一种谷类作物中有机毒素样品振动净化检测方法及其超声移液枪与流程

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种谷类作物中有机毒素样品振动净化检测方法及其超声移液枪。

背景技术：

粮食作物尤其是谷物类作物，从最初的人工种植或机械收割，到干燥去壳而最终入仓，需要经历漫长的存储加工过程。普通粮食的存储，往往不在谷类作物中添加任何防腐成分，单靠干燥脱水存储。因此，常常因加工存储不当或流转时间过长而发生粮食霉变。

粮食中的有机毒素是由各种霉菌代谢产生，例如玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、黄曲霉素等，是多种剧毒的致癌物。粮食加工前序工艺非常重要的一步就是毒性成分分析，分析前需要对干扰的粮食物质进行净化萃取处理。常用的粮食净化方法多采用净水清洗、水泡以及蒸煮灭菌等方式，再采用对应有机溶剂固相萃取。

然而，①上述方法需要专门的粮食处理设备，成本高，不利于快速检测及野外采集检测的环境。②在净化过程中，样品仅靠重力与硅胶吸附作用慢慢流经固相柱，耗时过长且操作不便，并且植物类材料颗粒容易堵塞柱体，影响净化产率。③样品在净化后需要额外步骤转移到检测设备当中进行检测。其难以避免与外界环境发生接触，容易引起二次污染，影响检测的精度。移液枪是分析检测过程必备的液体移取工具，移液精度高，广泛应用于粮食、环境、生物检测领域。

技术实现要素：

为了提高检测工作效率，提高检测精度，本发明提供一种谷类作物中有机毒素样品净化萃取检测方法，将移液技术、样品净化技术以及超声萃取技术相结合，可以实现在液体移取的同时，完成待测样品的超声萃取过程，大大节省了操作步骤，保证了检测精度。

本发明提供一种谷类作物中有机毒素样品净化萃取检测方法，检测步骤包括：(1)样品提取：取待检样品用提取溶剂定容，振荡提取，收集上清液为样品提取液；(2)样品净化：采用移液枪定量吸取样品提取液，使提取液流经/流过净化材料，继续定量吸取空气，鼓动样品提取液内气泡，使移液枪头内净化材料吸附杂质；(3)振动萃取：采用移液枪超声振动样品提取液，使气泡在净化材料孔隙中与样品提取液破碎混合，使净化材料在气液界面进一步萃取杂质；(3)样品排液：将净化后的样品排出，送至检测设备上机检测；

其中，在步骤(2)中，样品净化步骤包括：①取出枪头，安装于移液枪，将枪头伸入待净化样品液面以下，按下移液枪，使移液枪在枪头内产生负压吸液，吸入1ml待净化样品，使净化样品流经/流过净化样品，停留5s；②将移液枪枪头移出液面，再次按下移液枪，使移液枪内枪头内产生负压吸液，吸入1ml空气，鼓动样品提取液内气泡，使液体与净化材料充分混合，重复此步骤三次，共吸入4ml空气移液枪显示5000ulall满载；③打开移液枪超声换能器，超声振动移液枪内样品提取液及净化材料，④将枪头对准2ml样品瓶，按下移液枪排液，收集净化液上机分析。

其中，在步骤(1)中，提取步骤包括：称取5g谷类作物样品粉碎，过1mm分样筛，于50ml离心管中，用提取液(95wt％乙腈/水)分散定容到20ml，涡旋混匀；超声提取30min，放入离心机(8000r/min离心20min)，取上清液作为样品提取液。所述谷类作物优选为植物类谷类作物，包括玉米、小麦和大米；有机毒素包括玉米赤霉烯酮、展青霉素和呕吐毒素。

