本发明涉及遗传性代谢疾病检测领域，更具体地涉及利用气相色谱和质谱串联在相互溶解的情况下检测人血中氨基酸及肉碱定量的检测装置。
背景技术：
遗传代谢病是因维持机体正常代谢所必需的某些由多肽和(或)蛋白组成的酶、受体、载体及膜泵生物合成发生遗传缺陷，即编码这类多肽(蛋白)的基因发生突变而导致的疾病。其包括氨基酸类及肉碱类遗传代谢病。
该类疾病发病后常呈进行性加重，如未能早期识别诊断、干预、治疗，常导致早期夭折或终身残疾，且以神经、智力残疾为最多，会严重影响人口素质，造成家庭和社会的沉重负担。因此开展iem的早期筛查，实现早期诊断，成为iem防治的关键，对避免和减少残疾儿童的发生，提高人口素质，推动国民经济发展有着重要的意义。目前，iem的诊断方法主要有枯草杆菌抑制试验、酶活性测定、气相色谱-质谱联用技术(gc-ms)、单基因分析等。这些诊断方法用于iem筛查具有局限性：(1)普遍通量低，一般一次只能检测一种至几十种，不能满足iem可检出病种的逐年增多，并且需要对遗传性代谢病有准确的预判；(2)不同iem的检测方法各异，且样本多样，如一些疾病检测蛋白水平、而另一些疾病则检测基因水平，有些疾病需要尿液样本、而另一些则需要血液样本。因此不太适合开展大规模的遗传性代谢病的筛查，亟需要一种能高通量检测iem多种疾病的技术。lc-ms/ms技术的发展使得这类疾病在发病前进行干预成为可能。它通过同位素内标对新生儿滤纸干血片样本中的氨基酸、酰基肉碱的浓度进行分析，能在2～3min内对1个标本进行几十种代谢产物分析，通过对这些产物的分析，可以对40种左右遗传性代谢病(包括氨基酸代谢紊乱、有机酸代谢紊乱和脂肪酸代谢紊乱性疾病)进行筛查和诊断，大大提高了检测效率。
然而，现有技术中虽然有一些针对氨基酸、肉碱的检测方法，但是往往存在较大的系统误差(如转移过程中移液器移液偏差造成体积不准确)、检测灵敏度较低，并且难以同时定量检测氨基酸、肉碱。
因此，在本领域中迫切需要一种能够在没有副作用的情况下与人血液中的氨基酸和酰基肉碱互溶从而同时对其进行定量检测的装置。
技术实现要素：
1.要解决的技术问题
鉴于上述内容，本发明所要解决的技术问题包括：1)使血液中的氨基酸和肉碱能够良好地互溶以便于检测；2)能够对溶解的氨基酸和肉碱进行快速、准确的定量检测；3)没有任何其他副作用。
2.技术方案
一方面，针对上述技术问题，本发明提供了一种可与人血中氨基酸及肉碱定量相互溶解免副作用的检测装置，所述检测装置包括：
试剂盒，所述试剂盒设有多个容器孔，每个容器孔分别放置有氨基酸同位素标准品、酰基肉碱同位素标准品、洗脱溶液瓶、衍生化溶液瓶、萃取溶液瓶、复溶解溶液瓶和流动相瓶；
多孔反应板，包括多个反应孔；和
衬垫层，所述衬垫层分别置于所述试剂盒顶部和所述多孔反应板底部；以及
检测装置使用说明书，
其特征在于，所述氨基酸同位素标准品包含选自以下20种氨基酸中的一种或多种：d4-l-精氨酸、d1-l-瓜氨酸、d5-dl-谷氨酸、d2-l-鸟氨酸、d4-l-甲硫氨酸、d5-l-天门冬氨酸、13c-甘氨酸、d4-氨基丁酸、d3-l-丙氨酸、d3-天冬酰胺、d7-羟脯氨酸、d8-赖氨酸、d6-l-缬氨酸、c7-l-苯丙氨酸、d7-脯氨酸、d5-丝氨酸、d13-l-亮氨酸、d5-色氨酸、d3-蛋氨酸、d8-苯基丙氨酸；
