一种食用植物油中黄曲霉毒素样品萃取检测方法及其净化枪头与流程

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种食用植物油中黄曲霉毒素样品萃取检测方法及其净化枪头。

背景技术：

黄曲霉毒素是一种剧毒的香豆素类衍生物，由黄曲霉菌代谢产生，一类致癌物。黄曲霉菌多存在于湿热环境下发霉的粮食当中。而花生、大豆油等多种食用植物油均通过油料作物发酵酿造制得。因此这些油料作物如若采用被黄曲霉菌污染，所得产品中也有很大可能含有黄曲霉毒素，从而影响消费者健康。

食用植物油中的物质组成复杂多样，食品成分分析前需要对干扰的物质进行净化处理，以便顺利完成检测。常用的萃取方法是固相萃取方法，①这种方法需要专门的处理设备，成本高，不利于快速检测及野外检测的环境。②在萃取过程中，样品需要慢慢流经固相柱，并用大量溶剂不断洗脱，耗时过长且操作不便。③样品在萃取后需要二次转移到检测设备当中进行检测。其难以避免与外界环境发生接触，容易引起二次污染，影响检测的精度。移液枪是分析检测过程必备的液体移取工具，移液精度高，广泛应用于食品、环境、生物检测领域。

技术实现要素：

为了提高检测工作效率，提高检测精度，本发明提供一种食用植物油中黄曲霉毒素样品萃取检测方法，将移液技术与样品净化技术相结合，可以实现在液体移取的同时，完成待测样品的净化过程，大大节省了操作步骤，保证了检测精度。

本发明提供一种食用植物油中黄曲霉毒素样品萃取检测方法，检测步骤包括：(1)样品提取：取待检样品用提取溶剂定容，振荡提取，收集上清液为样品提取液；(2)样品吸液：采用移液枪定量吸取样品提取液；(3)净化萃取：采用移液枪继续定量吸取空气，并将移液枪头超声处理，振动及鼓动样品提取液中气泡，使移液枪头内净化萃取材料吸附待测组分；(4)样品排液：将移液枪内残液排出；(5)样品洗脱：抽取洗脱溶剂，重复(3)、(4)步骤操作，使移液枪头内净化萃取材料洗脱待测组分，合并各残液得到样品洗脱液；(6)样品检测：将样品洗脱液送至检测设备上机检测。

其中，在步骤(1)中，提取步骤包括：称取5g食用植物油样品于50ml离心管中，用提取液(20ml84％乙腈/水)定容到25ml，高速均质(≥10,000r/min)5min、摇床(200-300r/min)剧烈振荡20min或超声提取30min，用快速定量滤纸过滤并收集滤液或放入离心机(≥7000r/min离心20min)收集上清液，取上清液作为样品提取液。所述食用植物油优选为花生油、大豆油、玉米油、芝麻油、葵花籽油、菜籽油、橄榄油中的至少一种，及其多种的调和油。

优选的，移液枪枪头体积容量为(3-15)ml，提取液的样品吸取量占枪头体积容量的(10-30)％，吸入空气占枪头体积容量(70-90)％。

其中，在步骤(2)中，样品萃取步骤包括：①取出枪头，安装于移液枪，将枪头伸入待萃取样品液面以下，按下移液枪吸液，吸入1ml待净化样品，停留5s；②将移液枪枪头移出液面，再次按下移液枪吸液，吸入1ml空气，使液体与萃取材料充分混合，重复此步骤三次，共吸入4ml空气；③移液枪显示5000ulall满载，将枪头对准2ml样品瓶，按下移液枪排液；④抽取1ml洗脱溶剂，重复②、③步骤操作，收集并合并净化和洗脱后的残液，得样品洗脱液。

其中，在步骤(5)中，通过高效液相色谱(hplc)进行分析，检测条件为：

流动相：a相，水；b相，乙腈-甲醇(50:50，v:v)；

等梯度洗脱条件：a，68％；b，32％；

色谱柱：c18柱(柱长150mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)；

流速：1.0ml/min；

柱温：40℃；

进样量：50μl；

荧光检测：激发波长：360nm；发射波长：440nm，光化学柱后衍生。

本发明还提供一种适用于上述检测方法的净化枪头，其包括管体，管体内从上到下依次设置有卡扣、上筛板、萃取材料和下筛板，所述上筛板和下筛板与管体内部固定连接，所述萃取材料设置于两筛板间的管体内。优选的，上筛板和下筛板的材料为超高分子量聚乙烯，孔隙率范围(30-50)％，孔径范围(50-150)μm。

