一种水溶性生化四氮唑盐荧光检测试剂的制备方法及其肿瘤细胞活力的检测方法与流程

本发明涉及荧光检测试剂的制备方法及其肿瘤细胞活力的检测方法。尤其涉及一种水溶性生化四氮唑盐荧光检测试剂的制备方法及其肿瘤细胞活力的检测方法。

背景技术：

四氮唑盐作为甲臜的氧化态，自十九世纪末被合成以来，其合成方法和应用研究受到很多科学家关注。

常用的氧化剂有：四醋酸铅、nbs等，但需要指出的是，四醋酸铅可得到高产量、更纯的产品，但该方法所需的反应温度较高、时间长，产物难以纯化；而采用nbs难以回收利用，其生产成本较大。

1941年，kuhn等对四氮唑盐-甲臜类化合物的深入研究发现这类化合物通过细胞酶的催化还原能在细菌的特定部位上染色且具有抗菌活性，直到1983年mosmann首次应用比色法将四氮唑盐mtt用于研究il-2等细胞因子对鼠淋巴瘤细胞系存活和增殖作用的影响，有关四氮唑盐比色法在细胞活力的测定、抗肿瘤药物的筛选、肿瘤临床的化疗药敏测定及关键试剂毒性分析等方面才备受关注，其具有简便、快捷、经济等优点。

作为在细胞生物学、细胞与分子毒理学、组织化学及临床诊断上的应用，非水溶性四氮唑盐得到了广泛的应用，由于四氮唑盐的结构中都不含水溶性基团，所以其还原态甲臜均不溶于水，而对于其定量的分析，则需加入有机溶剂溶解后方能比色，这样不仅操作步骤繁琐，也对定量分析的准确度和重现性造成影响。且非水溶性四氮唑盐的制备过程通常要加入毒性溶剂，如吡啶或四氢呋喃等。

而水溶性四氮唑盐检测试剂经活细胞线粒体脱氢酶转化成水溶性有色甲臜，可直接用于比色实验，这在实际的应用过程中将大大减少实验操作误差，提高测试结果的准确性和灵敏度，还可以对活细胞生成过程进行检测，因此可直接用于检测细胞毒性，细胞增殖和抗肿瘤药敏实验等领域。而应用该水溶性生化四氮唑盐荧光检测试剂，通过荧光比色分析试验,采用酶联免疫检测仪测定其光吸收值(429nm)，测试结果的准确性和灵敏度更高，能实现直接定量检测肿瘤细胞活力，具有重要的现实意义。

四氮唑盐的结构中引入水溶性基团可快速准确地应用于细胞生物学、细胞与分子毒理学、组织化学及临床诊断等方面。水溶性四氮唑盐应用于生物化学领域不仅与其本身的结构有关，而且与其所属性质也息息相关，通常来说由两个关键因素所决定，其一是中间体甲臜在可见光区有最大吸收峰，通过比色法可以进行检测生物细胞的活性，二是它们的氧化还原电势与生物系统的氧化还原电势相近，根据这一原理可验证是否能作为细胞活力染色剂。而荧光检测分析具有更高的检测限和灵敏度，因此，研发一款水溶性高、具有荧光性质、制备工艺简单，所用溶剂无毒性、清洁生产，副产物少、产率高的水溶性四氮唑盐检测试剂。

技术实现要素：

本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种水溶性生化四氮唑盐荧光检测试剂的制备方法及其肿瘤细胞活力的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

1)将2-羧基苯甲醛-2,4-二硝基苯腙和4-氨基-2-氰基苯甲酸的重氮盐溶于水中，在氢氧化钠的作用下，反应温度-5-10℃下，反应2-3.5h，

2)经过滤，滤液用活性炭脱色后，过滤、旋蒸至干、洗出、红外灯干燥得到中间体深褐色粉末状固体，

3)将上述固体溶于乙醇中，加入氧化剂，在-10-0℃下，反应2-8h后，经活性炭脱色、过滤，旋蒸至干、洗出、红外灯干燥得到淡黄色粉末状成品。

作为对本发明的限定，本发明所述的步骤1)中2-羧基苯甲醛-2,4-二硝基苯腙、4-氨基-2-氰基苯甲酸的重氮盐、氢氧化钠和水的摩尔比为1：0.95：4.5：13，室温下搅拌溶解。

