，等.马钱子碱新型给药系统治疗类风湿性关节炎的研究进展[j].中华中医药学刊，2015,33(12):2908-2911中描述马钱子碱在8～16mg/kg范围的剂量对炎症反应有明显的抑制作用，对免疫器官重量几乎无影响。本发明确定的剂量为8mg/kg，以180g大鼠计，则每片微针贴片应含1.44mg马钱子碱。

2.3.2马钱子碱可溶性微针的制备流程(由于药物组成一样，因此只选取实施例16做相应的试验)。

称取马钱子碱0.012006g，加入1.6ml纯净水，超声使其溶解，称取pvp1.001g，cs1.002g混匀后加入马钱子碱药物水溶液中，快速搅拌使形成均一溶液，溶胀3h后浇注与微针模具(浇注制备六片微针)，放入20℃真空干燥箱中，0.07mpa条件下减压30min，取出于室内静置过夜消泡后移至干燥器中固化脱模，得马钱子碱可溶性微针。马钱子碱可溶性微针制备流程见图1。

3马钱子碱可溶性微针的主要特征

3.1形态

用显微镜观察马钱子碱可溶性微针数目清晰，针形完整，长度为384μm，马钱子碱可溶性微针形态学考察见图2。

3.2机械性能

采用铝箔穿刺和离体大鼠皮肤穿刺试验来评价微针的穿刺性能。铝箔穿刺时，将微针水平放在铝箔上，向其施加10n的力，维持2min即可刺穿铝箔。离体大鼠皮肤穿刺试验时，取两块大鼠皮肤，将微针平放于其中一块皮肤上，向其施加10n的力，停留在皮肤3min，取出微针，另一块皮肤不用微针处理作为对照组，两块均立即用亚甲基蓝溶液染色，1min后用异丙醇试剂洗去亚甲基蓝溶液。

结果表明：经微针处理后的皮肤用亚甲基蓝染色后难以洗净，未经微针处理的皮肤上的亚甲基蓝则可被轻易洗净，表明该微针能顺利刺穿皮肤角质层，马钱子碱可溶性微针穿刺试验见图3。

4载药量的测定

4.1色谱条件

色谱柱：agilentc18(4.6mm×250mm,5um)，流动相a(甲醇)-流动相b[水-乙酸-三乙胺[230:2.4:0.3,(v/v/v)](30:70,v/v)]；检测波长为265nm，流速1ml/min，柱温30℃，进样量为10ul。

4.2溶液的制备

4.2.1对照品溶液的制备

称取马钱子碱对照品0.00206g，精密称定，置于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得浓度为80μg/ml的马钱子碱对照品溶液。

4.2.2供试品溶液的制备

精密称取马钱子碱可溶性微针适量，置于25ml容量瓶中，加适量甲醇超声(功率：200w，频率：50khz)处理45min，破坏微针的结构使包载于其中的药物充分释放出来，定容后经0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

4.2.3空白微针溶液的制备

精密称取空白微针适量，按“4.2.2”项下方法制得空白微针溶液。

4.3专属性试验

取“4.2”项下的对照品溶液，马钱子碱可溶性微针溶液，空白微针溶液各10μl，按“4.1”项下色谱条件进样，表明该法对马钱子碱具有专属性。专属性试验中马钱子碱对照品hplc色谱图见图4；专属性试验中马钱子碱可溶性微针hplc色谱图见图5；专属性试验中去马钱子碱阴性hplc色谱图见图6。

4.4线性关系的考察

精密吸取“4.2”项下马钱子碱对照品溶液0.5，2，4，6，8，10μl，按“4.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积a对药物进样量(m)做线性回归，记录色谱峰面积。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐进行线性回归。得回归方程为y＝2e+06x+11263(r²＝0.9997)，表明马钱子碱在0.04μg～0.8μg范围内，峰面积与对照品进样量呈良好的线性关系。