萃取材料包括但不限于：硅藻土、硫酸镁、石墨化碳黑、磺酸基n-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、羧基n-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、亚甲基哌嗪环n-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、c18改性硅胶、c8改性硅胶、氨丙基键合硅胶、二醇基键合硅胶、弗罗里硅土或氧化铝中的至少一种。优选的，在所要净化的样品中，石墨化碳黑吸附色素，硅藻土吸附糖类，硅胶吸附极性物质。

有益的技术效果

本发明提供的黄曲霉毒素样品萃取检测方法，将微量移液技术与样品吸附-萃取-浸取三联技术相结合，可以实现在微量液体定量移取的同时，通过气泡鼓动与超声振动效应，促进萃取材料充分混合吸附，尤其使吸附材料与吸附杂质达到充分的混合，完成待测样品的净化萃取过程，再用对应溶剂浸取洗脱，大大节省了操作步骤，消除杂质干扰背景，保证了检测精度，提高了样品净化速度，并且显著提高了样品的回收率，检测重复性好。

附图说明

图1为本发明黄曲霉毒素萃取检测方法所用净化枪头的结构示意图；

图2为本发明黄曲霉毒素萃取检测方法所用净化枪头吸取样品示意图；

图3为本发明黄曲霉毒素萃取检测方法所用净化枪头净化样品示意图。

图4为本发明黄曲霉毒素萃取检测方法所用净化枪头释放样品示意图。

图5为本发明黄曲霉毒素萃取检测方法所用净化枪头洗脱样品示意图。

图6a-6h为本发明黄曲霉毒素萃取检测方法实施例检测谱图：

实施例1图6a黄曲霉毒素混标液相色谱图；图6b花生油样品与花生油加标样品对比图；

实施例2图6c黄曲霉毒素混标液相色谱图；图6d菜籽油空白样品液相色谱图；图6e菜籽油空白加标样品液相色谱图；

实施例3图6f黄曲霉毒素混标液相色谱图；图6g豆油样品阴性液相色谱图；图6h豆油阴性样品加标液相色谱图。

附图标记：卡扣1，上筛板2，净化材料3，下筛板4，样品提取液5，吸附杂质的净化材料31，与净化材料协同运动的气泡6，液面7。

具体实施方式

本发明提供一种食用植物油中黄曲霉毒素样品萃取检测方法，检测步骤包括：(1)样品提取：取待检样品用提取溶剂定容，振荡提取，收集上清液为样品提取液；(2)样品吸液：采用移液枪定量吸取样品提取液；(3)净化萃取：采用移液枪继续定量吸取空气，并将移液枪头超声处理，振动及鼓动样品提取液中气泡，使移液枪头内净化萃取材料吸附待测组分；(4)样品排液：将移液枪内残液排出；(5)样品洗脱：抽取洗脱溶剂，重复(3)、(4)步骤操作，使移液枪头内净化萃取材料洗脱待测组分，合并各残液得到样品洗脱液；(6)样品检测：将样品洗脱液送至检测设备上机检测。

其中，在步骤(1)中，提取步骤包括：称取5g液体油料作物样品于50ml离心管中，用提取液(纯乙腈)定容到25ml，涡旋混匀；超声提取20min，放入离心机(8000r/min离心20min)，取上清液作为样品提取液。所述液体油料作物优选为液态的食用植物油，包括花生油、大豆油、玉米油、芝麻油、葵花籽油、菜籽油、橄榄油中的至少一种，及其多种的调和油。移液枪枪头体积容量为(3-15)ml，提取液的样品吸取量占枪头体积容量的(10-30)％，吸入空气占枪头体积容量(70-90)％。

