一种测定醒神香囊中多种成分的检测方法与流程

本发明涉及分析
技术领域：
，具体涉及一种测定醒神香囊中多种成分的检测方法。
背景技术：
：醒神香囊为一种芳香挥发油微囊与微粉化药材组合配方，主要用于提神醒脑，具有抑制、杀灭细菌和病原虫的作用。通过佩戴能够对人的心理、神经系统、呼吸系统、循环系统等都有着良好效果，能够着促进健康、防治疾患。香囊在制备过程中会使用多种药材丁香，藿香，小茴香，桂枝，佩兰，砂仁，檀香，冰片，苍术，虎杖。由于上述药材质量会存在差异，为此需要对其关键成分进行控制，实现多种有效成分的分离检测，对其质量控制方面具有重要的现实意义。技术实现要素：本发明的目的是建立一种测定醒神香囊中多种成分的检测方法，可以更好的测定醒神香囊中多种成分虎杖苷、大黄素、苍术素含量，可以更好的对醒神香囊中存在的多种有效成分虎杖苷、大黄素、苍术素同时进行检测。本发明的技术方案是，高效液相色谱测定醒神香囊中多种成分的检测方法，它包括如下步骤：对照溶液制备：虎杖苷、大黄素、苍术素对照品适量用50%甲醇溶解并稀释，制成含虎杖苷38.25μg/ml、大黄素8.50μg/ml、苍术素0.15μg/ml的混合溶液作为对照溶液；供试品溶液：精密称取样品0.1g加甲醇25ml，超声30min放冷。再加入25ml的水，充分震摇后，取上清液，过滤，作为供试品溶液；空白溶液的制备：50%甲醇溶液；色谱柱为：十八烷基键合硅胶色谱柱；检测波长：306nm；参比波长：400nm；流速：1ml/min；进样量：20μl；柱温：38~42℃；流动相a：水-甲醇=75:25；流动相b：ph=2.1±0.1水-甲醇=20:80；进样：取对照溶液、供试品溶液、空白溶液分别进样记录色谱图；虎杖苷的浓度范围为7.65~45.9μg/ml；大黄素的浓度范围为1.7~10.2μg/ml;苍术素的浓度范围为在0.03~0.18μg/ml。实施例1色谱柱：c18，250×4.6mm,5μm检测波长：254nm340nm参比波长：360nm流速：1ml/min进样量：20μl柱温：40℃流动相a：甲醇流动相b：水仪器：aglient1260flexiblepumpagilent1260multisampleraglient1260mctaglient1260dadhs流动相比例：a:b=79:21测试液的制备：称取苍术素对照品适量，用甲醇稀释制成含苍术素30.6μg/ml的溶液。称取大黄素对照品适量，用甲醇稀释制成含大黄素80.5μg/ml的溶液。称取虎杖苷对照品适量，用甲醇稀释制成含虎杖苷20.6μg/ml的溶液。取上述三种溶液，分别进样。结果：结果显示，苍术素在340nm波长条件下，出峰时间为12.307min，在254nm条件下负峰；大黄素在340nm波长条件下，为负峰，在254nm条件下出峰时间为8.760min；虎杖苷在340nm波长条件下，出峰时间为2.044min，在254nm条件下为负峰。结论：在上述条件下，采用360nm参比波长，254nm波长苍术素存在负峰，340nm大黄素和虎杖苷为负峰，负峰不利于样品组分的积分。虎杖苷的出峰时间为2min，出峰时间短不利于样品有效分离。实施例2色谱柱：c18，250×4.6mm,5μm检测波长：254nm340nm306nm参比波长：360nm流速：1ml/min进样量：20μl柱温：40℃流动相a：甲醇流动相b：水仪器：aglient1260flexiblepumpagilent1260multisampleraglient1260mctaglient1260dadhs流动相比例：见表1表1梯度表测试液的制备：称取苍术素对照品适量，用甲醇稀释制成含苍术素30.6μg/ml的溶液。称取大黄素对照品适量，用甲醇稀释制成含大黄素80.5μg/ml的溶液。称取虎杖苷对照品适量，用甲醇稀释制成含虎杖苷20.6μg/ml的溶液。取上述三种溶液，分别进样。结果：结果显示，苍术素在340nm波长条件下，出峰时间为47.167min，在254nm条件下为负峰，在306nm条件下为负峰；大黄素在340nm波长条件下，为负峰，在254nm条件下出峰时间为42.480min，在306nm条件下出峰时间为42.480min；虎杖苷在340nm波长条件下为负峰，在254nm条件下出峰时间为11.171min且峰型不对称，在306nm条件下出峰时间为11.171min且峰型不对称。结论：在上述条件下，采用360nm参比波长，254nm波长苍术素存在负峰，340nm大黄素和虎杖苷为负峰，306nm苍术素存在负峰，负峰不利于样品组分的积分。虎杖苷峰性状不对称，不利于样品的准确定量。