一种鉴定结直肠癌症生物标记物的方法及其检测试剂盒与流程

本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及一种鉴定结直肠癌的生物标记物的方法及其检测试剂盒。
背景技术：
：结直肠癌(CRC)是世界上第三种常见的恶性肿瘤，也是第二大导致癌症死亡的原因。据估计，2012年全球约有140万新发病例和70万死亡病例。早期患者手术后的5年生存率超过90％，但是目前由于大多数患者缺乏明显的临床症状发现时已是晚期导致死亡率增加。目前临床上使用较为广泛的诊断方法包括：结肠镜检查，超声检查，计算机断层扫描(CT)，MRI，粪便隐血试验(FOBT)，CEA，CA19-9等传统血清学生物标志物。结肠镜检查作为结直肠癌诊断的标准检测方法，具有高灵敏度和特异性，能够检测并且切除病变，甚至在癌前病变中也是如此，但由于它是侵入性检查常常会给患者带来不适感而且它的准确性还受医生的手术技能经验和患者依从性的影响。超声、CT、MRI可以用于肿瘤的检查，但当发现肿块时仍需通过结肠镜检查确诊。粪便隐血试验(FOBT)可作为广谱筛查试验使用，但其灵敏度差的特点阻碍了在临床实践中的广泛应用。而血液分析是非侵入性的，可以最大限度地降低患者的风险且容易操作可以多次重复以降低诊断错误率，但传统的血清生物血标志物的诊断性能不好不能在早期发现诊断结直肠癌，因此寻找一种新型的高灵敏度和特异性的标志物十分重要。血清中还原性单糖似乎仅限于甘露糖和葡萄。人体血清游离单糖中葡萄糖的含量最高，正常人的范围为3.90～6.16mmol/L。目前，医院检验科可以直接通过测生化指标检测葡萄糖浓度，暂时不可以直接检测甘露糖浓度。健康成人血浆中游离甘露糖的浓度范围为20～80μmol/L。甘露糖的含量约为葡萄糖含量的1％。它大部分被认为是由细胞中的葡萄糖异构化而来。而近来有研究表明，细胞中流出的游离的甘露糖是哺乳动物血液中游离甘露糖的主要来源。这两部分来源的游离甘露糖维持着血清中甘露糖的稳定。D-甘露糖是糖蛋白，细胞表面糖缀合物和糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白等结构中必需的单糖。其中，甘露糖是各种多糖复合物中N-糖链的重要组分，N-聚糖中的甘露糖残基来源于血液中的葡萄糖或甘露糖。游离甘露糖是正常的血浆成分。目前，血清甘露糖的测定方法主要有酶法、气液色谱法、高分辨液相层析、气液色谱-质谱法和毛细管电泳法等。但这些方法均存在一定的不足之处。比如，使用酶法、气液色谱法和高分辨液相层析时，为避免高浓度的葡萄糖的影响需要将其去除，致使前处理过程比较繁琐；气液色谱-质谱法仪器价格昂贵，不适合常规目的；所需血清样本量大。技术实现要素：本发明的目的是提供了用于鉴定结直肠癌的生物标记物及其应用，本发明采用柱前PMP衍生的高效液相色谱法(HPLC)检测结直肠癌患者血清中的单糖，尤其涉及血清中游离甘露糖和葡萄糖的检测。本发明的技术方案可以用于检测结直肠癌患者或正常人血清游离甘露糖和葡萄糖浓度，可以用于鉴定结直肠癌患者。为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案予以实现：用于鉴定结直肠癌的生物标记物，所述生物标记物为血清经过柱前PMP衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖。用于鉴定结直肠癌的生物标记物的定量分析方法，其特征在于：该方法为柱前PMP衍生的高效液相色谱法，包括以下具体步骤：(1)调节pH为7-14：取待检测的血清样品加超纯水于EP管中，加入氢氧化钠，涡旋混匀；(2)PMP衍生：每个样品加入PMP，涡旋混匀，离心后置于烘箱反应；(3)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入盐酸，涡旋混匀；(4)萃取：每管加入有机溶剂，涡旋，离心，移除下层有机溶剂，保留上清；(5)将样品离心，取上清液于装有内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，待用于高效液相分析；(6)绘制甘露糖和葡萄糖的标准曲线；(7)将步骤(5)得到的色谱图与步骤(6)中的标准曲线比对并分析计算，确定甘露糖、葡萄糖的浓度以及葡萄糖与甘露糖浓度的比值。