一种基于SERS技术的金黄色葡萄球菌定量检测方法与流程

本发明属于sers和金黄色葡萄球菌检测的技术领域，尤其涉及一种基于sers技术的金黄色葡萄球菌定量检测方法。

背景技术：

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)是一种重要的病原菌，其分泌的肠毒素有极强的耐高温、酸、蛋白酶水解及抗干燥特性，在食品加工和保藏过程中仍保持结构完整，极易引发食物中毒。在我国，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占所有细菌性食物中毒的比例高达20％～25％。其中毒症状主要表现为呕吐、发热、腹泻。金黄色葡萄球菌感染会引起局部化脓感染，也会引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。

传统金黄色葡萄球菌的检测方法主要包括：生物学方法、pcr方法、酶联免疫吸附法三大类。生物学方法通过多次选择性培养、革兰氏镜检、凝血检验、选择性平板计数等进行检测，这种方法具有检测成本低、准确性高等优点，但是其步骤繁琐、耗时长；pcr方法即聚合酶链式反应法，其经过对金黄色葡萄球菌rna的扩增、纯化、测序、匹配四个步骤达到特异性识别金黄色葡萄球菌的目的，该方法准确度高，但前期处理过程复杂、对操作人员要求高、设备昂贵；酶联免疫吸附法将金黄色葡萄球菌抗体固定，之后加入待测物，再加入酶标抗体、催化底物，利用催化产物的颜色进行检测，虽然该方法检测速度快，但抗体的制备复杂且易失活、结果可靠性低。因此，有必要开发快速、准确、廉价的金黄色葡萄球菌的检测方法。

表面增强拉曼散射(surfaceenhancementramanscattering,sers)属于拉曼散射的发展与延伸，其利用金、银等贵金属纳米颗粒作为sers基底，通过化学增强和物理增强机理增强待分析物的拉曼信号，可用于检测单分子层甚至亚单分子层的物质。具有操作简便、检测速度快、灵敏度高等优点。目前，sers已经成功地应用于食品检测、环境分析、生物医学、材料化学等领域。当然，目前也有大量的文献报道了利用sers检测细菌，其中对多种细菌的定性检测主要是通过与化学计量学结合，而对某种细菌的特异性检测主要是依靠连接了抗体的磁性探针捕捉细菌和修饰了抗体与信号分子的贵金属增强剂作为信号探针。前人报道的sers方法虽能达到快速检测细菌，但仍存在纳米探针合成复杂费时且重复性低、抗体或生物酶价格昂贵且容易失活、部分细菌信号较弱使得检测限较高等问题。

技术实现要素：

本发明根据现有技术中存在的问题，提出了一种基于sers技术的金黄色葡萄球菌定量检测方法，利用fe-mil-88纳米酶的类过氧化物酶活性和表面吸附性质，通过加入适配体达到特异性识别，通过sers技术对催化产物的检测达到定量检测金黄色葡萄球菌，本方法成本低、灵敏度高、可靠性强、检测速度快，适用于食品安全、环境检测、血液分析等技术邻域。

本发明所采用的技术方案如下：

一种基于sers技术的金黄色葡萄球菌定量检测方法，向待测金黄色葡萄球菌悬液中加入磁性捕捉探针，混合后，磁分离弃掉上清液，加入适量的适配体悬液，摇匀后孵化一段时间，磁分离取上清液，再加入适量fe-mil-88纳米酶，孵化一段时间，加入少量缓冲液、h2o2和无色孔雀石绿，孵化一段时间，当催化反应结束后，加入sers增强剂，获取拉曼信号后，建立拉曼信号与金黄色葡萄球菌浓度的标准曲线，从而实现对对金黄色葡萄球菌的定量检测。