其中，在步骤(3)中，通过高效液相色谱(hplc)进行分析，玉米赤霉烯酮检测条件为：

流动相：a相，水；b相，乙腈-甲醇-水(46:8:46，v:v:v)；

等梯度洗脱条件：a，68％；b，32％；

色谱柱：c18柱(柱长250mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)；

流速：1.0ml/min；

柱温：35℃；

进样量：50μl；

荧光检测：激发波长：274nm；发射波长：440nm，光化学柱后衍生。

其中，在步骤(3)中，通过高效液相色谱(hplc-lc-20a)进行分析，展青霉素检测条件为：

流动相：a相，乙腈；b相，乙腈-0.5mm乙酸铵(14:86，v:v)；

等梯度洗脱条件：a，68％；b，32％；

色谱柱：c18柱(柱长250mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)；

流速：0.7ml/min；

柱温：30℃；

进样量：20μl；

荧光检测：激发波长：276nm；发射波长：440nm，光化学柱后衍生。

其中，在步骤(3)中，通过高效液相色谱(hplc-lc-20a)进行分析，呕吐毒素检测条件为：

流动相：甲醇-水(20:80，v:v)；

等梯度洗脱条件：a，68％；b，32％；

色谱柱：c18柱(柱长250mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)；

流速：1.0ml/min；

柱温：35℃；

进样量：50μl；

紫外检测：激发波长：218nm。

净化材料包括但不限于：硅藻土、硫酸镁、石墨化碳黑、磺酸基n-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、羧基n-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、亚甲基哌嗪环n-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、c18改性硅胶、c8改性硅胶、氨丙基键合硅胶、二醇基键合硅胶、弗罗里硅土或氧化铝中的至少一种。

本发明还提供一种适用于上述检测方法的净化萃取移液枪，其包括枪体，枪体包括手柄、超声换能器、吸液按键、排液按键、枪头接口和电池组，超声换能器超声探头与枪头接口相连通，超声换能器分别与吸液按键、排液按键和电池组相电连接，超声换能器优选采用28khz60w超声振子。

有益的技术效果

本发明提供的有机毒素样品净化萃取检测方法，将微量移液技术与样品吸附净化技术相结合，可以实现在微量液体定量移取的同时，借助移液枪内超声装置，使净化材料在提取液与气泡间的气液界面，快速有效萃取杂质成分，并通过超声震碎的微小气泡鼓动，促进净化材料充分混合吸附，完成待测样品的净化过程，大大节省了操作步骤，消除杂质干扰背景，保证了检测精度，并在保证样品回收率的前提下，提高了样品净化速度，检测重复性好。

附图说明

图1为本发明有机毒素净化萃取检测方法所用超声移液枪的结构示意图；

图2为本发明有机毒素净化萃取检测方法所用净化枪头吸取样品示意图；

图3为本发明有机毒素净化萃取检测方法所用净化枪头净化样品示意图。

图4为本发明有机毒素净化萃取检测方法所用净化枪头释放样品示意图。

图5为本发明有机毒素净化萃取检测方法实施例检测谱图：

实施例1图5a有机毒素混标液相色谱图；图5b玉米面阴性样品与阴性加标样品对比图；

实施例2图5c有机毒素混标液相色谱图；图5d小麦阴性样品与阴性加标样品对比图。

实施例3图5e有机毒素混标液相色谱图；图5f玉米面阴性样品液相色谱图；图5g玉米面阴性加标样品对比图。

附图标记：1.超声换能器；2、手柄；3、枪头接口；4、吸液按键；5、排液按键；6、枪头；7、电池组充电接口。

具体实施方式

本发明提供一种谷类作物中有机毒素样品净化萃取检测方法，检测步骤包括：(1)样品提取：取待检样品用提取溶剂定容，振荡提取，收集上清液为样品提取液；(2)样品净化：采用移液枪定量吸取样品提取液，使提取液流经/流过净化材料，继续定量吸取空气，鼓动样品提取液内气泡，使移液枪头内净化材料吸附杂质；(3)振动萃取：采用移液枪超声振动样品提取液，使气泡在净化材料孔隙中与样品提取液破碎混合，使净化材料在气液界面进一步萃取杂质；(3)样品排液：将净化后的样品排出，送至检测设备上机检测；