所述高效液相色谱为Agilent1260高效液相系统，AgilentPoroshellEC-C18色谱柱(4.6mm×100mm,2.7μm)，所述步骤(5)中的色谱条件为：检测波长：254nm，带宽4nm；参比波长：350nm，带宽100nm；柱温：37℃；流速：1mL/min；进样体积：20μL；流动相：A相为乙腈，B相为pH为5.5的0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶液。所述步骤(5)中流动相的梯度变化为：0min，A相15％，B相85％；10min，A相22％，B相78％；15min，A相24％，B相76％；15.1min，A相15％，B相85％；20min，A相15％，B相85％。所述步骤(3)中盐酸的浓度为0.3mol/L。所述步骤(4)中有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正己烷中的至少一种。生物标记物在制备用于检测结直肠癌的试剂盒中的用途，其特征在于：所述试剂盒中包括浓度为4163μmol/L的葡萄糖的标准液(直肠癌)。所述试剂盒中包括浓度为81.09μmol/L的甘露糖的标准液和浓度为3885μmol/L的葡萄糖标准液(结肠癌)。一种鉴定结直肠癌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有生物标记物，即血清经过柱前PMP衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖。所述试剂盒中包括浓度为4163μmol/L的葡萄糖的标准液(直肠癌)。所述试剂盒中包括浓度为81.09μmol/L的甘露糖的标准液和浓度为3885μmol/L的葡萄糖标准液(结肠癌)。与现有技术相比，本发明将柱前PMP衍生的高效液相色谱法用于结直肠癌患者血清游离单糖的检测，其有益技术效果是：1、前处理简单。2、分析时间短。3、所需要的血清用量少，每次只需小于1mL的血量。4、仪器价格合理，符合常规使用。5、操作步骤简单易学。6、检测准确。本发明采用柱前PMP衍生的高效液相色谱法同时测定血清游离甘露糖和葡萄糖，简化操作，并且血清用量少，而且也已证实此方法甘露糖浓度的测定不会受高浓度葡萄糖的影响。通过对血清游离甘露糖、葡萄糖及葡萄糖和甘露糖浓度的比值(G/M比值)的统计学数据分析，建立了结直肠癌与三者之间的关系。使用本发明的技术方案可以快速区分正常人和结直肠癌患者。附图说明图1为两种类型色谱柱色谱图；图2为不同流动相梯度的色谱图；图3为结直肠癌患者与正常人血清游离甘露糖、葡萄糖及葡萄糖与甘露糖浓度的比值散点图；图4为结直肠癌患者血清游离甘露糖和葡萄糖的ROC曲线；图5为正常人和结直肠癌患者血清游离甘露糖、葡萄糖及葡萄糖与甘露糖浓度的比值构建的三维立体图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。实施例中涉及的所有血样均由青岛市青岛大学医学院附属医院提供。本发明的技术方案包括以下步骤：实施例1(1)精密称取甘露糖(Man)、葡萄糖胺(GlcN)、半乳糖胺(GalN)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、岩藻糖(Fuc)适量，加去离子水配制两份含以上单糖0.1mg/mL混合标准品溶液，现用现配；(2)创造碱性环境：取40μL混合单糖标准品于1.5mLEP管，加入40μL0.3mol/L氢氧化钠，涡旋混匀；(3)PMP衍生：每个样品加入60μL0.5mol/L1-苯基-5-甲基吡唑啉酮(PMP)，涡旋混匀，离心后70℃烘箱反应1h；(4)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入40μL0.3mol/L盐酸，涡旋混匀；(5)萃取：每管加入500μL三氯甲烷，涡旋，离心，移除下层三氯甲烷，保留上清，重复3次；(6)将样品13000r/min离心10min，取80μL上清液于装有150μL内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，两份样品分别使用不同的色谱柱A和B进行高效液相分析，高效液相色谱为Agilent1260高效液相系统，所得色谱图，见图1。