一种利用HPLC测定2-碘酰基苯甲酸有关物质的方法与流程

本申请涉及一种利用hplc测定2-碘酰基苯甲酸有关物质的方法，属于以物理或化学方法测定并确定杂环化合物
技术领域：
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背景技术：
：2-碘酰基苯甲酸(ibx)在1893年由hartmann和meyer首次发现，但是因为ibx在大多数有机溶剂和水中非常难溶，而且具有潜在的爆炸特性，对撞击较敏感，该化合物沉寂了几乎一整个世纪。随着后续研究的发展，ibx成为有机合成中选择性氧化醇生成醛酮的一种重要氧化剂，在实验室有机合成中已广泛使用了很多年(参见：mantegazza,simonerazzetti,gabrieleattolino,emanuelevladiskovic,chiara，wo2017037296a1，2017.03.09)。ibx可以通过氧化邻碘苯甲酸来合成，常用氧化剂有溴酸钾(参见：dess,d.b.；martin,j.c.j.am.chem.soc.1991,113,7277.)、过硫酸钾、(2khso5-khso4-k2so4)(参见：marcof.marcos.simonas.j.org.chem.1999,64,4537-4538.),所得ibx产品中易含有原料杂质邻碘苯甲酸以及中间体1-羟基-1,2-苯碘酰-3(1h)-酮(iba)。ibx的纯度决定了其氧化活性的强弱，目前ibx纯度检测方法多用氢核磁法，该方法对ibx纯度要求较高，且测出的含量误差较大。相比而言，hplc法更加经济高效，但是该方法要求分析样品可以制备成均一的溶液，而ibx在大多数有机溶剂和水中非常难溶，仅在dmso试剂中可以溶解，该试剂在已有hplc分析条件下容易出峰且与ibx难分离，为ibx有关物质分析方法的开发带来了一定的困难。x射线晶体衍射分析表明ibx真实的结构可由结构式1a代表，它存在互变异构形式1b，分子内i···o次级键的存在，导致ibx存在聚合结构，这可能就是ibx在所有非反应介质中不溶解的原因(参见：satamv,harada,rajuler,etal.2-iodoxybenzoicacid(ibx):anefficienthypervalentiodinereagent[j].tetrahedron,2010,66(39):7659-7706.)。经研究发现，ibx和碱作用后，可以溶解在水溶液中，2-碘酰基苯甲酸及其杂质邻碘苯甲酸、iba在氢氧化钠溶液中溶解可能存在如式(1)所示反应过程，且水解产物苯环结构完整，具有一定的紫外吸收，同时，杂质iba及邻碘苯甲酸也可以溶解在碱溶液中，这就解决了采用hplc法分析ibx有关物质的瓶颈问题，即样品溶液的制备。能够采用hplc法对有机合成中使用到的ibx进行有关物质分析，对其质量加以控制，具有非常重要的现实意义。技术实现要素：有鉴于此，本申请提供一种高效液相色谱法对ibx有关物质进行分析和测定，该方法可以将ibx和有关杂质进行有效的分离，专属性好，精密度、准确度高，线性范围广，灵敏度高。具体的，本申请采用的技术方案如下：一种利用hplc测定2-碘酰基苯甲酸有关物质的方法，以3mg/ml氢氧化钠溶液作为溶解液，该溶解液通过破坏ibx及iba的非苯环环状结构，将ibx样品溶解形成溶液，克服了ibx在大多数有机溶剂和水中非常难溶的问题，采用宽ph耐受、耐100％水相的水性色谱柱，以0.1％的磷酸溶液与乙腈的混合溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱完毕后，对洗脱液进行hplc测定，即完成有关物质的分离与测定。上述过程可按步骤描述如下：(1)色谱条件：采用agilent1260高效液相色谱仪，选择dad检测器，选用ultimateaq-c18(4.6×250mm，5μm)色谱柱；流动相a为乙腈与0.1％的磷酸溶液的混合溶液(4:96)，流动相b为乙腈；流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为190-400nm，进样量为5μl；(2)样品溶液的配制：将待检测样品用3mg/ml氢氧化钠溶液进行溶解制备样品溶液。