表3马钱子碱对照品标准曲线

4.5精密度试验

精密吸取马钱子碱对照品溶液2.0ml，用流动相定容至5ml，得浓度为0.032μg/μl的马钱子碱对照品溶液，精密吸取10μl进样，平行6次，rsd％为1.41，表明仪器精密度良好。

表4精密度试验结果

4.6重复性试验

称取同一批马钱子碱可溶性微针，置于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，按“4.1”项下进样，平行6份，记录色谱图，rsd为0.44％，表明该法重复性良好。

表5重复性试验结果

4.7稳定性试验

精密吸取同一份马钱子碱供试品溶液于0，2，4，6，8，12，24，48h进样测定，马钱子碱峰面积的rsd为0.62％。

表6供试品溶液稳定性试验

4.8回收率的测定

称取适量马钱子碱可溶性微针粉末，按样品含量与对照品含量为1:1的比例加入对照品，平行6份，按“4.1”项下色谱条件测定，计算得平均回收率为97.77％，rsd为2.75％，表明回收率的重现性良好。

表7回收率试验结果

4.9样品含量测定

取本品3批，照含量测定项下方法测定样品中马钱子碱含量，每批平行测定3次，测定结果见表8。

表8马钱子碱可溶性微针样品含量测定结果

5马钱子碱可溶性微针体外经皮渗透试验

5.1大鼠皮肤的处理

取健康大鼠，用戊巴比妥麻醉后，立即用飞科剃须刀对大鼠腹部进行剃毛，脱臼处死，小心剥离腹部皮肤，除尽皮下脂肪层，用生理盐水清洗至无浑浊，取出，用滤纸吸干，备用。

5.2体外经皮渗透性的测定

取实施例16马钱子碱可溶性微针，施加10n的力穿刺皮肤并用无纺布粘连在皮肤上。采用立式透皮扩散试验仪(有效扩散面积为2.8cm²，接收室容积为7ml)，将鼠皮置于供给池与接收池之间，角质层朝向供给池，真皮层朝向接收池，用夹子固定紧。以经脱气处理并37℃预热的20％乙醇的生理盐水为接收液，接收室水浴温度为37℃，磁力搅拌速度为300r/min，作为微针实验组；另取一片微针置于供给池中，加接收液1ml使其慢慢溶解，用于比较组，各平行两份，于2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，36h，48h取样1ml，用0.22μm微孔滤膜过滤，高效液相色谱仪进样测定马钱子碱的浓度，每次取样后立即补足相同体积相同温度的新鲜接收液，计算累积渗透量。

qn＝(cn×v0+∑ci×v)/s

式中qn为第n个取样点马钱子碱的单位面积累积渗透量(ug/cm²)，

cn为第n个取样点接收液中马钱子碱的质量浓度(μg/ml)，v为接收池体积(ml)，v0为取样体积(ml)，s为药物透过时有效透过面积(cm²)，ci为第i(i≤n-1个取样点测得的接收液中药物浓度(μg/ml)。

表9累积渗透量结果表

结果：48小时内微针处理组的单位面积经皮渗透量为未经微针处理组的7.9406倍。

5.3马钱子碱体外经皮渗透曲线的绘制

以单位面积累积渗透量为纵坐标，时间为横坐标，绘制的马钱子碱经皮渗透试验曲线如图7所示。

6马钱子碱可溶性微针的药效学评价

6.1实验动物

spf级sd大鼠(由重庆腾鑫生物技术有限公司提供)雌雄各半，体重180±50g。

6.2药物

马钱子碱；弗氏完全佐剂；

6.3动物分组

将健康大鼠随机分为16个组：模型对照组、基质组、马钱子碱可溶性微针给药组(实施例4组、实施例5组、实施例6组、实施例7组、实施例8组、实施例9组、实施例10组、实施例11组、实施例12组、实施例13组、实施例14组、实施例15组、实施例16组)、正常对照组，每组6只健康大鼠。