色谱柱A：AgilentPoroshellEC-C18色谱柱(4.6mm×100mm,2.7μm)；AgilentPoroshellEC-C18色谱柱(4.6mm×100mm,2.7μm)色谱条件：检测波长：254nm，带宽4nm；参比波长：350nm，带宽100nm；柱温：37℃；流速：1mL/min；进样体积：20μL；流动相：0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶液，乙腈；梯度变化：时间乙腈0.1mol/L乙酸铵pH5.50min15％85％10min22％78％15min24％76％15.1min15％85％20min15％85％色谱柱B：AgilentZORBAXXDB-C18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm)；AgilentZORBAXXDB-C18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm)色谱条件：检测波长：254nm，带宽4nm；参比波长：350nm，带宽100nm；柱温：37℃；流速：1mL/min；进样体积：20μL；流动相：0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶液，乙腈；梯度变化：时间乙腈0.1mol/L乙酸铵pH5.50min15％85％40min22％78％40.1min15％85％55min15％85％从图1可以看出，AgilentZORBAXXDB-C18色谱柱分析时间长，色谱峰分离度差，AgilentPoroshellEC-C18色谱柱分析时间是ZORBAXXDB-C18色谱柱的1/3，色谱峰良好。横坐标为时间(min)，纵坐标为DAD信号强度。1，2，3，4，5，6，7，8依次Man，GlcN，GalN，GlcUA，Glc，Gal，Xyl，Fuc的色谱峰。实施例2(1)精密称取甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)和葡萄糖(Glc)适量，加去离子水配制相同的5份含以上单糖0.1mg/mL混合标准品溶液，现用现配；(2)创造碱性环境：取40μL混合单糖标准品于1.5mLEP管，加入40μL0.3mol/L氢氧化钠，涡旋混匀；(3)PMP衍生：每个样品加入60μL0.5mol/LPMP，涡旋混匀，离心后70℃烘箱反应1h；(4)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入40μL0.3mol/L盐酸，涡旋混匀；(5)萃取：每管加入500μL三氯甲烷，涡旋，离心，移除下层三氯甲烷，保留上清，重复3次；(6)将样品13000r/min离心10min，取80μL上清液于装有150μL内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，5份样品分别在不同流动相变化梯度下用于高效液相分析，所得色谱图，见图2。高效液相色谱为Agilent1260高效液相系统，AgilentPoroshellEC-C18色谱柱(4.6mm×100mm,2.7μm)；色谱条件：检测波长：254nm，带宽4nm；参比波长：350nm，带宽100nm；柱温：37℃；流速：1mL/min；进样体积：20μL；流动相：0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶液，乙腈；流动相变化梯度A：时间乙腈0.1mol/L乙酸铵pH5.50min15％85％20min15％85％流动相变化梯度B：时间乙腈0.1mol/L乙酸铵pH5.50min20％80％20min20％80％流动相变化梯度C：时间乙腈0.1mol/L乙酸铵pH5.50min22％78％20min22％78％流动相变化梯度D：时间乙腈0.1mol/L乙酸铵pH5.50min15％85％10min22％78％15min15％85％20min15％85％流动相变化梯度E：时间乙腈0.1mol/L乙酸铵pH5.50min15％85％10min22％78％15min24％76％15.1min15％85％20min15％85％从图2可以看出，在梯度A条件下，只有Man被洗脱出来；在梯度B条件下，尽管三者能够被分离开来，但是溶剂PMP的峰与Man离的较近；而在梯度C条件下，溶剂峰与Man峰重合；在梯度D条件下，Glc峰洗脱出来的时间过长，导致不能形成尖而高的峰。只有在梯度D条件下，出峰对称，且分离度好。