(3)分离分析：精密量取样品溶液5μl，注入高效液相色谱仪进行有关物质的分析，记录色谱图。该过程可以将2-碘酰基苯甲酸及其杂质进行分离，有效控制2-碘酰基苯甲酸的质量；该检测方法专属性强、精密度、准确度高，操作简便，可对2-碘酰基苯甲酸有关物质进行快速有效的分析。进一步的，作为优选：所述水性色谱柱选用ultimateaq-c18(4.6×250mm，5μm)、alltimac18(4.6×250mm，5μm)、agilentzorbaxsb-aq(4.6×250mm，5μm)中的任一种，考虑到ibx及其杂质在ultimateaq-c18色谱柱上分离相对较好，优选ultimateaq-c18(4.6×250mm，5μm)。所述宽ph是指ph为1.5-10。所述2-碘酰基苯甲酸为经氢氧化钠溶液破坏后的钠盐。所述梯度洗脱过程中，梯度洗脱时间为0.0-6.0min时，流动相为100％a相；梯度洗脱时间为6.0-12.0min时，a相体积比减小为50％，b相体积比增加为50％；梯度洗脱时间为12.0-25.0min时，a相和b相的比例为体积比50％：50％不变；梯度洗脱时间为25.0-25.1min时，a相体积比增加为100％，b相的体积比减为0；梯度洗脱时间为25.1-30.0min时，流动相保持100％a相不变；梯度洗脱程序运行完后，仪器需后运行5min。所述hplc(高效液相色谱法)的测定条件为：柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测波长为190-400nm，其中，检测波长优选为225nm。本申请的分析方法开发过程如下：仪器：液相色谱仪waters2695带dad检测器；电子天平xs105；色谱柱ultimateaq-c18(4.6×250mm，5μm)。1)分析方法开发样品及杂质(1)2-碘酰基苯甲酸(含量≥97％，上海达瑞精细化学品有限公司，批号180709)；(2)1-羟基-1,2-苯碘酰-3(1h)-酮(iba)(含量98％，上海丹语生物科技有限公司，批号180701)；(3)邻碘苯甲酸(上海皓鸿生物医药科技有限公司，批号la0802008)；(4)分析样品：用3mg/ml氢氧化钠溶液溶解配制成0.5mg/ml的溶液。2)色谱条件的选择a、色谱柱的选择经过对色谱柱ultimateaq-c18(4.6×250mm，5μm)、alltimac18(4.6×250mm，5μm)、agilentzorbaxsb-aq(4.6×250mm，5μm)进行试验，ibx及其杂质在ultimateaq-c18色谱柱上分离相对较好，优选ultimateaq-c18(4.6×250mm，5μm)。b、波长的选择通过峰纯度扫描，确定ibx及其各杂质最大吸收波长均在205-210nm之间，在190-230nm范围内有较强紫外吸收，考虑到溶剂的末端吸收，选择低波长检测时基线噪音较大，故优选波长为225nm。c、流动相的选择通过对流动相乙腈水溶液、甲醇水溶液、含有乙腈的磷酸水溶液，分别采用等度和梯度的方法检测样品进行试验，优选了以下流动相和洗脱梯度：流动相a：乙腈与0.1％的磷酸溶液的混合溶液(体积比4:96)；流动相b：乙腈；梯度洗脱程序采用表1所示参数。表1梯度洗脱程序参数表时间(min)a(％)b(％)0.010006.0100012.0505025.0505025.1100030.01000后运行时间：5min。附图说明图1为本申请2-碘酰基苯甲酸线性图，线性曲线的表达式为y＝ax+b，a＝10.679，b＝-41.27，r2为0.9998。图2为实施例1条件分析2-碘酰基苯甲酸样品1的hplc谱图。图3为实施例1条件分析2-碘酰基苯甲酸样品2的hplc谱图。图4为实施例2条件使用色谱柱alltimac18(4.6×250mm，5μm)分析2-碘酰基苯甲酸样品的hplc谱图。图5为实施例2条件使用色谱柱agilentzorbaxsb-aq(4.6×250mm，5μm)分析2-碘酰基苯甲酸样品的hplc谱图。