6.4类风湿关节炎大鼠模型的制备

将正常对照组外的其余各组大鼠麻醉后，于左后足趾进行酒精(75％)消毒并皮内注射完全弗氏佐剂(cfa)0.1ml制备类风湿关节炎炎症模型。

6.5给药

在造模成功后第二天开始给药，所有制剂均在左后足上药，马钱子微针给药组在踝关节处给予一片马钱子碱可溶性微针(每片微针含马钱子碱约1.44mg)，基质组在相同位置给予一片不含药的空白微针，按压1min后用医用胶布固定，模型对照组给予同体积的生理盐水0.1ml，正常对照组不做处理，连续给药15天。

6.6动物状态观察及足跖肿胀度测定

致炎后基质组、模型对照组大鼠饮食情况、活动能力有所降低，足跖和踝关节出现肿胀，且发红，并日渐加重；实施例4-16组大鼠治疗后大鼠饮食情况、活动能力未受影响，足跖和踝关节肿胀、发红症状日渐减轻，正常对照组无任何异常。各组大鼠用马钱子碱微针干预后15天内足肿胀度的变化如表10所示。

表10：马钱子碱可溶性微针对足肿胀度的影响

注：与正常对照组比较，*p<0.05；与模型对照组比较，#p<0.05。

6.7he染色法观察组织切片

经过he染色后在显微镜下观察各组大鼠滑膜组织、软骨、炎性细胞、血管翳等的情况。结果显示正常对照组大鼠的关节滑膜上皮排列整齐，未见血管翳生成与炎性细胞浸润，界限清楚。其它各组大鼠都可见滑膜上皮增生、炎性细胞浸润并伴有血管翳生成，软骨被侵蚀，其中基质组、模型对照组大鼠关节间隙已不可见，马钱子碱可溶性微针组大鼠软骨侵蚀情况较轻，仍可见变窄的关节间隙。

6.8elisa法测定大鼠血清中tnf-α、il-1β的含量

与正常对照组相比，模型对照组、空白基质组血清中tnf-α、il-1β含量显著增，高差异无统计学意义(p>0.05)；与模型对照组相比，实施例4-16组大鼠血清中tnf-α、il-1β含量显著降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。结果如表11所示。

表11：大鼠血清中tnf-α、il-1β含量结果表

注：与模型对照组比较，*p<0.05

通过药效学试验可知，本发明实施例4-16所制备的马钱子碱可溶性微针能够显著减轻大鼠关节肿胀，显著降低血清中tnf-ɑ和il-1β的水平，减轻踝关节部位滑膜上皮增生与软骨侵蚀，维持关节间隙，对大鼠ra具有良好的治疗作用。

7安全性评价

7.1实验动物

icr小鼠(用于急性毒性试验)，spf级，体重18-22g；spf级sd大鼠(用于长期毒性试验及刺激性试验等)，体重180g左右。大小鼠均雌雄各半，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供。

7.2药物及仪器

按实施例4-16所制备的马钱子碱可溶性微针；手术剪、眼科剪、镊子、医用酒精等。

7.3急性毒性试验

7.3.1动物分组

将健康小鼠随机分为：空白对照组、马钱子碱可溶性微针给药组(实施例4组、实施例5组、实施例6组、实施例7组、实施例8组、实施例9组、实施例10组、实施例11组、实施例12组、实施例13组、实施例14组、实施例15组、实施例16组)，共16个组，每组8只健康小鼠。

7.3.2给药

除空白对照组外，马钱子碱可溶性微针给药组给予实施例4-16所制备的马钱子碱微针处理(每片微针阵列载药量为1.44mg左右)，每只大鼠给予两片微针，一天一次。大鼠体重按180g计，据2.3.1项下马钱子碱的给药范围8-16mg/kg计算，给予两片微针，即达到单次最大给药量。

7.3.3方法及结果

观察并记录动物给药后当天的毒性反应和死亡情况。包括动物外观、皮肤、行为及反应、呼吸等；持续观察两周，两周后对仍存活动物进行大体解剖，观察心、肝、脾、肺、肾及胃肠等主要脏器及组织的改变。