实施例3色谱柱：c18，250×4.6mm,5μm检测波长：254nm340nm306nm334nm参比波长：400nm流速：1ml/min进样量：20μl柱温：40℃流动相a：甲醇流动相b：水仪器：aglient1260flexiblepumpagilent1260multisampleraglient1260mctaglient1260dadhs流动相比例：a:b=79:21测试液的制备：称取苍术素对照品适量，用甲醇稀释制成含苍术素30.6μg/ml的溶液。称取大黄素对照品适量，用甲醇稀释制成含大黄素80.5μg/ml的溶液。称取虎杖苷对照品适量，用甲醇稀释制成含虎杖苷20.6μg/ml的溶液。取上述三种溶液，分别进样。结果：结果显示，结果显示，苍术素在340nm波长条件下，出峰时间为12.026min，在254nm条件下，出峰时间为12.026min，在306nm波长条件下，出峰时间为12.026min，在334nm波长条件下，出峰时间为12.026min，；大黄素在340nm波长条件下，为负峰，在254nm条件下，出峰时间为7.240min，在306nm波长条件下，出峰时间为7.240min，在334nm波长条件下，为负峰；虎杖苷在340nm波长条件下，峰时间为2.025min，在254nm条件下，出峰时间为2.025min，在306nm波长条件下，出峰时间为2.025min，在334nm波长条件下，出峰时间为2.025min。结论：在上述条件下，采用400nm参比波长，334nm波长大黄素存在负峰，负峰不利于样品组分的积分。实施例4色谱柱：c18，250×4.6mm,5μm检测波长：254nm340nm306nm334nm参比波长：400nm流速：1ml/min进样量：20μl柱温：40℃流动相a：甲醇流动相b：水仪器：aglient1260flexiblepumpagilent1260multisampleraglient1260mctaglient1260dadhs流动相比例：表2梯度表时间a：甲醇b：水1025752258020330802043125755362575测试液的制备：称取苍术素对照品适量，用甲醇稀释制成含苍术素30.6μg/ml的溶液。称取大黄素对照品适量，用甲醇稀释制成含大黄素80.5μg/ml的溶液。称取虎杖苷对照品适量，用甲醇稀释制成含虎杖苷20.6μg/ml的溶液。取上述三种溶液，分别进样。结果：结果显示，苍术素在36min时间内没有出峰；大黄素在340nm波长条件下，为负峰，在254nm条件下出峰时间为29.926min，在306nm条件下出峰时间为29.926min，在334nm条件下，为负峰；虎杖苷在340nm波长条件下峰时间为7.670min且峰型不对称，在254nm条件下出峰时间为7.670min且峰型不对称，在306nm条件下出峰时间为7.670min且峰型不对称，在334nm条件下出峰时间为7.670min且峰型不对称。结论：在上述条件下，采用上述运行时间，苍术素无法洗脱，方法运行时间短，不能满足实际要求。334nm波长，大黄素存在负峰，负峰不利于样品组分的积分。虎杖苷峰性状不对称，不利于样品的准确定量。实施例5色谱柱：c18，250×4.6mm,5μm检测波长：254nm340nm306nm334nm参比波长：400nm流速：1ml/min进样量：20μl柱温：40℃流动相a：甲醇流动相b：水仪器：aglient1260flexiblepumpagilent1260multisampleraglient1260mctaglient1260dadhs流动相比例：表3梯度表时间a：甲醇b：水1025752258020345802044625755562575测试液的制备：称取苍术素对照品适量，用甲醇稀释制成含苍术素30.6μg/ml的溶液。称取虎杖苷对照品适量，用25%甲醇稀释制成含虎杖苷5.1μg/ml的溶液。取上述溶液，分别进样。结果：结果显示，苍术素在340nm波长条件下，33.806min出峰，在254nm条件下出峰时间为33.806min，在306nm条件下出峰时间为33.806min，在334nm条件下，出峰时间为33.806min；虎杖苷在340nm波长条件下，7.676min出峰，在254nm条件下出峰时间为7.676min，在306nm条件下出峰时间为7.676min，在334nm条件下，出峰时间为7.676min。结论：在上述条件下，采用上述运行时间，苍术素可以有效洗脱。虎杖苷通过采用25%甲醇溶解，峰形状对称。