图6为实施例2条件使用色谱柱ultimateaq-c18(4.6×250mm，5μm)分析2-碘酰基苯甲酸样品的hplc谱图。图7为实施例3条件分析2-碘酰基苯甲酸样品的hplc谱图。具体实施方式以下案例对本申请的测定方法进行了验证：1、试剂和样品、对照品：(1)乙腈：色谱纯；(2)磷酸、氢氧化钠：分析纯；(3)2-碘酰基苯甲酸样品；(4)2-碘酰基苯甲酸杂质邻碘苯甲酸、1-羟基-1,2-苯碘酰-3(1h)-酮(iba)对照品。2、仪器设备十万分之一电子天平xs105，高效液相色谱仪agilent1260带有dad检测器。3、色谱条件色谱柱：ultimateaq-c18(4.6×250mm，5μm)；流动相a：0.1％磷酸溶液(取磷酸1ml加水稀释至1000ml)：乙腈＝96:4；流动相b：乙腈；流速：1.0ml/min；波长：225nm；柱温：30℃；进样体积：5μl；溶解液：3mg/ml氢氧化钠溶液；梯度洗脱程序采用表1参数；后运行时间：5min。验证结果如下：1、专属性取2-碘酰基苯甲酸溶液(0.5mg/ml)、邻碘苯甲酸溶液(0.5mg/ml)、1-羟基-1,2-苯碘酰-3(1h)-酮(iba)溶液(0.5mg/ml)、混合溶液(2-碘酰基苯甲酸0.5mg/ml、邻碘苯甲酸10μg/ml、iba50μg/ml)各5μl按上述色谱条件(dad检测器190-400nm扫描)进入色谱系统，记录色谱图，结果如表2所示。表2为2-碘酰基苯甲酸的专属性测试结果结论：在该色谱条件下，空白无干扰，各杂质可以有效检出，且与主峰完全分离，方法专属性符合要求。2、强力降解实验采用高温、光照、酸、碱破坏对ibx进行强降解实验，研究ibx降解途径和潜在的杂质，考察ibx是否有降解，产品内在质量是否发生明显变化，降解物与主峰分离度能否符合要求，有关物质检测方法专属性是否满足要求。①未破坏样品取ibx25.61mg至50ml容量瓶中，用溶解液溶解稀释并定容至刻度，摇匀，取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。②高温破坏实验空白试验：取在80℃油浴条件下加热4h后的溶解液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。液体高温破坏：称取样品25.26mg至50ml容量瓶中，用溶解液溶解稀释并定容至刻度，摇匀，在80℃油浴条件下加热4h，放置冷却至室温，取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。固体高温破坏：取适量样品在105℃烘箱中烘24h，取烘过的样品25.30mg至50ml容量瓶中，用溶解液溶解稀释至刻度，摇匀备用，取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。③光照破坏实验空白溶液：取在太阳光下放置24h的溶解液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。液体光照破坏：称取25.25mg样品至50ml容量瓶中，用溶解液溶解稀释至刻度，摇匀；在太阳光下放置24h，取放置后的溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。固体光照破坏：取适量样品在太阳光下放置24h后，称取25.53mg样品至50ml容量瓶中，用溶解液溶解稀释至刻度，摇匀；取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。④酸破坏降解实验空白溶液：取1mol/l的盐酸溶液1.0ml至50ml容量瓶中，在常温下放置4h，加1mol/l氢氧化钠溶液1.0ml中和后，用溶解液定容至刻度，摇匀；取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。酸破坏溶液：称取25.21mg样品至50ml容量瓶中，加入1mol/l盐酸溶液1.0ml，在常温下放置4h，加1mol/l氢氧化钠溶液1.0ml中和后，用溶解液稀释至刻度，摇匀；取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。