作为对本发明的限定，本发明所述的步骤3)中固体、氧化剂、乙醇的重量比1：2.5：5。

作为对本发明的限定，本发明所述的步骤3)中氧化剂为氯化铜。

作为对本发明的限定，本发明所述的水溶性生化四氮唑盐荧光检测试剂的反应方程式如式(1)所示：

为了解决本发明的技术问题，本发明所述的水溶性生化四氮唑盐荧光检测试剂的检测方法是按照下列步骤进行的：

应用上述水溶性生化四氮唑盐荧光检测试剂，通过荧光比色分析试验,采用酶联免疫检测仪测定其光吸收值(429nm)，直接定量检测肿瘤细胞活力。

除上述说明以外，本发明还取得了以下有益效果：

(1)在结构中通过引入羧基，不仅增强了新型四氮唑盐生化试剂的水溶性，便于定量检测。在实际的应用过程中将大大减少实验操作误差，(2)使得该化合物具有荧光性质，与通常的(水溶性)四氮唑盐相比，能进一步提高测试结果的准确性和灵敏度。

(2)采用氯化铜作为氧化剂，可一步高收率的将中间体氧化成四氮唑盐。

(3)应用该新型水溶性生化四氮唑盐荧光检测试剂，通过荧光比色分析试验,采用酶联免疫检测仪测定其光吸收值，可以实现直接定量检测肿瘤细胞活力。

综上所述，本发明所制得的水溶性生化四氮唑盐荧光检测试剂，水溶性高、具有荧光性质、制备工艺简单、清洁生产，副产物少、产率高的。

附图说明

为了进一步探讨水溶性生化四氮唑盐荧光检测试剂的应用机理，本发明用荧光发射光谱图和电化学试验分别进行考察，下面结合说明书附图对本发明进行进一步说明。

图1为水溶性生化四氮唑盐荧光检测试剂的荧光发射光谱图；

图2为水溶性生化四氮唑盐荧光检测试剂的电化学扫描曲线；

需要指出的是，以上电化学性能试验是用循环伏安法对新型四氮唑盐诊断试剂的pbs-hcl(ph＝5.0)缓冲溶液进行扫描分析，工作电极是玻碳电极，辅助电极是铂碳电极，参比电极是饱和甘汞电极，扫描电位在-0.8～0.8v，扫描速度是50mvs-1；扫描前溶液通5min氮气以除去氧气；

由图1可知，该新型四氮唑内盐的还原态甲臢在在652nm处有较强的荧光发射，同理可知：2,3-二(4-氯苯基)-5-羧基-2h-四氮唑内盐应用在细胞活力染色领域也具有有较高的检测限和灵敏度；

通过循环伏安法的分析，扫描电位窗口在-483mv出现一个还原峰，与生物系统的氧化还原电势值相近，而在图中的氧化峰和还原峰明显不对称，说明该氧化还原过程是一个不可逆过程。生物上可以利用它的还原过程来检测细胞活力，所以这验证了它可以作为生物细胞活力检测剂。

具体实施方式

本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。

实施例1：

1)将1mol2-羧基苯甲醛-2,4-二硝基苯腙和0.95mol4-氨基-2-氰基苯甲酸的重氮盐溶于13mol水中，在4.5mol氢氧化钠的作用下，反应温度-5℃下，反应3.5h，

2)经过滤，滤液用活性炭脱色后，过滤、旋蒸至干、洗出、红外灯干燥得到中间体深褐色粉末状固体，

3)将上述1g固体溶于5g乙醇中，加入2.5g氯化铜，在-10℃下，反应8h后，经活性炭脱色、过滤，旋蒸至干、洗出、红外灯干燥得到淡黄色粉末状成品，收率为87.7％。

实施例2：

1)将1mol2-羧基苯甲醛-2,4-二硝基苯腙和0.95mol4-氨基-2-氰基苯甲酸的重氮盐溶于13mol水中，在4.5mol氢氧化钠的作用下，反应温度10℃下，反应2h，

2)经过滤，滤液用活性炭脱色后，过滤、旋蒸至干、洗出、红外灯干燥得到中间体深褐色粉末状固体，

3)将上述1g固体溶于5g乙醇中，加入2.5g氯化铜，在0℃下，反应2h后，经活性炭脱色、过滤，旋蒸至干、洗出、红外灯干燥得到淡黄色粉末状成品，收率为86.2％。

实施例3：

1)将1mol2-羧基苯甲醛-2,4-二硝基苯腙和0.95mol4-氨基-2-氰基苯甲酸的重氮盐溶于13mol水中，在4.5mol氢氧化钠的作用下，反应温度0℃下，反应2.5h，

2)经过滤，滤液用活性炭脱色后，过滤、旋蒸至干、洗出、红外灯干燥得到中间体深褐色粉末状固体，

3)将上述1g固体溶于5g乙醇中，加入2.5g氯化铜，在-5℃下，反应6h后，经活性炭脱色、过滤，旋蒸至干、洗出、红外灯干燥得到淡黄色粉末状成品，收率为87.1％。

用上述水溶性生化四氮唑盐荧光检测试剂成品，通过荧光比色分析试验,采用酶联免疫检测仪在429nm波长处测定其光吸收值，能直接定量检测肿瘤细胞活力。