实施例6检测波长的选择色谱柱：c18，250×4.6mm,5μm检测波长：254nm340nm306nm334nm参比波长：400nm流速：1ml/min进样量：20μl柱温：40℃流动相a：甲醇流动相b：水仪器：aglient1260flexiblepumpagilent1260multisampleraglient1260mctaglient1260dadhs流动相比例：表4梯度表时间a：甲醇b：水1025752258020345802044625755562575测试液的制备：称取苍术素对照品适量，用甲醇稀释制成含苍术素30.6μg/ml的溶液。称取大黄素对照品适量，用甲醇稀释制成含大黄素80.5μg/ml的溶液。称取虎杖苷对照品适量，用25%甲醇稀释制成含虎杖苷5.1μg/ml的溶液。取上述三种溶液，分别进样。结果：见色谱图1，色谱图2，色谱图3，色谱图4结论：在上述条件下，采用上述运行时间，在306nm处个组分均有较大吸收，色谱图峰型良好。实施例7溶剂的选择测试液的制备：称取虎杖苷，大黄素，苍术素对照品适量，用25%甲醇稀释制成含虎杖苷10μg/ml，大黄素40μg/ml，苍术素15μg/ml的混合溶液，观察，溶液浑浊有不溶物。称取虎杖苷，大黄素，苍术素对照品适量，用50%甲醇稀释制成含虎杖苷10μg/ml，大黄素40μg/ml，苍术素15μg/ml的混合溶液，溶液澄清。结论：50%甲醇稀释虎杖苷，大黄素，苍术素对照可以用于样品稀释。实施例8提取条件确定色谱柱：c18，250×4.6mm,5μm检测波长：254nm340nm306nm334nm参比波长：400nm流速：1ml/min进样量：20μl柱温：40℃流动相a：甲醇流动相b：水ph=6.8仪器：aglient1260flexiblepumpagilent1260multisampleraglient1260mctaglient1260dadhs流动相比例：表5梯度表时间a：甲醇b：水1025752258020345802044625755562575样品的溶液制备：1，称取醒神香囊内容物0.4g，用甲醇50ml超声30min溶解。过滤进样。2，称取醒神香囊内容物0.4g，用乙醇50ml超声30min溶解。过滤进样。结果：见色谱图5，色谱图6由图可知，相同条件下，甲醇的提取率高于乙醇提取率。结论：甲醇提取率高于乙醇。甲醇提取溶剂中虎杖苷出现溶剂效应。实施例9提取条件确定色谱柱：c8，250×4.6mm,5μm检测波长：254nm340nm306nm334nm参比波长：400nm流速：1ml/min进样量：20μl柱温：40℃流动相a：甲醇流动相b：水ph=6.8仪器：aglient1260flexiblepumpagilent1260multisampleraglient1260mctaglient1260dadhs流动相比例：表6梯度表时间a：甲醇b：水1025752258020345802044625755562575样品的溶液制备：1，称取醒神香囊内容物适量，用甲醇超声30min溶解。过滤进样。2，取醒神香囊内容物适量，用70%甲醇超声30min溶解。过滤进样。3，称取醒神香囊内容物适量，用50%甲醇超声溶解。过滤进样。4，称取醒神香囊内容物适量，用25%甲醇溶解。结果：用甲醇溶解进样的样品中，虎杖苷峰产生溶剂效应。80%甲醇溶解的样品中虎杖苷依然有溶剂效应。50%甲醇溶解的样品虎杖苷峰型良好，见图7，出峰时间为7.151min，大黄素23.394min出峰，有其他物质峰干扰。25%甲醇溶解的样品中有浑浊，样品有析出。结论：采用50%甲醇溶解样品最优。采用c8色谱柱分离样品大黄素无法达到有效分离。实施例10分离条件的摸索色谱柱：c18，250×4.6mm,5μm检测波长：254nm340nm306nm334nm参比波长：400nm流速：1ml/min进样量：20μl柱温：40℃流动相a：甲醇流动相b：水ph=6.8仪器：aglient1260flexiblepumpagilent1260multisampleraglient1260mctaglient1260dadhs流动相比例：表7梯度表时间a：甲醇b：水1025752258020345802044625755562575样品的溶液制备：称取醒神香囊内容物适量，处理后，用50%甲醇超声溶解。过滤进样。结果：见图8，图8显示大黄素在28.839min出峰，样品溶液，大黄素未能基线分离结论：采用上述方法，流动相b的条件不适合。