一种四氢姜黄素的含量检测方法与流程

本发明具体涉及一种四氢姜黄素的含量检测方法。

背景技术：

四氢姜黄素(1，7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)庚烷-3，5-二酮)为姜黄素在体内的代谢产物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病、美白等多方面的生理作用，正受到越来越多的关注。四氢姜黄素是一种含有β-二酮结构的化合物，具有酮式和烯醇式两种互变异构体，在现有文献报道的流动相条件(乙腈/甲醇-酸水系统)下，用高效液相色谱法测定四氢姜黄素时，这两种异构体在色谱柱上发生分离，使其色谱图中总是出现两个峰，其中保留时间较短的是酮式，较长的是烯醇式(见图1)。

由于在不同极性的溶剂中两个异构体的比例不同，且二者响应值也不同。使用不同溶剂作为样品溶液时，即使进样量相同，两峰的比例不同，峰面积之和也不同，不能以两峰峰面积总和作为响应值进行计算。因此，供试品溶液与对照品溶液必需使用相同的溶剂溶解。这种情况下，虽然可用其中一个峰或两个峰的面积之和进行含量计算，但这会给样品的制备带来更多操作步骤，例如：在测定以水为主要溶剂的溶出度供试品溶液时，在进样前需转换为与对照品溶液相同的甲醇溶液，降低方法的精密度，而且，单一成分在色谱图中出现两个峰，也会给有关物质的鉴定和杂质干扰的排除带来困难。因此，急需开发一种方便快速，准确性高，专属性强的色谱分析方法，以适应四氢姜黄素原料药及其制剂的质量控制要求。

一般来说，β-二羰基化合物都具有极其活泼的α-H，互变平衡主要以烯醇式为主。为了获得单一烯醇式峰，通常可以尝试加大流动相的pH，使烯醇式羟基电离，使互变向烯醇方向式移动。但由于四氢姜黄素为弱酸性化合物，升高pH后，其结构中的羟基与碱发生反应形成盐(制备路线如下)，极性增大，在反相色谱中几乎没有保留(见图2)。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种四氢姜黄素的含量检测方法，它包括如下操作步骤：

1)对照品溶液制备：取四氢姜黄素对照品，加有机溶剂或者有机溶剂水溶液溶解，即得；

2)供试品溶液制备：取待检样品，加有机溶剂或者有机溶剂水溶液溶解，即得；

3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：有机溶剂与碱性水溶液的混合溶液，其中有机溶剂与碱性水溶液的比例为20:80～50：50。

进一步地，步骤1)所述对照品溶液每1ml含四氢姜黄素0.04～0.1mg，优选0.05mg。

进一步地，步骤1)和步骤2)所述有机溶剂为甲醇或乙腈；所述有机溶剂水溶液为乙腈与水的混合溶液，混合溶液中乙腈与水体积比为(30～32):(70～68)。

进一步地，步骤2)中，所述供试品溶液浓度为0.04～0.1mg/ml，优选0.05mg/ml。

进一步地，步骤2)中，所述待检样品为四氢姜黄素原料药或者含有四氢姜黄素的制剂。

进一步地，步骤3)中，所述有机溶剂为乙腈或甲醇；所述碱性水溶液为0.01～1％(ml/ml)的氨水溶液或者乙二胺水溶液；所述流动相中还含有离子对试剂，离子对试剂浓度为0.001～0.1mol/L。

更进一步地，所述离子对试剂为烷基季铵盐。

更进一步地，所述烷基季铵盐为四丁基三氯化铵、四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵或十二烷基三甲基氯化铵任意一种。

进一步地，步骤3)中，所述色谱条件为波长280～300nm；流速0.7～1.2ml/min，柱温25～55℃，进样量为10μl。

更进一步地，所述柱温25℃，流速1.0ml/ml，波长280～300nm。

本发明涉及的含量测定方法，既避免了四氢姜黄素在酸性流动相中的互变异构体双峰问题，可以使四氢姜黄素在色谱图上呈单一峰，又解决了在碱性流动相中出峰时间过短的问题，能有效地将四氢姜黄素及其杂质分离，而且该方法分离度及灵敏度高，操作简单，重复性及耐用性好，结果稳定可靠，从而可用于四氢姜黄素原料药和制剂的质量控制，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1酸性流动相下四氢姜黄素液相色谱图

图2流动相为乙腈-0.125％氨水(40：60)的液相色谱图

图3流动相为乙腈-0.5％氨水(含0.01mol/L四丁基氢氧化铵)(30:70)的四氢姜黄素色谱图

图4流动相为乙腈-0.5％氨水(含0.01M十二烷基三甲基氯化铵)(40:60)的四氢姜黄素色谱图

图5流动相为乙腈-0.01M四丁基氢氧化铵溶液(32:68)所得色谱图图6四氢姜黄素原料药强制降解后的液相色谱图

图7四氢姜黄素在碱性流动相中30min内的紫外扫描图

具体实施方式

仪器与试药

1仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪、色谱柱：Agilent Zorbax Extend C18，4.6×150mm，5μm(美国Agilent公司)。