其中，在步骤(2)中，样品净化步骤包括：①取出枪头，安装于移液枪，将枪头伸入待净化样品液面以下，按下移液枪吸液，吸入1ml待净化样品，停留5s；②将移液枪枪头移出液面，再次按下移液枪吸液，吸入1ml空气，使液体与萃取材料充分混合，重复此步骤三次，共吸入4ml空气；③移液枪显示5000ulall满载，将枪头对准2ml样品瓶，按下移液枪排液；④抽取1ml洗脱溶剂，重复②、③步骤操作，收集并合并净化和洗脱后的残液，得样品洗脱液。

其中，在步骤(5)中，通过高效液相色谱(hplc)进行分析，检测条件为：

流动相：a相，水；b相，乙腈-甲醇(50:50，v:v)；

等梯度洗脱条件：a，68％；b，32％；

色谱柱：c18柱(柱长150mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)；

流速：1.0ml/min；

柱温：40℃；

进样量：50μl；

荧光检测：激发波长：360nm；发射波长：440nm，光化学柱后衍生。

本发明还提供一种适用于上述检测方法的净化枪头，其包括管体，管体内从上到下依次设置有卡扣、上筛板、萃取材料和下筛板，所述上筛板和下筛板与管体内部固定连接，所述萃取材料设置于两筛板间的管体内。上筛板和下筛板的材料为超高分子量聚乙烯，孔隙率范围(30-50)％，孔径范围(50-150)μm。

萃取材料包括但不限于：硅藻土、硫酸镁、石墨化碳黑、磺酸基n-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、羧基n-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、亚甲基哌嗪环n-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、c18改性硅胶、c8改性硅胶、氨丙基键合硅胶、二醇基键合硅胶、弗罗里硅土或氧化铝中的至少一种。在所要净化的样品中，石墨化碳黑吸附色素，硅藻土吸附糖类，硅胶吸附极性物质。

下面根据具体实施例对本发明净化检测实施过程进行阐述：

实施例1

花生油中黄曲霉毒素应用案例

样品提取：

·称取5g花生油样品于50ml离心管中，加入20ml提取液(84％乙腈-水溶液)混匀；

·振荡提取30min，放入离心机(8000r/min)离心20min，取上清液作为样品提取液。

·样品净化萃取：

·步骤1：取出枪头，安装于电动移液枪，将枪头伸入样品提取液液面以下，按一下电动移液枪吸液按键，吸入1ml样品提取液，停留5s。

·步骤2：将移液枪枪头移出液面，再次按一下电动移液枪吸液按键，吸入1ml空气，将移液枪头超声振荡鼓动30min，使液体与填料充分混合，重复此步骤三次，共吸入4ml空气。

·步骤3：移液枪显示5000ulall，将枪头对准2ml样品瓶，再次按一下移液枪排液键，进行排液，收集净化液。

·样品洗脱：

·抽取洗脱溶剂，重复精华萃取操作，使移液枪头内净化萃取材料洗脱待测组分，与净化液合并得到样品洗脱液。

·上机分析：将样品洗脱液送至hplc检测设备上机检测。

hplc检测条件：

·流动相：a相，水；b相，乙腈-甲醇(50:50，v:v)

·等梯度洗脱条件：a，68％；b，32％

·色谱柱：c18柱(柱长250mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)

·流速：1.0ml/min

·柱温：40℃

·进样量：50μl

·荧光检测：激发波长：360nm；发射波长：440nm，光化学柱后衍生

实验结果：

图6a黄曲霉毒素混标液相色谱图，其中，afg1和b1浓度为2ng/ml；afg2和b2浓度为0.6ng/ml。

图6b花生油样品与花生油加标样品对比图，其中，afg1和b1加标浓度为4ng/g；afg2和b2加标浓度为1.2ng/g。

从图6a和对比图6b中能够明确得出，四种黄曲霉毒素b1、b2、g1和g2的起出峰位置。对于花生油样品，上述四个峰的标样位置处基本是平的，说明无黄曲霉毒素。并且不会因为没有黄曲霉毒素而出峰，从而引起误判。加入标准黄曲霉毒素之后，四个峰的位置明显，且没有损失，说明净化材料并没有吸附黄曲霉毒素，不会降低对黄曲霉毒素含量的判断。