⑤碱破坏降解实验空白溶液：取1mol/l的氢氧化钠溶液1.0ml至50ml容量瓶中，在常温下放置4h，加1mol/l盐酸溶液1.0ml中和后，用溶解液稀释定容至刻度，摇匀。取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。碱破坏溶液：取25.30mg样品至50ml容量瓶中，加入1mol/l氢氧化钠溶液1.0ml，在常温下放置4h，加1mol/l盐酸溶液1.0ml中和后，用溶解液稀释至刻度，摇匀；取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。将上述各溶液进行峰纯度扫描，查看各条件下是否有降解产物产生，是否影响主峰峰纯度。计算各破坏条件下的回收率，要求回收率在80-120％范围内。物料平衡(massbalance)计算公式:物料平衡＝(a破坏总峰面积/c破坏)/(a未破坏总峰面积/c未破坏)分析结果见表3。表3为ibx的强力降解实验结果表结论：ibx在高温、光照、强酸、强碱破坏条件下均有一定程度的降解，尤其是在强酸、强碱条件下，降解明显，有较多的杂质生成，在高温、光照条件下，液体样品比固体样品更容易降解产生其他杂质，在各降解条件下杂质峰均与主峰完全分离，且主峰纯度＞995.0，证明主峰中不包含其余杂质，物料平衡(％)在80％-120％范围内，该方法专属性符合要求，适用于ibx有关物质的分析检测。强力降解实验提示ibx在储存时要注意避免与酸、碱物质接触，避光常温保存。3、稳定性试验①供试品溶液：精密称取ibx样品25.23mg到50ml容量瓶中，加溶解液溶解并稀释至刻度，摇匀后备用。②杂质贮备液：分别精密称取5.04mg杂质a、25.14mg杂质b置50ml量瓶中，加溶解液溶解稀释至刻度，制成每1ml中约含0.1mg杂质a、0.5mg杂质b的溶液，摇匀，得杂质贮备液。③系统适用性溶液：精密称取ibx约25.46mg置50ml量瓶中，精密加入杂质贮备液5.0ml，加溶解液溶解稀释至刻度，摇匀，得系统适用性溶液。④2％自身对照溶液：精密移取供试品溶液1.0ml到50ml容量瓶中，加溶解液稀释至刻度，摇匀后备用。取溶液①、③、④放置0、3、6、9、12、15、19、22、24小时取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，考察系统适用性溶液、供试品溶液中主峰及各杂质峰峰面积、色谱纯度的稳定性，rsd值≤10％，2％自身对照溶液中主峰峰面积的稳定性，rsd值≤10％。分析结果见附表4：系统适用性溶液稳定性，附表:5：供试品溶液稳定性，参见表6：自身对照溶液稳定性。表4为系统适用性溶液稳定性表5为供试品溶液稳定性表6为自身对照溶液稳定性时间(h)色谱图编号峰面积峰面积rsd(％)019022105104.57/319022110104.800.11619022115105.300.29919022120105.750.431219022125105.540.421519022131105.790.44191902213889.515.38221902214390.656.51241902214691.826.90相关结论如下：系统适用性溶液中ibx、iba、邻碘苯甲酸在24h内的峰面积rsd、色谱纯度rsd均未超过10％，系统适用性溶液在24h内稳定。从供试品溶液的稳定性来看，主峰峰面积及色谱纯度rsd在24h内均小于10％，但杂质邻碘苯甲酸的峰面积rsd和色谱纯度rsd在15h内均小于10％，在19h时大于10％，杂质iba的峰面积rsd及色谱纯度rsd在24h内均未超过10％。从主峰及各杂质峰面积变化情况来看，应是供试品溶液放置19h后，ibx降解产生了杂质iba和邻碘苯甲酸，供试品溶液在15h内稳定，其有关物质的分析检测应在15h内完成。从自身对照溶液的稳定性来看，在15h内主峰峰面积的rsd值均小于0.44％，符合规定，但19h时，峰面积有较大的变化，明显减少。提示自身对照溶液在15h内稳定。