空白组无任何异常；马钱子碱可溶性微针处理组小鼠给药当天至两周内无动物死亡，对外界反应、外观、行为及呼吸、腺体分泌等均未见异常，未观察到明显中毒症状，小鼠胸腔、心、肝、脾、肺、肾及胃肠等脏器未见异常。

7.4对皮肤的刺激性试验

取健康大鼠，将其麻醉，对给药区背部进行脱毛处理。给药前检查去毛皮肤是否因去毛而受损伤，选择皮肤状态良好的大鼠备用。沿背部中线选择左侧或右侧部位给予一片马钱子碱可溶性微针贴片(载药量为1.44mg)，并用医用胶布进一步固定。微针给药1h、12h、24h、36h后肉眼观察给药部位是否出现红斑和浮肿。结果发现给药1h、12h时对皮肤没有刺激性；给药24h时微针刺入处略微出现红点，无浮肿；给药36h时红点几乎完全消失。可认为所制备的马钱子碱可溶性微针几乎无刺激性。

7.5马钱子碱可溶性微针长期给药试验

取健康大鼠，将其麻醉后，除去膝大鼠关节部位的毛发，固定大鼠。用大拇指将一片马钱子碱可溶性微针贴片(载药量为1.44mg)按压于去除毛发的关节皮肤部位，停留1min后，以医用胶布固定马钱子碱可溶性微针，30min后取出马钱子碱可溶性微针，一天给药一次，观察给药前及给药15天后给药部位的皮肤情况。同时观察大鼠饮食活动等是否有异常，并对马钱子碱可溶性微针给药组大鼠进行大体解剖，观察长期给药后其心、肝、脾、肺、肾、胃、肠等是否有异常。马钱子碱可溶性微针给药15天后，大鼠膝关节部位皮肤有轻微损伤，表明马钱子碱可溶性微针长时间给药会对皮肤造成伤害但程度较轻；给药15天内大鼠未出现死亡，饮食、行为等无明显异常，解剖后其其心、肝、脾、肺、肾、胃、肠等无明显异常，故所制备的马钱子碱可溶性微针的安全性较高。

8总结

(一)本发明利用聚乙烯吡咯烷酮和硫酸软骨素为基质材料，采取真空减压法，制备的马钱子碱可溶性微针形态学和机械性能良好。

(二)将马钱子碱制备成生物可降解微针，不仅起到缓释作用，患者不必屡次换药，提高了患者的依从性，解决半衰期短的问题，还能透过角质层，促进药物释放发挥药效，解决了药物难以透过角质层的难题。

(三)采用高效液相色谱法测定样品中马钱子碱含量和体外透皮效果，马钱子碱的线性回归方程为y＝2e+06x+11263(r²＝0.9997)，线性范围为0.04μg～0.8μg；马钱子碱可溶性微针48小时内微针处理组的单位面积经皮渗透量为未经微针处理组的7.9406倍。

(四)本发明建立的马钱子碱含量测定方法简单准确，可行度高。

(五)本发明通过试验寻找出了质软、无刺激性的材料，由于采取真空减压法并在减压后取一块无纺布直接平铺在经减压后的基质表面，基质的干燥顺序是由针孔处缓慢到达背衬层，本发明制备的微针达到了针硬膜软的形态，使患者至自药开始就可以运动自如。

(六)马钱子碱可溶性微针的制备工艺及原辅料经过严格的科学筛选，疗效显著，无毒副作用，解决了马钱子碱在治疗类风湿性关节炎疾病方面有效剂量与中毒剂量十分接近、严重限制了其在临床上的应用的问题。

(七)本发明制备的马钱子碱可溶性微针能够显著减轻大鼠关节肿胀，显著降低血清中tnf-ɑ和il-1β的水平，减轻踝关节部位滑膜上皮增生与软骨侵蚀，维持关节间隙，对大鼠ra具有良好的治疗作用。

(八)本发明通过安全性试验证明，剂量范围内使用安全无毒副作用。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。