表1花生油样品最低检出限、加标回收率与重复性(afg1和b1加标浓度为4ng/g；afg2和b2加标浓度为1.2ng/g)

*af为黄曲霉毒素的简称，g1、g2、b1和b2为黄曲霉素的四种类型

实施例2

菜籽油中黄曲霉毒素应用案例

样品提取：

·称取5g菜籽油样品于50ml离心管中，加入20ml提取液(84％乙腈-水溶液)混匀

·振荡提取30min，放入离心机(8000r/min)离心20min，取上清液作为样品提取液

·样品净化：

·步骤1：取出枪头，安装于电动移液枪，将枪头伸入样品提取液液面以下，按一下电动移液枪吸液按键，吸入4.5ml样品提取液，停留5s。

·步骤2：将移液枪枪头移出液面，再次按一下电动移液枪吸液按键，吸入4.5ml空气，将移液枪头超声振荡鼓动20min，使液体与填料充分混合，重复此步骤两次，共吸入9ml空气。

·步骤3：移液枪显示15000ulall，将枪头对准5ml样品瓶，再次按一下移液枪排液键，进行排液，收集净化液。

·样品洗脱：

·抽取洗脱溶剂，重复精华萃取操作，使移液枪头内净化萃取材料洗脱待测组分，与净化液合并得到样品洗脱液。

·上机分析：将样品洗脱液送至hplc检测设备上机检测。

hplc检测条件：

·流动相：a相，水；b相，甲醇

·等梯度洗脱条件：a，70％；b，30％

·色谱柱：c18柱(柱长250mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)

·流速：1.0ml/min

·柱温：40℃

·进样量：50μl

·荧光检测：激发波长：360nm；发射波长：440nm，光化学柱后衍生

实验结果：

图6c黄曲霉毒素混标液相色谱图，其中，af的g1和b1浓度为4ng/ml；af的g2和b2浓度为1ng/ml。

图6d菜籽油空白样品液相色谱图。

图6e菜籽油空白加标样品液相色谱图，其中，afg1和b1加标浓度为4ng/g；afg2和b2加标浓度为1ng/g。

表2菜籽油样品最低检出限、加标回收率与重复性(afg1和b1加标浓度为4ng/g；afg2和b2加标浓度为1ng/g)

实施例3

豆油中黄曲霉毒素应用案例

样品提取：

·称取5g豆油样品于50ml离心管中，加入20ml提取液(84％乙腈-水溶液)混匀

·超声提取30min，放入离心机(8000r/min)离心20min，取上清液作为样品提取液

·样品净化：

·步骤1：取出枪头，安装于电动移液枪，将枪头伸入样品提取液液面以下，按一下电动移液枪吸液按键，吸入1ml样品提取液，停留5s。

·步骤2：将移液枪枪头移出液面，再次按一下电动移液枪吸液按键，吸入3ml空气，使液体与填料充分混合，重复此步骤三次，共吸入9ml空气。

·步骤3：移液枪显示10000ulall，将枪头对准2ml样品瓶，再次按一下移液枪排液键，进行排液，收集净化液。

·样品洗脱：

·抽取洗脱溶剂，重复精华萃取操作，使移液枪头内净化萃取材料洗脱待测组分，与净化液合并得到样品洗脱液。

·上机分析：将样品洗脱液送至hplc检测设备上机检测。

hplc检测条件：

·流动相：a相，水；b相，乙腈-甲醇(50:50，v:v)

·等梯度洗脱条件：a，68％；b，32％

·色谱柱：c18柱(柱长150mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)

·流速：1.0ml/min

·柱温：40℃

·进样量：50μl

·荧光检测：激发波长：360nm；发射波长：440nm，光化学柱后衍生

实验结果：

图6f黄曲霉毒素混标液相色谱图，其中，afg1和b1浓度为5ng/ml；afg2和b2浓度为1.5ng/ml。

图6g豆油样品阴性液相色谱图

图6h豆油阴性样品加标液相色谱图，其中，afg1和b1加标浓度为10ng/g；afg2和b2加标浓度为3ng/g。

表3豆油样品加标回收率(afg1和b1加标浓度为10ng/g；afg2和b2加标浓度为3ng/g)

所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。