进一步，所述孵化的温度选择37℃，孵化的时间选择1小时，可使无色孔雀石绿颜色具有显著的颜色变化。

进一步，所述磁性捕捉探针为羧基化的磁性捕捉探针，制备方法为：取六水合氯化铁(fecl3·6h2o)、乙酸钠、乙二醇、柠檬酸三钠二水，超声溶解后置于聚乙烯四氟高压反应釜，高温反应数小时，冷却到室温后用乙醇和纯水清洗数次，真空干燥。

进一步，所述fe-mil-88纳米酶的制备：取适量的对苯二甲酸、六水合氯化铁在二甲基甲酰胺中溶解后，加入少量乙酸，油浴高温反应几小时，冷却到室温，用水、dmf、乙醇清洗数次，最后配成水溶液备用。

进一步，所述sers增强剂选择金纳米棒。

进一步，所述无色孔雀石绿可替换为无色结晶紫。

进一步，所述缓冲液选用ph7.0的tris-hcl。

本发明的有益效果：

本发明用羧基化磁性捕捉探针富集金黄色葡萄球菌，相比于连接了抗体或适配体的磁性捕捉探针，其合成方法更加简单、富集效果更加稳定、实验的重复性更高。

本发明所用的fe-mil-88纳米酶，从制备角度讲，其具有合成方法简单、所用试剂廉价、制备时间短等优点。从应用角度讲，其催化能力强、性质稳定、对环境的耐受性强、便于存放和使用。

本发明所用的金纳米棒增强剂，其本身无sers信号，对实验结果没有干扰，且具有良好的增强效果以及稳定性，存放半年以上，增强效果没有显著变化，仍然可达到8×10⁶。

本发明结合了纳米酶和sers这两种信号放大手段，使得该方法可灵敏地检测金黄色葡萄球菌。

本发明利用适配体进行特异性识别，与抗体识别相比，检测费用更低、检测准确度更高(使用抗体存在由于其失活而导致的假阴性结果)。

本发明与前人的研究相比，构建的检测体系是一种开放式平台，其只需要更换适配体便能达到更换检测对象的目的，具有极高的应用价值。

附图说明

图1为金黄色葡萄球菌的检测流程及原理图；

图2为可行性验证图；

图3为不同浓度金黄色葡萄球菌在所构建体系中对应的sers光谱图；

图4为1618cm^-1拉曼位移处建立的标准曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

第一步，材料的制备：

带负电荷的磁性捕捉探针的制备：称取3.4gfecl3·6h2o、6g乙酸钠，加入100ml乙二醇搅拌使其混匀，加入1g柠檬酸三钠二水，超声30分钟使其溶解，之后将混合液导入聚乙烯四氟高压反应釜，在200℃反应10小时，冷却到室温后用乙醇和纯水清洗数次，然后在60℃下真空干燥12小时。

fe-mil-88纳米酶的制备：0.115g(0.692mmol)对苯二甲酸和0.187g(0.692mmol)fecl3·6h2o在30ml二甲基甲酰胺(dmf)中溶解，加入3.45mmol乙酸到该混合溶液中。油浴120℃反应4小时。之后冷却到室温，用水、dmf、乙醇清晰数次，最后分散到15ml水中。

金纳米棒的制备：种子液的合成：10ml(0.1m)的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)和250μl(0.01m)haucl4混合后，加入0.6ml(0.01m)冷却的硼氢化钠剧烈搅拌，随着硼氢化钠的加入，溶液的颜色从浅黄色变成浅棕色，随后将该溶液在室温静置2小时，使得种子生长成功。金纳米棒的生长：在50ml(0.1m)的ctab中加入2ml(0.01m)haucl4、0.1ml(0.01m)硝酸银(agno3)、0.32ml(0.1m)抗坏血酸、0.8ml(1.0m)盐酸(hcl)以及96μl的种子液，搅拌均匀后，在27℃静置6小时。当溶液的颜色从无色透明变成墨蓝色，证明金纳米棒合成成功。最后，制备成功的金纳米棒在12000rpm离心10分钟，弃去上层清液，再加水摇匀，然后按上述步骤离心清洗3次，最后将金纳米棒分散在5ml的纯水中备用。