横坐标为时间(min)，纵坐标为DAD信号强度。1，2和3依次是Man，Rha和Glc的色谱峰。实施例3(1)精密称取甘露糖和葡萄糖适量，加去离子水配制成含以上单糖各0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.1mg/mL，0.05mg/mL，0.01mg/mL，0.005mg/mL，0.0025mg/mL，0.001mg/mL，0.0005mg/mL的混合标准品溶液，现用现配；(2)创造碱性环境：取40μL混合单糖标准品于1.5mLEP管，加入40μL0.3mol/L氢氧化钠，涡旋混匀；(3)PMP衍生：每个样品加入60μL0.5mol/LPMP，涡旋混匀，离心后70℃烘箱反应1h；(4)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入40μL0.3mol/L盐酸，涡旋混匀；(5)萃取：每管加入500μL三氯甲烷，涡旋，离心，移除下层三氯甲烷，保留上清，重复3次；(6)将样品13000r/min离心10min，取80μL上清液于装有150μL内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，待用于高效液相分析。高效液相色谱为Agilent1260高效液相系统，AgilentPoroshellEC-C18色谱柱(4.6mm×100mm,2.7μm)；色谱条件：检测波长：254nm，带宽4nm；参比波长：350nm，带宽100nm；柱温：37℃；流速：1mL/min；进样体积：20μL；流动相：0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶液，乙腈；流动相变化梯度：时间乙腈0.1mol/L乙酸铵pH5.50min15％85％10min22％78％15min24％76％15.1min15％85％20min15％85％(7)绘制甘露糖和葡萄糖的标准曲线。实施例4(1)创造碱性环境：分别取242例正常人血清样品和360例已确诊的结直肠癌患者血清样品10μL加30μL超纯水于1.5mLEP管中，加入40μL0.3mol/L氢氧化钠，涡旋混匀；(2)其余步骤同实施例3，分析计算甘露糖、葡萄糖的浓度以及葡萄糖与甘露糖浓度的比值。统计检测结果，见图3。将图3结果总结至表1和表2。表1.直肠癌患者血清游离单糖和G/M比值与正常人的相对趋势葡萄糖甘露糖G/M比值直肠癌↓***↑NS↓***注释：“NS”代表与正常人相比无显著性差异，“***p<0.001”、“**p<0.01”和“*p<0.05”分别代表与正常人相比有显著性差异，“↑”和“↓”分别代表与正常人相比上升或下降。表2.直肠癌患者及正常人血清中2种游离单糖浓度(μmol/L)及其比值结果葡萄糖甘露糖G/M比值正常人5660±189169.95±36.1483.83±16.56直肠癌5293±3114380.32±58.0374.93±30.67另外，对表1中与正常人有显著性差异的葡萄糖进行了ROC曲线分析，以期望找到曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性均较高的指标，以确定最佳筛查阳性临界值(cutoff值)，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。检测结果见图4，将图4结果总结至表3。表3.直肠癌患者血清中甘露糖和葡萄糖的cutoff值(μmol/L)及其灵敏度(％)和特异性(％)AUCcutoff值灵敏度特异性葡萄糖0.5963416343.4488.69从图3，表1，表2可以看出，直肠癌患者血清游离葡萄糖显著上升。另外，表3显示，葡萄糖的特异性均较高，因此可以以游离葡萄糖为生物标志物来检测直肠癌患者。实施例5(1)创造碱性环境：分别取137名结肠癌患者血清样品10μL加30μL超纯水于1.5mLEP管中，加入40μL0.3mol/L氢氧化钠，涡旋混匀；(2)其余步骤同实施例2，分析计算葡萄糖、甘露糖的浓度以及葡萄糖与甘露糖浓度的比值。统计检测结果，见图1，图2。将图1结果总结至表1，2种游离单糖浓度及浓度比值分析结果见表2。表1.结肠癌患者血清游离单糖和G/M比值与正常人的相对趋势葡萄糖甘露糖G/M比值结肠癌↓***↑*↓***注释：“NS”代表与正常人相比无显著性差异，“***p<0.001”、“**p<0.01”和“*p<0.05”分别代表与正常人相比有显著性差异，“↑”和“↓”分别代表与正常人相比上升或下降。