一种检测J亚群禽白血病病毒抗体的ELISA试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种病毒抗体检测试剂盒及其应用，特别涉及一种检测j亚群禽白血病病毒抗体的elisa试剂盒及其应用，本发明属于病毒检测技术领域。

背景技术：

禽白血病病毒(avianieukosisvirus，alv)属反转录病毒科，禽c型反转录病毒属，可引起禽类多种肿瘤性疾病。禽白血病主要危害有两个方面，一是产生肿瘤，导致鸡的死亡；二是该病属于蛋传性疾病，会将病毒通过生殖道传播给子代雏鸡，进而引起下一代鸡发病；而且，还可以引起鸡的免疫抑制，继发其他细菌和病毒的感染，造成严重的经济损失。1997年和1998年，j亚群禽白血病在世界范围内爆发，给养禽业造成了巨大的经济损失。2008年以来，我国蛋鸡和地方品种鸡爆发了严重的禽白血病，病原主要以j亚群禽白血病病毒(alv-j)为主，给我国的养禽业造成了严重打击，同时也严重威胁我国家禽种源安全。为此，禽白血病被纳入到《国家动物疫病防治中长期规划(2012-2020)》、《全国兽医卫生事业发展规划(2016-2020年)》和《农业部关于促进现代畜禽种业发展的意见(2016年)》中优先防治与净化的疫病。

目前，该病尚无有效的疫苗和药物可用，预防本病的主要方法是淘汰阳性鸡，净化种群。自1868年，roloff报道禽白血病以来，研究工作者就对其进行长期的研究，并在病毒的分离、鉴定、检测和诊断方面取得了相当大的成就。建立了很多禽白血病病原的检测方法，如病毒中和试验、琼脂扩散实验、补体结合试验、elisa、放射免疫、免疫荧光技术等。然而抗体检测方法报道较少。自2008年以来，我国蛋鸡和地方品种鸡j亚群白血病的广泛流行，给我国养禽业造成了巨大的经济损失，因而急需开展禽白血病的净化。虽然抗原检测试剂是禽白血病净化中主要使用的检测试剂，但抗体检测是评价净化效果和鸡群是否感染禽白血病病毒的重要技术手段。

因此，建立一种能够快速，灵敏的检测j亚群禽白血病病毒抗体的方法是控制该病大规模流行的有效手段。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测j亚群禽白血病病毒抗体的elisa试剂盒，并建立了基于该试剂盒的检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

alv-j的囊膜蛋白gp85含有抗原决定簇，是决定病毒亚群的蛋白，有许多病毒抗原位点。然而以全长gp85表达产物为包被抗原，与其他亚群禽白血病病毒诱导的抗体有一定的交叉反应，特异性不是很好，为了提高特异性，本发明发明人分析比对了常引起鸡群发病的a(alv-a)、b(alv-b)和j亚群alv(alv-j)的gp85氨基端序列，选取了同源性尽可能低的氨基酸序列片段，构建了截短表达alv-jgp85的稳定表达细胞系，实现了截短gp85蛋白的稳定表达。前期的研究证明，真核表达的gp85蛋白可以结合alv-j的细胞受体，具有完全正确的构象和功能。在本发明中，发明人以真核表达的截短的alv-jgp85蛋白为包被抗原，建立了检测alv-j抗体的间接elisa方法。结果表明，该方法的最低检出血清稀释度为1：102400，而美国idexx公司alv-j抗体检测试剂盒为1：25600，敏感性比进口试剂盒高4倍。另外，在特异性实验中，idexx公司alv-j抗体检测试剂盒除了与alv-j的血清反应外，同时还与alv-a和alv-b阳性血清有交叉反应，而本发明建立的elisa方法仅能与alv-j阳性血清反应，特异性优于进口试剂盒。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种检测j亚群禽白血病病毒抗体的elisa试剂盒，所述的试剂盒包括包被截短表达的alv-jgp85蛋白的酶标板，其中，所述的截短表达的alv-jgp85蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。