2试药

甲醇(分析纯，成都长联化学试剂有限公司)、乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)、四氢姜黄素对照品(购自于SIGMA公司，纯度为98％)

四氢姜黄素原料药为自制产品，纯度大于98％。

实施例1本发明检测方法

1)对照品溶液制备：取四氢姜黄素对照品10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，超声振荡使完全溶解，摇匀，再精密吸取其中1ml置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

2)供试品溶液制备：取四氢姜黄素原料药10mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加入20ml甲醇，超声振荡5min，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液1ml，稀释至10ml，滤过，滤液作为供试品溶液；

3)分别吸取10μl对照品溶液和供试品溶液，注入Agilent 1200高效液相色谱仪(其中包含DAD检测器)，色谱条件如下：

色谱柱：Agilent，SB-C18，4.6×150mm，5μm；检测波长290nm；柱温25℃；流速1.0ml/ml；流动相：乙腈-0.5％氨水(含0.01mol/L四丁基氢氧化铵)(30:70)。

四氢姜黄素色谱图见图3。

实施例2本发明检测方法

1)对照品溶液制备：取四氢姜黄素对照品10mg，精密称定，加甲醇制成每1ml含四氢姜黄素0.05mg的溶液，即得；

2)供试品溶液制备：将四氢姜黄素原料药用甲醇溶解并定量稀释制成含四氢姜黄素0.05mg/ml的溶液，作为供试品溶液；

3)分别吸取10μl对照品溶液和供试品溶液，注入Agilent 1200高效液相色谱仪(其中包含DAD检测器)，色谱条件如下：

色谱柱：Global Chromatography，GS-120-5-C18-BIO，4.6×150mm，5μm；检测波长290nm；柱温25℃；流速1.0ml/ml；流动相：乙腈-0.5％氨水(含0.01mol/L十二烷基三甲基氯化铵)(40:60)。

四氢姜黄素色谱图见图4。

实施例3本发明检测方法

1)对照品溶液制备：取四氢姜黄素对照品10mg，精密称定，加甲醇制成每1ml含四氢姜黄素0.05mg的溶液，即得；

2)供试品溶液制备：将四氢姜黄素固体分散体胶囊内容物用甲醇溶解，并定量稀释制成含四氢姜黄素约0.05mg/ml的溶液，即得；

3)分别吸取10μl对照品溶液和供试品溶液，注入Agilent 1200高效液相色谱仪(其中包含DAD检测器)，色谱条件如下：

色谱柱：Global Chromatography，GS-120-5-C18-BIO，4.6×150mm，5μm；检测波长290nm；柱温35℃；流速1.0ml/ml；流动相：乙腈-0.01mol/L十二烷基三甲基氯化铵(用氨水调pH值10)(35:65)。

实施例4本发明检测方法

1)对照品溶液制备：取四氢姜黄素对照品约10mg，精密称定，加甲醇制成每1ml含四氢姜黄素0.05mg的溶液，即得；

2)供试品溶液制备：将四氢姜黄素固体分散体胶囊内容物用甲醇溶解，并定量稀释制成含四氢姜黄素0.05mg/ml的溶液，作为供试品溶液；

3)分别吸取10μl对照品溶液和供试品溶液，注入Agilent 1200高效液相色谱仪(其中包含DAD检测器)，色谱条件如下：

色谱柱：Global Chromatography，GS-120-5-C18-BIO，4.6×150mm，5μm；检测波长290nm；柱温35℃；流速1.0ml/ml；流动相：乙腈-0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液(32:68)。

四氢姜黄素色谱图见图5。

实施例5本发明检测方法

1)对照品溶液制备：取四氢姜黄素对照品10mg，精密称定，加甲醇制成每1ml含四氢姜黄素0.05mg的溶液，即得；

2)供试品溶液制备：将四氢姜黄素固体分散体胶囊内容物用乙腈-水(32:68)溶解，并定量稀释制成含四氢姜黄素0.05mg/ml的溶液，作为供试品溶液；

3)分别吸取10μl对照品溶液和供试品溶液，注入Agilent 1200高效液相色谱仪(其中包含DAD检测器)，色谱条件如下：

色谱柱：Global Chromatography，GS-120-5-C18-BIO，4.6×150mm，5μm；检测波长290nm；柱温35℃；流速1.0ml/ml；流动相：乙腈-0.3％三乙胺(含0.01M十二烷基三甲基氯化铵)(40:60)。