表2.结肠癌患者及正常人血清中2种游离单糖浓度(μmol/L)及其比值结果葡萄糖甘露糖G/M比值正常人5516±229568.70±31.7183.52±16.20结肠癌4788±262177.63±39.4466.49±28.37另外，对表1中与正常人有显著性差异的甘露糖和葡萄糖进行了ROC曲线分析，以期望找到曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性均较高的指标，以确定最佳筛查阳性临界值(cutoff值)，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。检测结果见图4，将图4结果总结至表3。表3.结肠癌患者血清中甘露糖和葡萄糖的cutoff值(μmol/L)及其灵敏度(％)和特异性(％)AUCcutoff值灵敏度特异性甘露糖0.579881.0941.0178.42葡萄糖0.6247388543.1791.37从图3，表1，表2可以看出，结肠癌患者血清游离甘露糖显著上升，葡萄糖显著下降。另外，表3显示，甘露糖和葡萄糖的特异性均较高，因此可以以游离甘露糖和葡萄糖为生物标志物来检测结肠癌患者。实施例6利用本发明所述的生物标记物用于检测结直肠癌的应用，具体包括以下步骤：(1)创造碱性环境：取待检测的血清样品10μL加30μL超纯水于1.5mLEP管中，加入40μL0.3mol/L氢氧化钠，涡旋混匀；(2)PMP衍生：每个样品加入60μL0.5mol/LPMP，涡旋混匀，离心后70℃烘箱反应1h；(3)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入40μL0.3mol/L盐酸，涡旋混匀；(4)萃取：每管加入500μL三氯甲烷，涡旋，离心，移除下层三氯甲烷，保留上清，重复3次；(5)将样品13000r/min离心10min，取80μL上清液于装有150μL内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，待用于高效液相分析。高效液相色谱为Agilent1260高效液相系统，AgilentPoroshellEC-C18色谱柱(4.6mm×100mm,2.7μm)；色谱条件：检测波长：254nm，带宽4nm；参比波长：350nm，带宽100nm；柱温：37℃；流速：1mL/min；进样体积：20μL；流动相：0.1mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶液，乙腈；梯度变化：时间乙腈0.1mol/L乙酸铵pH5.50min15％85％10min22％78％15min24％76％15.1min15％85％20min15％85％(6)绘制甘露糖和葡萄糖的标准曲线：精密称取甘露糖和葡萄糖适量，加去离子水配制成含以上单糖各0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.1mg/mL，0.05mg/mL，0.01mg/mL，0.005mg/mL，0.0025mg/mL，0.001mg/mL，0.0005mg/mL的混合标准品溶液，现用现配；取40μL混合单糖标准品于1.5mLEP管，加入40μL0.3mol/L氢氧化钠，涡旋混匀；其余步骤同(2)、(3)、(4)、(5)。(7)将步骤(5)得到的色谱图与步骤(5)中的标准曲线比对并分析计算，确定甘露糖、葡萄糖的浓度以及葡萄糖与甘露糖浓度的比值。并通过Origin9软件作出三者之间的三维立体图，以便更直观的观察三者联合能否将正常人与结直肠癌患者区分开，见图5。如果待测血清样品中的游离甘露糖浓度大于64.71μmol/L和游离葡萄糖浓度大于5149μmol/L，则判定待测血清样品为结直肠癌患者。以上结果均表明：该方法前处理简单；分析时间短；所需要的血清用量少，每次只需小于1mL的血量；仪器价格合理，符合常规使用；操作步骤简单易学；检测准确。检测并计算血清中游离的甘露糖、葡萄糖及葡萄糖与甘露糖浓度的比值可以区分正常人和结直肠癌患者，适合临床上用于结直肠癌患者的诊断。以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。当前第1页1 2 3