其中，优选的，所述试剂盒还包括hrp标记的兔抗鸡igg、阳性对照、阴性对照、包被液、稀释液、显色液、洗涤液和终止液。

其中，优选的，所述阳性对照为j亚群禽白血病病毒阳性动物血清；所述阴性对照为健康动物血清，优选为spf鸡血清；所述包被液为50g/l脱脂奶粉；所述稀释液为含有1％牛血清白蛋白的pbst缓冲液；所述显色液为显色液tmb；所述洗涤液为pbst缓冲液；所述终止液为2mh2so4。

其中，优选的，所述的试剂盒用于检测j亚群禽白血病病毒抗体时，具体的包括以下步骤：

(1)包被截短表达的alv-jgp85的酶标板4℃过夜后用洗涤液洗涤，37℃下用封闭液封闭1h，洗板；

(2)加入对照和待测血清样品，37℃孵育，洗板；

(3)加入hrp标记的兔抗鸡igg，37℃孵育，洗板；

(4)加入tmb显色液，37℃显色，最后加终止液终止反应，测定od405nm值，当od450nm值≥0.20时，判定为阳性。

其中，优选的，截短表达的alv-jgp85的包被量为2μg/ml，血清样品的稀释倍数为1:500，hrp标记的兔抗鸡igg的稀释度为1:3000，血清样品、hrp标记的兔抗鸡igg及tmb的作用时间分别为30min、30min和15min，封闭液为50g/l脱脂奶粉。

其中，优选的，所述的截短表达的alv-jgp85蛋白经由保藏编号为cgmccno.17418的稳定表达截短alv-jgp85的293f细胞系表达、纯化后获得。

进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的试剂盒在制备检测j亚群禽白血病病毒抗体试剂中的应用。

更进一步的，本发明还提出了一种稳定表达截短alv-jgp85的293f细胞系，命名为293f-jtgp85，分类命名为表达j亚群禽白血病病毒截短gp85的293f稳定表达细胞系，该细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为cgmccno.17418，保藏时间为2019年3月28日。

一种由所述的稳定表达截短alv-jgp85的293f细胞系表达产生的截短表达的alv-jgp85蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

编码所述的截短表达的alv-jgp85蛋白的核苷酸序列也在本发明的保护范围之内。其中，优选的，所述的核苷酸序列如seqidno.1所示。

再进一步的，本发明还提出了所述的截短表达的alv-jgp85蛋白在制备检测j亚群禽白血病病毒抗体试剂中的用途。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明利用截短表达的j亚群禽白血病病毒(alv-j)gp85蛋白建立了alv-j抗体间接elisa方法及其试剂盒，特异性好，与ab亚群alv抗体无交叉，且其敏感性和特异性优于同类进口试剂盒，本发明的提出为alv-j的检测和流行病学调查以及alv-j的早期诊断提供了有效技术手段。

附图说明

图1为plvx-j-tgp85质粒感染293t细胞包装慢病毒荧光结果；

其中：a：荧光显微镜观察结果；b：明场细胞观察结果；

图2为慢病毒感染的293f细胞分选后荧光检测结果；

图3为截短alv-jgp85蛋白表达鉴定结果；

图4为间接elisa敏感性分析结果；

图5为间接elsia特异性分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1稳定表达截短alv-jgp85蛋白细胞系的构建

1材料方法

1.1试剂及仪器

胎牛血清购于excell公司；dmem高糖培养基购于transgen公司；293cd293m无血清培养基购于上海源培生物科技公司；dh5α感受态大肠杆菌、真核表达载体plvx、293t细胞、293f细胞株及含有alv-jgp85目的片段的质粒由本实验室保存；限制性内切酶bamhi与xhoi购于thermo公司；t4连接酶，购于neb公司。