其中，在步骤(2)中，样品净化步骤包括：①取出枪头，安装于移液枪，将枪头伸入待净化样品液面以下，按下移液枪，使移液枪在枪头内产生负压吸液，吸入1ml待净化样品，使净化样品流经/流过净化样品，停留5s；②将移液枪枪头移出液面，再次按下移液枪，使移液枪内枪头内产生负压吸液，吸入1ml空气，鼓动样品提取液内气泡，使液体与净化材料充分混合，重复此步骤三次，共吸入4ml空气移液枪显示5000ulall满载；③打开移液枪超声换能器，超声振动移液枪内样品提取液及净化材料，④将枪头对准2ml样品瓶，按下移液枪排液，收集净化液上机分析。

其中，在步骤(1)中，提取步骤包括：称取5g谷类作物样品粉碎，过1mm分样筛，于50ml离心管中，用提取液(95wt％乙腈/水)分散定容到25ml，涡旋混匀；超声提取30min，放入离心机(8000r/min离心20min)，取上清液作为样品提取液。所述谷类作物优选为植物类谷类作物，包括玉米、小麦和大米；有机毒素包括玉米赤霉烯酮、展青霉素和呕吐毒素。

其中，在步骤(3)中，通过高效液相色谱(hplc-lc-20a)进行分析，展青霉素检测条件为：

流动相：a相，乙腈；b相，乙腈-0.5mm乙酸铵(14:86，v:v)；

等梯度洗脱条件：a，68％；b，32％；

色谱柱：c18柱(柱长250mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)；

流速：0.7ml/min；

柱温：30℃；

进样量：20μl；

荧光检测：激发波长：276nm；发射波长：440nm，光化学柱后衍生。

其中，在步骤(3)中，通过高效液相色谱(hplc-lc-20a)进行分析，呕吐毒素检测条件为：

流动相：甲醇-水(20:80，v:v)；

等梯度洗脱条件：a，68％；b，32％；

色谱柱：c18柱(柱长250mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)；

流速：1.0ml/min；

柱温：35℃；

进样量：50μl；

紫外检测：激发波长：218nm。

净化材料包括但不限于：硅藻土、硫酸镁、石墨化碳黑、磺酸基n-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、羧基n-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、亚甲基哌嗪环n-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯、c18改性硅胶、c8改性硅胶、氨丙基键合硅胶、二醇基键合硅胶、弗罗里硅土或氧化铝中的至少一种。

本发明还提供一种适用于上述检测方法的净化萃取移液枪，其包括枪体，枪体包括手柄、超声换能器、吸液按键、排液按键、枪头接口和电池组，超声换能器泵气管与枪头接口相连通，超声换能器分别与吸液按键、排液按键和电池组相电连接。

下面根据具体实施例对本发明净化检测实施过程进行阐述：

实施例1

玉米面中玉米赤霉烯酮应用案例

样品提取：

·称取6g玉米面样品，粉碎并过1mm分样筛，加入50ml离心管中，加入0.6g氯化钠和15ml提取液(90％乙腈-水溶液)混匀。

·超声提取30min，放入离心机(8000r/min离心20min)，取上清液作为样品提取液。

·样品净化：

·步骤1：取出枪头，安装于电动移液枪，将枪头伸入待净化液液面以下，按一下电动移液枪吸液按键，吸入1ml待净化液，停留5s。

·步骤2：将移液枪枪头移出液面，再次按一下电动移液枪吸液按键，吸入1ml空气，使液体与填料充分混合，重复此步骤三次，共吸入4ml空气。

·步骤3：打开移液枪超声换能器，超声振动移液枪内样品提取液及净化材料3min，

·步骤4：移液枪显示5000ulall，将枪头对准2ml样品瓶，再次按一下移液枪排液键，进行排液，收集净化液。

·上机分析：将样品净化液送至hplc检测设备上机检测。

hplc检测条件：

流动相：a相，水；b相，乙腈-甲醇-水(46:8:46，v:v:v)；

等梯度洗脱条件：a，68％；b，32％；

色谱柱：c18柱(柱长250mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)；

流速：1.0ml/min；

柱温：35℃；

进样量：50μl；

荧光检测：激发波长：274nm；发射波长：440nm，光化学柱后衍生。

实验结果：

检测结果：图5a玉米赤霉烯酮液相色谱图。其中，玉米赤霉烯酮zon浓度为100ng/ml。

图5b玉米面样品提取液的液相色谱图，其中，zon浓度为218.3ng/g。

表1玉米面样品最低检出限、加标回收率与重复性(zon浓度为218.3ng/g)