所述酰基肉碱同位素标准品包含选自以下12种酰基肉碱中的一种或多种：d2-乙酰基肉碱、d3-棕榈酰肉碱、d3-丁酰基肉碱、d3-己酰肉碱、d3-辛酰基肉碱、d3-月桂酰肉碱、d5-异戊酰基肉碱、d3-肉豆蔻酰肉碱、d3-丙酰基肉碱、d3-癸酰基肉碱、d3-十八酰基肉碱、d3-游离肉碱；
所述洗脱溶液包含组分a：5mm甲酸钠+0.05％甲酸水溶液；和组分b：0.07％甲酸乙腈溶液；
所述衍生化溶液包含异丙醇和丙酰氯，所述萃取溶液包含乙醇和水，所述复溶解溶液含包丁腈和水，所述流动相包含丙二醇、水和甲酸混合物，其中所述丙二醇、水和甲酸的重量比为(25-30):(25-45):(50-25)。
根据前述方面所述的检测装置，所述混合内标物通过所述甲醇溶液制备成混合内标液，其中所述混合内标液中丝氨酸的浓度为100μm，其余氨基酸的浓度为50μm。
根据前述方面所述的检测装置，其还包括质控品，所述质控品为正常人的混合血浆。
3.有益效果
本发明是基于如下发现进行的：在对氨基酸和酰基肉碱进行检测的过程中，本发明人发现，为了有利于氨基酸和酰基肉碱的溶解，在溶解过程中添加合适的醇和酸溶液，能够使各种氨基酸和酰基肉碱快速溶解，从而有利于进一步加快检测过程。基于以上发现，相比于现有技术，本发明的优点在于：
(1)根据本发明的技术方案能够使多种氨基酸和酰基肉碱快速互溶，从而有利于快速检测；
(2)根据本发明的技术方案所需的样品量少，检测精度高；
(3)根据本发明的技术方案避免了检测过程中出现互相干扰、误检率等副作用。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，成功开发了一种高效串联质谱法，所述方法采用特定的质谱检测条件，不仅简化操作，并且可以在一次检测中同时定量检测出多种氨基酸和酰基肉碱，且检测结果的灵敏度高，检测结果准确性高。
1.检测方法
如本文所用，“质谱法”(ms)是指通过它们的质量鉴定化合物的分析技术。ms技术一般包括(1)使化合物电离以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比(m/z)。化合物可通过任何合适的方式电离并检测。“质谱仪”一般包括电离器和离子检测器。
术语“电子电离”如本文所用是指这样的方法，其中气态或蒸汽相中的感兴趣分析物与电子流相互作用。电子与分析物的相互作用产生分析物离子，其然后可用于质谱法技术。
术语“化学电离”如本文所用是指这样的方法，其中试剂气体(例如氨)用于电子碰撞，并且分析物离子通过试剂气体离子与分析物分子相互作用而形成。
2.实验程序
设备、材料和试剂
wateruplc超高效液相色谱仪和quattromicro串联质谱仪均购自美国waters公司。evx-119296孔氮吹仪和自动进样系统购自美国apricotdesigns公司。恒温孵育震荡器得自德国perkinelmer公司。alps热封仪和打孔器购自青岛医疗器械有限公司。
试剂和材料购自英国剑桥同位素实验室新生儿筛查氨基酸同位素标准套装a和肉碱及多种酰基肉碱同位素标准套装b。