4、检测限、定量限、线性和范围、校正因子取2-碘酰基苯甲酸(ibx)250.00mg、邻碘苯甲酸250.63mg、1-羟基-1,2-苯碘酰-3(1h)-酮(iba)250.58mg置50ml容量瓶中，用溶解液溶解并定容至刻度，摇匀，配制线性贮备液，采用逐级稀释法配制0.025-600μg/ml的溶液，按上述色谱条件精密量取各溶液5μl注入液相色谱仪，每个浓度重复进样3次，记录色谱图，分析结果如表7所示。表7为2-碘酰基苯甲酸及其杂质的检测限、定量限结论：ibx在浓度为0.05μg/ml、0.2μg/ml时，信噪比分别为3.23，12.46，0.05μg/ml即为ibx的检测限浓度，在该浓度可有效检出ibx；0.2μg/ml为ibx的定量限浓度，在该浓度可定量检测ibx。杂质邻碘苯甲酸在浓度为0.025μg/ml、0.10μg/ml时，信噪比分别为4.38，16.15，即为杂质邻碘苯甲酸的检测限、定量限；杂质iba在浓度为0.025μg/ml、0.10μg/ml时，信噪比分别为5.31，19.15，即为杂质iba的检测限、定量限。表8为2-碘酰基苯甲酸(线性及范围)线性图见图1。结论：ibx在0.2μg/ml-600μg/ml浓度范围内，其峰面积与浓度呈线性关系，线性方程为y＝10.679x-41.27，线性相关系数r2＝0.9998。5、重复性平行配制2-碘酰基苯甲酸溶液6份(0.5mg/ml)，杂质邻碘苯甲酸、iba的定量限浓度溶液6份(邻碘苯甲酸浓度0.1μg/ml，iba浓度0.1μg/ml)，限度浓度溶液6份(邻碘苯甲酸浓度10μg/ml，iba浓度50μg/ml)，按上述色谱条件精密量取各溶液5μl注入液相色谱仪，每份溶液进样一次，记录色谱图，分析结果如表9。表9为2-碘酰基苯甲酸溶液中ibx的重复性表10为2-碘酰基苯甲酸溶液中杂质a、b的重复性表11为2-碘酰基苯甲酸各杂质的定量限重复性表12为2-碘酰基苯甲酸各杂质的限度重复性结论：2-碘酰基苯甲酸溶液重复性符合要求、杂质邻碘苯甲酸、iba的定量限、限度重复性符合要求，rsd均小于10％。6、准确度、精密度溶液配制：(1)杂质贮备液：分别精密称取25.54mg邻碘苯甲酸、125.36mgiba置50ml量瓶中，加溶解液溶解稀释至刻度，摇匀，移取该溶液20.0ml至200ml容量瓶中，加溶解液稀释至刻度，摇匀即得，邻碘苯甲酸浓度51.08μg/ml，iba浓度250.72μg/ml。(2)系统适用性溶液：精密称取ibx25.59mg置50ml量瓶中，精密加入杂质贮备液10.0ml，加溶解液稀释至刻度，摇匀，得系统适用性溶液。(3)供试品溶液：称取ibx25.27mg置50ml量瓶中，加溶解液溶解并稀释至刻度，制成0.5mg/ml的溶液(溶液不稳定，临用前现配)。(4)2％自身对照溶液：精密移取供试品溶液1.0ml至50ml容量瓶中，加溶解液稀释至刻度，摇匀后备用。(5)对照品溶液：取10.0ml杂质贮备液至50ml容量瓶中，加溶解液稀释定容至刻度，摇匀。(6)50％回收率溶液：分别称取25.19mg、25.15mg、25.10mgibx至3个50ml容量瓶中，均加入5.0ml杂质贮备液，加溶解液溶解稀释定容至刻度，摇匀，平行配制3份溶液。(7)100％回收率溶液：分别称取25.35mg、25.36mg、25.37mgibx至3个50ml容量瓶中，均加入10.0ml杂质贮备液，加溶解液溶解稀释定容至刻度，摇匀，平行配制3份溶液。(8)150％回收率溶液：分别称取25.36mg、25.40mg、25.42mgibx至3个50ml容量瓶中，均加入15.0ml杂质贮备液，加溶解液溶解稀释定容至刻度，摇匀，平行配制3份溶液。分别取上述溶液各5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。溶液(3)、(4)、(6)、(7)、(8)每个溶液重复进样3次，溶液(5)重复进样6次，按外标法进行计算回收率，要求回收率在90％-108％之间，各杂质回收率的rsd值小于10.0％。计算公式：回收率(％)＝(测得量-本底量)/加入量*100％表13为邻碘苯甲酸回收率表14为iba回收率结论：杂质邻碘苯甲酸、iba回收率均在90％-108％之间，且回收率rsd<10％，符合规定，准确度好。