*zon为玉米赤霉烯酮的简称

实施例2

小麦中有机毒素应用案例

样品提取：

·称取5g小麦样品，粉碎并过1mm分样筛，加入50ml离心管中，用提取液(乙腈)定容到25ml，涡旋混匀；

·超声提取30min，放入离心机(4000r/min离心10min)，取上清液作为样品提取液。

·样品净化：

·步骤1：取出枪头，安装于电动移液枪，将枪头伸入待净化液液面以下，按一下电动移液枪吸液按键，吸入1ml待净化液，停留5s。

·步骤2：将移液枪枪头移出液面，再次按一下电动移液枪吸液按键，吸入1ml空气，使液体与填料充分混合，重复此步骤三次，共吸入4ml空气。

·步骤3：打开移液枪超声换能器，超声振动移液枪内样品提取液及净化材料5min，

·步骤4：移液枪显示5000ulall，将枪头对准2ml样品瓶，再次按一下移液枪排液键，进行排液，收集净化液。

·步骤5：取2ml净化提取液，氮吹至干，用1ml或0.5ml初始流动相复溶，过微孔滤膜，上机分析。

hplc检测条件：

·流动相：a相，乙腈；b相，乙腈-0.5mm乙酸铵(14:86，v:v)；

·等梯度洗脱条件：a，68％；b，32％；

·色谱柱：c18柱(柱长250mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)；

·流速：0.7ml/min；

·柱温：30℃；

·进样量：20μl；

·荧光检测：激发波长：276nm；发射波长：440nm，光化学柱后衍生。

结果计算：

实验结果：

图5c展青霉素液相色谱图，其中，展青霉素浓度为1μg/ml。

图5d小麦样品提取液液相色谱图，其中，展青霉素检出值为0.09μg/g。

图5e小麦样品提取液加标样品液相色谱图，其中，展青霉素加标浓度为1.05μg/g。

表2小麦样品提取液展青霉素最低检出限、加标回收率与重复性(pat浓度为218.3ng/g)

*pat为玉米赤霉烯酮的简称

实施例3

玉米面中呕吐毒素应用案例

样品提取：

·称取5g玉米面样品，粉碎并过1mm分样筛，加入50ml离心管中，用提取液(84wt％，乙腈/水)定容到25ml，涡旋混匀；

·超声提取30min，放入离心机(8000r/min离心20min)，取上清液作为样品提取液。

·样品净化：

·步骤1：取出枪头，安装于电动移液枪，将枪头伸入待净化液液面以下，按一下电动移液枪吸液按键，吸入1ml待净化液，停留5s。

·步骤2：将移液枪枪头移出液面，再次按一下电动移液枪吸液按键，吸入1ml空气，使液体与填料充分混合，重复此步骤三次，共吸入4ml空气。

·步骤3：打开移液枪超声换能器，超声振动移液枪内样品提取液及净化材料3min，

·步骤4：移液枪显示5000ulall，将枪头对准2ml样品瓶，再次按一下移液枪排液键，进行排液，收集净化液。

·步骤5：取2ml净化提取液，氮吹至干，用1ml或0.5ml初始流动相复溶，过微孔滤膜，上机分析。

hplc检测条件：

流动相：甲醇-水(20:80，v:v)；

等梯度洗脱条件：a，68％；b，32％；

色谱柱：c18柱(柱长250mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm)；

流速：1.0ml/min；

柱温：35℃；

进样量：50μl；

紫外检测：激发波长：218nm。

实验结果：

图5f呕吐毒素液相色谱图，其中，don浓度为1000ng/ml。

图5g玉米面样品提取液液相色谱图，don浓度为900ng/g；

其中，afg1和b1加标浓度为10ng/g；afg2和b2加标浓度为3ng/g。

表2玉米面样品最低检出限、加标回收率与重复性(don浓度为900ng/g)

don为呕吐毒素简称

所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。