本试剂盒的氨基酸同位素标准品包含20种氨基酸，分别为：d4-l-精氨酸、d1-l-瓜氨酸、d5-dl-谷氨酸、d2-l-鸟氨酸、d4-l-甲硫氨酸、d5-l-天门冬氨酸、13c-甘氨酸、d4-氨基丁酸、d3-l-丙氨酸、d3-天冬酰胺、d7-羟脯氨酸、d8-赖氨酸、d6-l-缬氨酸、c7-l-苯丙氨酸、d7-脯氨酸、d5-丝氨酸-、d13-l-亮氨酸、d5-色氨酸、d3-蛋氨酸、d8-苯基丙氨酸。
酰基肉碱同位素标准品包含12种肉碱，分别为：d2-乙酰基肉碱、d3-棕榈酰肉碱、d3-丁酰基肉碱、d3-己酰肉碱、d3-辛酰基肉碱、d3-月桂酰肉碱、d5-异戊酰基肉碱、d3-肉豆蔻酰肉碱、d3-丙酰基肉碱、d3-癸酰基肉碱、d3-十八酰基肉碱、d3-游离肉碱。
美国cdc串联质谱检测多种氨基酸和酰基肉碱新生儿筛查质控品；液相质谱纯级甲醇为上海anpel科学仪器公司cnw；液相质谱纯级水是prolabo(leuven.ec)产品；甲酸98-100％是merck产品(damstadt,germany)。l-谷氨酸、l-天冬氨酸、甘氨酸、l-精氨酸、l-脯氨酸、l-鸟氨酸、l-甲硫氨酸、l-亮氨酸、l-丙氨酸、l-缬氨酸、l-苯丙氨酸、l-酪氨酸均为国药集团化学试剂有限公司产品(层析实验合格)；l-瓜氨酸为sigma-aldrich产品。nunc聚苯乙烯ps透明96孔板和nunc丙烯酸96孔板，聚酯密封贴膜铝箔nunc(thermoscientific)。串联质谱检测多种氨基酸和酰基肉碱新生儿筛查质控品、提取液、转化液、复溶液、96孔蛋白过滤板，96孔深孔板。
典型地，根据本发明的试剂盒的使用方法主要包括以下几个步骤：1.制备内标液；2.制备检测工作液；3.获取样品；4.对样品进行萃取；和5.检测样品。以下将对这些使用方法或步骤进行详细说明。
1.制备内标液：使用1.0ml的萃取液加入氨基酸和肉碱、酰基肉碱内标的冻干粉小瓶中，盖紧瓶盖，震荡，超声，使其中的粉末完全溶解。在溶解困难的情况下，可置37℃烤箱中3分钟后，继续震荡，溶解至彻底。
2.制备检测工作液：将内标液置于室温20分钟；以每孔100μl提取液用量，计算当日测定样本和指控所需的萃取液总量；以体积比108:1:1加入萃取液、氨基酸内标液和酰基肉碱内标液。使工作液稳定24小时。。
3.获取样品：对于新生儿，采血应当于出生72小时、吃足6次奶之后进行。最佳采血时间为哺乳后2小时左右。用75％酒精对婴儿幼足跟进行消毒，然后将三棱针刺入距足跟1-2cm处进行采血。对于成年人，采用指尖取血的方法进行采样。血样采集之后，在室温下干燥至少5小时后装入塑料袋之后封存。然后，用3.0mm直径打孔器分别从质控血片、样本血片上打下血点，放入到上层96孔蛋白过滤板样品盘相应孔中。
4.样品萃取：用15％体积乙醇和85体积％水作为萃取溶液进行萃取。每个qc样品、待测样品分别添加100μl提取液到上层96孔蛋白过滤板的反应孔中，用保护薄膜密封蛋白过滤板，确保密封良好，将挥发量降低到最小；将上层96孔蛋白过滤板、下层样品盘置于30℃的振荡器上，750rpm/min振荡30分钟；揭去密封膜，先将氮气阀打开，检查氮气余量及压力是否正常，将板放置于正压仪上正压3min。
可选地，在检测之前可以对样品进行衍生操作，目的是提高检测的准确性，进一步减少误检的几率。衍生使用包含80体积％异丙醇和20体积％丙酰的衍生化溶液，过程如下：目测u型底微孔板已经吹干，每孔加入50ul的转化液，用纸膜封板；置于振荡器上750rpm/min振荡30min，温度为60℃，避光反应。