1.2表达截短alv-jgp85蛋白真核表达载体的构建

为了使表达的alv-jgp85蛋白仅与alv-j特异性血清反应，而不与a或b亚群alv(alv-a或alv-b)抗体有交叉反应，发明人分析比较了alv-j、alv-a和alv-bgp85基因序列，选取alv-j国内分离株jl08ch03-1第121-777bp的gp85基因进行密码子优化并合成，优化后的gp85基因序列如seqidno.1所示，其上游添加信号肽序列，下游携带fc标签。序列两端分别为xhoⅰ和bamhⅰ两个酶切位点。将此序列双酶切后，胶回收，酶切产物用t4连接酶连接到同样经xhoⅰ和bamhⅰ酶切的慢病毒表达载体plvx，构建成重组质粒plvx-j-tgp85。将重组质粒转化至dh5α感受态细胞，提取质粒，xhoⅰ和bamhⅰ双酶切鉴定后，挑取阳性克隆进行测序，最终获得重组质粒命名为plvx-j-tgp85。

1.3慢病毒包装

293t细胞在含10％胎牛血清的dmem培养基中，于37℃和5％co2饱和湿度的培养箱中培养。待细胞生长至80％～90％密度时，将0.1％pei、质粒plvx-j-tgp85按照3：1的比例加入到无血清培养基中，混合后室温孵育15min，转染293t细胞，继续培养48h后，荧光显微镜下观察绿色荧光在细胞的表达与分布，收集细胞上清作为包装好的病毒液。

1.4稳定表达截短alv-jgp85293f细胞系的构建、目的蛋白的表达纯化鉴定

293f细胞在无血清、2％青链霉素混合液的293m无血清培养基中，于37℃和5％co2饱和湿度的摇床培养箱中培养。将293f细胞传代，加入包装好的病毒液至293f细胞中继续培养，每12h，荧光显微镜下观察绿色荧光信号在细胞的表达与分布，观察至细胞的荧光率不再升高，使用超高速流式分选仪分选表达绿色荧光蛋白的细胞。分选得到的细胞放入培养摇瓶继续培养。收集分选后的293f细胞上清，加入proteina树脂，4℃结合12h之后进行蛋白纯化。将收集到的洗脱液进行sds-page凝胶电泳，转nc膜，转膜后用pbst洗膜3次，将膜在5％脱脂乳中封闭1.5h，之后pbst洗膜5次。fc单抗1：3000pbs稀释为30ml，室温孵育1.5h，用pbs洗膜5次。加入对应二抗室温孵育1h后，用pbs洗膜5次。采用odyssey扫描仪扫描结果。

2.结果

2.1真核表达质粒plvx-j-tgp85鉴定

plvx-j-tgp85质粒经bamhi和xhoi双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示，得到约1.4kb目的片段，与预期大小相符合。将阳性克隆测序，结果与原序列相符，表明质粒plvx-j-tgp85构建成功。

2.2表达截短alv-jgp85慢病毒的包装与鉴定

将plvx-j-tgp85质粒转染293t细胞，48h后在倒置荧光显微镜下观察，发现绿色荧光显著，证明慢病毒包装成功(图1)。

2.3稳定表达截短alv-jgp85蛋白细胞系构建与鉴定

将包装好的慢病毒感染293f细胞后，24h出现荧光，48h时荧光率达到最高，荧光率在30％左右，荧光稳定表达。如图2所示，细胞经过流式细胞术分选后，绿色荧光阳性率达到85％以上。收集细胞培养上清，proteina树脂纯化后，westernblot检测纯化产物表明，细胞系可以高效表达截短的alv-jgp85蛋白，表达量可达8mg/100ml(图3)，这些结果表明，稳定表达截短alv-jgp85的293f细胞系构建成功。

将本发明获得的稳定表达截短alv-jgp85的293f细胞系，命名为293f-jtgp85，分类命名为表达j亚群禽白血病病毒截短gp85的293f稳定表达细胞系，该细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为cgmccno.17418，保藏时间为2019年3月28日。

实施例2elisa方法的建立

1材料方法

1.1试剂及仪器

hrp标记的兔抗鸡igg、羊抗鼠fitc二抗购于sigma公司；proteina树脂购于ge公司：显色液tmb，购于tiangen公司；酶标板购于costar公司。