实施例11分离条件的摸索色谱柱：c18，250×4.6mm,5μm检测波长：254nm340nm306nm334nm参比波长：400nm流速：1ml/min进样量：20μl柱温：40℃流动相a：甲醇流动相b：水用磷酸调节ph=2.1±0.1仪器：aglient1260flexiblepumpagilent1260multisampleraglient1260mctaglient1260dadhs流动相比例：表8梯度表时间a：甲醇b：水1025752258020345802044625755562575样品的溶液制备：称取醒神香囊内容物适量，处理后，用50%甲醇超声溶解。过滤进样。结果：见图9，图9显示样品中虎杖苷在7.619min出峰，大黄素在29.853min出峰苍术素在33.765min出峰。目标组分实现有效分离。在供试品溶液中虎杖苷、大黄素、苍术素色谱峰的理论塔板数进行测定与计算，虎杖苷色谱峰的理论塔板n=9973，拖尾因子0.84，大黄素色谱峰的理论塔板n=202637，拖尾因子1.12，苍术素色谱峰的理论塔板n=169117，拖尾因子1.10。结论：当流动相ph在2.1±0.1各有效组分均能达到有效分离。实施例12系统优化实验色谱柱：c18，250×4.6mm,5μm检测波长：306nm参比波长：400nm流速：1ml/min进样量：20μl柱温：40℃流动相a：水-甲醇=75:25流动相b：ph=2.1±0.1水-甲醇=20:80仪器：aglient1260flexiblepumpagilent1260multisampleraglient1260mctaglient1260dadhs流动相比例：表9梯度表时间a：水-甲醇=75:25b：ph=2.1±0.1水-甲醇=20:801010002250100345010044610005561000定位溶液，系统测试溶液及样品溶液的制备称取虎杖苷对照品适量，用50%甲醇稀释制成含虎杖苷38.25μg/ml的溶液。称取大黄素对照品适量，用50%甲醇稀释制成含大黄素8.50μg/ml的溶液。称取苍术素对照品适量，用50%甲醇稀释制成含苍术素0.15μg/ml的溶液。另取虎杖苷、大黄素、苍术素对照品适量，制成含虎杖苷38.25μg/ml、大黄素8.50μg/ml、苍术素0.15μg/ml的混合溶液作为系统适应性测试溶液。称取醒神香囊内容物适量，用甲醇超声30min溶解，再用适量甲醇水溶液溶解过滤进样。结果：结果见图10、图11由图可知在系统测试溶液中虎杖苷出峰时间为7.616min，大黄素出峰时间为29.763min，苍术素出峰时间为33.563min。样品溶液中虎杖苷、大黄素、苍术素均能够有效分离。在对照品溶液中虎杖苷、大黄素、苍术素色谱峰的理论塔板数进行测定与计算，虎杖苷色谱峰的理论塔板n=10773，拖尾因子0.90，大黄素色谱峰的理论塔板n=205263，拖尾因子1.09，苍术素色谱峰的理论塔板n=177229，拖尾因子1.09，结论：本实验的色谱条件能够满足各有效组分的分离。起始梯度采用预混过的25%甲醇水溶液，较实施例11，基线噪音更小，经过测试，虎杖苷，大黄素和苍术素检测限浓度更小，方法更灵敏，虎杖苷峰对称性，较实施例11有明显改善。实施例13进样精密度实验色谱条件：同实施例12。供试溶液：同实施例12中系统适应性测试溶液。取系统适应性溶液分别进样测试三个成分的峰面积，并计算峰面积的rsd。结果：虎杖苷峰面积（n=6）rsd为0.03%。大黄素峰面积（n=6）rsd为0.76%。苍术素峰面积（n=6）rsd为1.30%。结论：进样精密度满足要求。实施例14重复性实验色谱条件：同实施例12。供试溶液：分别称取6份醒神香囊内容物，测定其含量，并计算其含量的rsd。结果：虎杖苷测量含量为2.24%（n=6）rsd为0.21%。大黄素测量含量为0.86%（n=6）rsd为0.06%。苍术素测量含量为0.021%（n=6）rsd为3.42%。结论：重复性符合要求。实施例15线性实验色谱条件：同实施例12。在指标浓度的范围内取6个浓度点进行研究。线性关系以测得的响应信号（峰面积）对被分析物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，至少报告相关系数r2来证实良好线性关系，要求线性回归系数r2的数值应不小于0.990。结论:虎杖苷在7.65~45.9μg/ml范围内y=1.2701x+0.1989r=1.0000，大黄素在1.7~10.2μg/ml范围内，y=0.2868x+0.0097.r=1.0000，苍术素在0.03~0.18μg/ml范围内y=1.4824x+0.0129r=0.9995，各峰峰面积与浓度呈良好线性关系，见图12，图13。