第二步，确定材料的添加量：

捕捉探针的添加量是通过以下方法优化。通过平板计数得到浓度大概为10⁶cfu/ml的菌悬液，离心去掉上清液，再用pbs缓冲液清洗2次，以消除培养基的影响，用pbs配成(10⁶cfu/ml)的菌悬液。取1ml菌悬液，加入相同浓度不同体积(0，10，20，30，40，50，60，70μl)的捕捉探针，混合30秒到1分钟，磁分离取上清液，再加入1ml的pbs缓冲液，在600nm测吸光度，根据上清液的od值，发现50μl时，od600值就已经趋于稳定了，故选取50μl为最适的捕捉探针加入量。

fe-mil-88纳米酶添加量是通过以下方法优化。500μl的ph7.0的tris-hcl缓冲液加入定量的h2o2、无色孔雀石绿后，加入不同体积的纳米酶(0，10，20，30，40，50，60μl)37℃孵化1小时后测sers信号。结果表明当纳米酶为50μl时，在1168cm^-1位移处信号强度最高，故纳米酶的添加量为50μl。

金黄色葡萄球菌适配体的添加量是通过以下方法优化。在50μl的ph7.0的tris-hcl缓冲液中，加入50μl的纳米酶和相同浓度不同体积的金黄色葡萄球菌适配体(10，30，50，60，70，90，110)37℃孵化1小时，再加入tris-hcl缓冲液、h2o2、隐性孔雀石绿37℃孵化1小时，之后测体系上清液的sers信号。结果表明当适配体的添加量等于或超过90μl时，反应后体系的拉曼信号都较低，且趋于平稳，故选90μl适配体添加量。

第三步，定量检测过程：

如图1所示，取少量不同浓度梯度的金黄色葡萄球菌悬液加入捕捉探针，混合30秒到1分钟，磁分离弃掉上清液，加入适量的适配体悬液摇匀后37℃孵化一段时间，磁分离取上清液，加入适量fe-mil-88纳米酶，37℃孵化一段时间，加入少量ph7.0的tris-hcl缓冲液、h2o2、无色孔雀石绿，37℃孵化一段时间，如图2、3、4，检测上清液的拉曼信号，建立拉曼信号与金黄色葡萄球菌浓度的标准曲线。

为了验证本发明所提出得基于sers技术的金黄色葡萄球菌定量检测方法的可靠性，下面用实验区进行验证：

以鸡肉为例的实际样品的检测：称取25g新鲜的鸡胸脯肉，在无菌操作台切碎后，装在无菌袋中，两面各用紫外灯照射1小时灭菌，之后加入225ml高压灭菌后的蛋白胨水溶液，均质5min，过滤除去液体表面的泡沫以及大颗粒悬浮物，添加浓度分别为1×10²cfu/ml-1×10⁵cfu/ml的金黄色葡萄球菌。捕捉探针富集菌体后通过磁分离用ph7.0的tris-hcl缓冲液清洗菌体3次，洗去杂质干扰，弃掉上清液，在底部沉淀中加入的适配体悬液，纳米酶，催化底物等，用本发明设计的方法检测食物中的金黄色葡萄球菌，并与所添加的浓度做对比，结果如下表所示：

表1：实际鸡肉样本中金黄色葡萄球菌的加标回收结果

综上，本发明提出一种基于sers技术的金黄色葡萄球菌定量检测方法应用，其试验的结果表明本发明提供的方法特异性强、灵敏度高、可靠性强、稳定性强，可作为食品、环境等快速、有效、低成本的检测手段。

以上实施例仅用于说明本发明的设计思想和特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，本发明的保护范围不限于上述实施例。所以，凡依据本发明所揭示的原理、设计思路所作的等同变化或修饰，均在本发明的保护范围之内。