1.2最佳反应条件的选择

在不同反应条件下，对截短alv-jgp85包被浓度(4、2、1、0.5、0.25μg/ml)，样品血清工作浓度(1：125、1：250、1：500、1：1000、1：2000、1：4000)，封闭液的种类(s-blockingbuffer、50g/l脱脂奶粉、10g/l鱼明胶、酶标板稳定剂)，hrp标记的兔抗鸡igg稀释度(1:8000、1:5000、1：3000)及tmb工作最佳作用时间(5、10、15、20min)等各项反应条件进行优化。选择od450nm值接近于1.0，p/n值最大的条件为最佳条件。

1.3判定标准的确定

取184只spf鸡，采集血清作为阴性血清，进行elisa检测。设阴阳性对照。计算被检阴性血清平均值od450nm值与偏差(s)，判定标准为阴性对照和阳性对照成立的条件下，检测样品od450＞+3s判定为阳性，反之为阴性。

1.4敏感性试验和特异性试验

在最佳反应条件下，将标准阳性血清稀释成1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200、1：102400、1：204800分别进行检测，确定本方法的敏感性。将alv-a、alv-b、鸡传染性贫血病毒(cav)、禽网状内皮组织增生症病毒(rev)、鸡传染性法氏囊病病毒(ibdv)、h9亚型禽流感病毒(aiv-h9)、新城疫病毒(ndv)、病毒性关节炎病毒(arv)和传染性喉气管炎病毒(iltv)等10种常见的禽类病毒抗体1：500稀释，评价其特异性。

2结果

2.1反应参数的确定以及间接elisa方法的建立

经试验确定了检测alv-j抗体的间接elisa方法的参数：截短表达的alv-jgp85最佳包被量为2μg/ml，血清样品最佳稀释倍数为1:500，hrp标记的兔抗鸡igg最佳稀释度为1:3000，血清样品、hrp标记的兔抗鸡igg及tmb最佳作用时间分别为30min、30min和15min。封闭液为50g/l脱脂奶粉。

间接elisa检测的具体步骤为：

(1)包被截短表达的alv-jgp85的酶标板(包被量为2μg/ml)，4℃过夜后用洗涤液洗涤，37℃下用50g/l脱脂奶粉封闭1h，洗板；

(2)加入稀释倍数为1:500的对照和待测血清样品，37℃孵育30min，洗板；

(3)加入稀释度为1:3000的hrp标记的兔抗鸡igg，37℃孵育30min，洗板；

(4)加入显色液，37℃显色15min，最后加终止液终止反应，测定od405nm值。

2.2阴阳性判断标准确定

在上述反应参数条件下，用184份alv-j阴性肛血清进行间接elisa，平均值为0.076，标准差为0.031，依据公式x+3s＝0.167，根据统计学原则取od450nm值≥0.20时，可在99.9％的可信度上判定为阳性，作为检测结果的判断标准。

2.3敏感性试验和特异性试验

利用本发明建立的间接elisa方法和idexx公司alv-j抗体检测试剂盒，测定1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200、1：102400不同稀释度的alv-j阳性血清。结果表明，本发明建立的间接elisa方法的最低检出血清稀释度为1：102400(图4)，idexx公司alv-j抗体检测试剂盒为1：25600。表明本发明建立的间接elisa方法比idexx公司alv-j抗体检测试剂盒的敏感性高4倍(图4)。

对alv-a、alv-b、cav、rev、ibdv、aiv-h9、ndv、ibd、arv和iltv等10种常见感染禽病毒检测结果表明，本发明建立的间接elisa方法检测od450nm值均小于0.1，均为阴性，而idexx公司alv-j抗体检测试剂盒除了与alv-j阳性血清反应外，还与alv-a和alv-b的阳性血清反应(图5)。表明本发明建立的间接elisa方法比idexx公司alv-j抗体检测试剂盒的特异性好。

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）

<120>一种检测j亚群禽白血病病毒抗体的elisa试剂盒及其应用

<130>klpi190320

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>657

<212>dna

<213>alv-jgp85

<400>1

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