图14.实验例16准确度准确度是通过在供试品中加入指标的90%、100%、110%三个不同浓度各成分测得的回收率所得。已知成分的准确度是加入已知量的成分，再测定加样样品中已知杂质的测定结果和理论值之间的比值（回收率），以百分率%表达，要求回收率在70.0%-130.0%之间，以证实方法具有良好的准确度。色谱条件：同实施例12。回收率测试结果见表10组分虎杖苷大黄素苍术素回收率90%97.54%98.07%95.38%回收率90%96.99%97.37%96.31%回收率90%97.80%98.48%96.22%回收率100%100.19%99.85%101.61%回收率100%99.66%99.25%101.43%回收率100%100.08%99.60%102.35%回收率110%103.99%103.20%106.78%回收率110%103.52%102.73%105.86%回收率110%104.63%103.79%106.23%平均100.49%100.26%101.35%结论：虎杖苷回收率在96.99%~104.63%、大黄素回收率在97.37%~103.79%、苍术素回收率在95.38%~106.78%，上述结果表明该方法准确度良好。实验例17色谱柱：c18，250×4.6mm,5μm检测波长：306nm参比波长：400nm流速：1ml/min进样量：20μl柱温：38℃流动相a：甲醇流动相b：水用磷酸调节ph=2.0虎杖苷、大黄素、苍术素对照品适量用50%甲醇溶解并稀释，制成含虎杖苷38.25μg/ml、大黄素8.50μg/ml、苍术素0.15μg/ml的混合溶液作为系统适应性测试溶液和对照溶液。另取批号为20190213的样品0.1g加甲醇25ml，超声30min放冷。再加入25ml的水，充分震摇后，取上清液，过滤，作为供试品溶液。取上述对照品和供试品分别进样，测得20190213的样品中，虎杖苷含量为2.24%、大黄素含量为0.86%、苍术素含量为0.0021%。实验例18色谱柱：c18，250×4.6mm,5μm检测波长：306nm参比波长：400nm流速：1ml/min进样量：20μl柱温：42℃流动相a：水-甲醇=75:25流动相b：ph=2.2水-甲醇=20:80虎杖苷、大黄素、苍术素对照品适量用50%甲醇溶解并稀释，制成含虎杖苷38.25μg/ml、大黄素8.50μg/ml、苍术素0.15μg/ml的混合溶液作为系统适应性测试溶液和对照溶液。另取批号为20190216的样品0.1g加甲醇25ml，超声30min放冷。再加入25ml的水，充分震摇后，取上清液，过滤，作为供试品溶液。取上述对照品和供试品分别进样，测得20190216的样品中，虎杖苷含量为2.26%、大黄素含量为0.88%、苍术素含量为0.0023%。实验例19色谱柱：c18，250×4.6mm,5μm检测波长：306nm参比波长：400nm流速：1ml/min进样量：20μl柱温：40℃流动相a：水-甲醇=75:25流动相b：ph=2.0水-甲醇=20:80虎杖苷、大黄素、苍术素对照品适量用50%甲醇溶解并稀释，制成含虎杖苷38.25μg/ml、大黄素8.50μg/ml、苍术素0.15μg/ml的混合溶液作为系统适应性测试溶液和对照溶液。另取批号为20190219的样品0.1g加甲醇25ml，超声30min放冷。再加入25ml的水，充分震摇后，取上清液，过滤，作为供试品溶液。取上述对照品和供试品分别进样，测得20190219的样品中，虎杖苷含量为2.24%、大黄素含量为0.87%、苍术素含量为0.0024%。附图说明图1是[0035]实施例6检测波长的选择，254nm波长下色谱图，图2是实施例6检测波长的选择，340nm波长下色谱图，图3是实施例6检测波长的选择，306nm波长下色谱图，图4是实施例6检测波长的选择，334nm波长下色谱图，图5是[0043]实施例8提取条件确定，甲醇提取的样品色谱图，图6是实施例8提取条件确定，乙醇提取的样品色谱图，图7是[0047]实施例9提取条件确定，样品测试色谱图，图8是[0053]实施例10分离条件的摸索，样品测试色谱图，图9是[0055]实施例11提取条件确定，样品测试色谱图，图10是[0055]实施例12系统优化实验，样品测试色谱图，图11是实施例12系统优化实验，样品测试色谱图，图12是[0079]实施例15线性实验，虎杖苷线性回归图，图13是[0实施例15线性实验，大黄素线性回归图，图14是实施例15线性实验，苍术素线性回归图。当前第1页12