以下通过试验例进一步说明本发明得有益效果。

试验例1系统适应性试验

仪器与条件：同实施例1。

实验步骤：取本品适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中含0.05mg的溶液，作为供试品溶液。取供试品溶液，连续进样六次，分别计算四氢姜黄素峰峰面积以及保留时间的相对标准偏差，实验结果见表1，色谱图见。

表1四氢姜黄素色谱条件系统适应性试验

由表1可知，四氢姜黄素峰与相邻杂质峰的分离度均大于1.5，对称因子均小于1.5，理论板数均高于2500，峰面积的相对标准偏差为0.89％，保留时间的相对标准偏差为0.49％。可见各参数均符合中国药典要求的限度，故在该色谱条件下，四氢姜黄素及其杂质可以完全分离，峰形较好，而且相对标准偏差较小，所得结果稳定可靠。

试验例2线性范围

仪器与条件：与实施例1中的相同。

试验步骤：精密称取10.26mg四氢姜黄素对照品，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。分别量取储备液0.2ml、0.4ml、0.6ml、1ml、1.4ml、2.0ml，用乙腈稀释至10ml，各吸取10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，结果见表2

表2四氢姜黄素进样量与峰面积线性考察结果

四氢姜黄素进样量在0.082～0.8208μg范围内与峰面积呈很好的线性关系，回归方程及相关系数：y＝23231.80x+12.73(y为峰面积，x为四氢姜黄素进样量，单位μg)，r＝0.9997。

试验例3耐用性试验

仪器与条件：除柱温、流速和检测波长外(见表3)，其他条件与实施例1相同。

实验步骤：取本品适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中含0.05mg的溶液，作为供试品溶液。分别通过改变柱温、流速和检测波长，记录四氢姜黄素含量的变化情况(按面积归一化法计算)，实验结果见表3。

表3四氢姜黄素含量测定色谱条件耐用性试验结果

由表3可知，改变柱温、流速和检测波长后，四氢姜黄素含量的测定结果没有明显差异，可见本发明分析检测方法的耐用性良好。

试验例4重复性试验

仪器与条件：同实施例1。

实验步骤：取四氢姜黄素适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中含0.05mg的溶液，作为供试品溶液，同法配制6份供试品溶液。取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按外标法计算四氢姜黄素原料药的含量，并计算其相对标准偏差，实验结果见表4。

表4四氢姜黄素中间体重复性试验结果

由试验结果可知，各供试品溶液中四氢姜黄素的含量没有明显差异，相对标准偏差为0.21％，可见本分析检测方法的重复性良好。

试验例5加样回收率试验

精密吸取实施例7中的供试品溶液0.5ml(0.02181mg/ml)9份，至10ml容量瓶中。分别以原料药含量的80％、100％、120％的比例精密加入浓度为0.04425mg/ml的四氢姜黄素对照品，每个浓度比例3份，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。各吸取10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算回收率。结果见表5。

表5加样回收试验结果

本含量测定方法回收率99.71％，RSD为0.99％，表明方法回收率良好。

试验例6专属性试验

分别取四氢姜黄素原料药适量，加甲醇溶解，配制成约2mg/ml的溶液。分别吸取其中1ml至10ml量瓶中，进行以下破坏试验：(1)酸破坏：加1mol/L盐酸1ml，常温下放置4h后，加1mol/L氢氧化钠溶液中和；(2)碱破坏：加1mol/L氢氧化钠溶液1ml，常温下放置4h后，加1mol/ml盐酸1ml中和；(3)氧化破坏：加30％双氧水溶液1ml，常温下放置4h；(4)高温破坏：将样品置60℃高温下放置4h；(5)光照破坏：将供试品溶液置照度为4500lx的稳定性试验箱中放置20小时。分别将上述各破坏溶液稀释至刻度，在实施例1的色谱条件分析，记录色谱图，结果见图6。结果表明本品在酸、碱、氧化、光照及高温条件下，四氢姜黄素与主要降解产物能够较好地分离，说明本方法具有良好的专属性。

试验例7检测限

仪器与条件：与实施例1中的相同。

实验步骤：取本品适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.41mg的溶液作为储备液。加甲醇逐步稀释，以S/N≈3时的浓度作为检测限浓度，此时四氢姜黄素的浓度为0.00082mg/mL，检测限为8.2ng，可见本方法及仪器的灵敏度较高。

试验例8样品在流动相中的稳定性

将四氢姜黄素用流动相乙腈-0.5％氨水(含0.01M十二烷基三甲基氯化铵)(40：60)溶解并稀释适当倍数，每隔10min进行一次200～400nm紫外扫描，记录0、10、20、30min的紫外光谱图(见图7)。结果表明，样品在流动相中保持稳定，吸收强度、光谱峰性状均没有明显改变。说明四氢姜黄素在30min内在该碱性流动相中能保持稳定，可以满足分析的需要。

综上，本发明的四氢姜黄素含量检测方法，操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高，可以有效地评价四氢姜黄素原料药的质量。