之后，取出完全吹干的96孔板，每孔加入100μl的复溶液(85体积％丁腈和15体积％水)，用铝膜包足，恒温振荡，温度设定为27℃，频率为750rpm/min，振荡20分钟。放入质谱自动进样器托盘，供质谱检测。
5.样品检测：流动相包含丙二醇、水和甲酸混合物，丙二醇、水和甲酸的重量比为30:30:40。用移液器每孔移出80μl上清液，顺序置入洁净96孔板。用铝箔密封96孔板。放入质谱自动进样器托盘，供质谱检测，进样20ul，进样速度：0～0.5min为0.15ml/min，0.5～1min为0.025ml/min，1～2min为0.5ml/min。每份样本2min。洗脱溶液包含组分a：5mm甲酸钠+0.05％甲酸水溶液和组分b：0.07％甲酸乙腈溶液，间隔半小时加入。采用串联质谱仪电喷雾阳离子方式。离子源温度120℃，解离温度350℃，喷雾电压3.5kv，氮气5500/h，锥孔气50l/h。多反应监测(mrm)模式收集数据。每个离子对0.05ms依次循环检测离子对，每份样本采集0.3-1.3min时间段的检测信号，叠加信号强度供定量。样本可保存约12小时供质谱检测。
多反应监测扫描模式质谱参数如下：
表1-1多反应监测扫描模式质谱参数
根据本发明所建立的质谱串联检测法可以对多种疾病进行诊断，其中包括氨基酸代谢疾病和酰基肉碱代谢疾病。表1-2为可以检测的疾病种类和对应的代谢标志物。
表1-2疾病种类和对应的代谢标志物
四、定量分析
采用软件chemoview3.0版本，根据同位素内标和各种丁酯化的氨基酸和酰基肉碱的离子峰强度，由已知浓度的内标，根据软件设定程序自动计算出所测样品中各种氨基酸和酰基肉碱的浓度。通过对质控样本氨基酸和酰基肉碱的检测，回收率和精密度达到筛查检测的要求。
以下将参考实施例对本发明进行进一步的示例性说明。本领域的普通技术人员将会理解，提供这些实施例的目的仅仅是为了举例说明本发明的可实施性及根据一些示例所能实现的效果，而无意于以任何目的限制本发明的范围。
实施例1
通过使用根据前述实施方案所述的装置，对浙江省28800余例新生儿血样标本进行检测，累计检测出甲基丙二酸血症/丙酸血症12例，高苯丙氨酸血症8例，枫糖尿症4例，瓜氨酸血症6例等。
实施例2
应用实施例1试剂盒对江西省12000余例新生儿血样标本进行检测。累计检测出苯丙酮尿症患儿6例，丙酸血症患儿3例，枫糖尿症患儿4例。
由此可见，根据本发明的方法能够准确检测出甲基丙二酸败血症、高苯丙氨酸败血症、枫糖尿病、丙酸血症等多种疾病，并且检出率高、抗干扰能力强。
综上所述，本发明的主要优点包括：
本方法用异丙醇在丙酰氯存在的环境下与样品中的氨基酸、肉碱进行衍生化反应，生成相应的衍生物，提高分子量并将氨基酸碎片离子从低分辨率的背景中脱离出来，提高检测的灵敏度，降低检测难度；
实验条件较易控制，采用多孔板处理，提高工作效率。由于采用了同位素内标，与样本中需要检测的氨基酸、肉碱进行平行同步处理，所以色谱行为、质谱的离子化效率和基质效应均能完全一致，避免了系统误差；
使用蛋白过滤板，利用正压仪使提取液流到底层样品盘中，省略样品提取液转移一步，避免了移液器移液偏差造成体积不准确的风险。
以上仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。