取准确度项下空白溶液、50％回收率溶液、100％回收率溶液、150％回收率溶液检测结果作为精密度实验的检测结果，记录色谱图。要求精密度实验项下杂质a、b响应值的rsd值均不得大于10％。表15为杂质邻碘苯甲酸精密度分析结果表16为杂质iba精密度分析结果结论：杂质邻碘苯甲酸、iba响应值的rsd值小于10％，其精密度符合要求。实施例12-碘酰基苯甲酸样品由浙江国邦药业有限公司实验室合成制得，相关反应方程式及操作步骤如下：样品1：500ml四口烧瓶中加入2-碘苯甲酸(30.0克，0.12摩尔)，硫酸溶液(260毫升，0.73m)，搅拌下缓慢升温至40℃，分批加入溴酸钾(26.7克，0.16摩尔)，加料期间控制内温不超过55℃，加完后升温至65-70℃,保温4小时后逐渐降温至0-5℃，过滤，滤饼用500毫升去离子水洗涤，50毫升丙酮洗涤，40℃真空干燥，得白色固体28.0克，收率82.8％，取少量样品用于hplc分析，参见图2所示。样品2：向1000ml三口烧瓶中加入2-碘苯甲酸(50.0g，0.20mol)，硫酸溶液(450ml，0.73m或1.10m或1.40m)，搅拌均匀后，加入过硫酸钾(70g，或80g，或90g或100g，0.26mol或0.30mol或者0.33mol或者0.37mol)，20min内将混合物温热至50℃左右,再加入过硫酸钾(70g，或80g，或90g或100g，0.26mol或0.30mol或者0.33mol或者0.37mol),加完后升温至70℃左右，在此温度下搅拌4或6小时。然后冷却至0-5℃并在此温度下缓慢搅拌2小时。过滤，所得固体用水(600ml)和丙酮(600ml)洗涤，40℃真空干燥24h。得白色固体49.38到50.83克，收率88.2％到90.8％，取少量固体样品用于hplc分析，参见图3所示。分析方法如下：仪器：高效液相色谱仪waters2695，dad检测器；色谱柱：alltimac18(4.6×250mm，5μm)；流动相a：0.1％磷酸溶液(取磷酸1ml加水稀释至1000ml)：乙腈＝96:4；流动相b：乙腈；流速：1.0ml/min；波长：225nm；柱温：30℃；进样体积：5μl；溶解液：2.5mg/ml氢氧化钠溶液；梯度洗脱程序与表1一致。溶液配制及实验：称取5mg样品放入取样瓶中，移取2ml2.5mg/ml氢氧化钠溶液使其在超声条件下溶解，用流动相a稀释至10ml，摇匀后过滤。精密量取5μl溶解液、样品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。样品1hplc分析色谱图见图2，ibx在3.482min出峰，色谱纯度为91.22％，理论塔板数为10102，有关物质iba在12.449min出峰，邻碘苯甲酸在16.765min出峰，分离度均大于1.5。样品2hplc分析色谱图见图3，ibx在3.490min出峰，色谱纯度为93.40％，理论塔板数为10690，有关物质iba及邻碘苯甲酸分别在12.464min、16.782min出峰，分离度均大于1.5。实施例2分析样品购自上海达瑞精细化学品有限公司，批号180709。仪器：高效液相色谱仪waters2695，dad检测器；流动相a：0.1％磷酸溶液(取磷酸1ml加水稀释至1000ml)：乙腈＝96:4；流动相b：乙腈；流速：1.0ml/min；波长：225nm；柱温：30℃；进样体积：5μl；溶解液：2.5mg/ml氢氧化钠溶液；梯度洗脱程序与表1一致。溶液配制及实验称取5mg样品放入取样瓶中，移取2ml2.5mg/ml氢氧化钠溶液使其在超声条件下溶解，用流动相a稀释至10ml，摇匀后过滤。精密量取5μl溶解液、样品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。使用色谱柱alltimac18(4.6×250mm，5μm)分析样品时，谱图见图4，有拖尾现象，主峰拖尾因子1.6527，理论塔板数10608，使用agilentzorbaxsb-aq(4.6×250mm，5μm)分析样品时，拖尾因子为1.4402，但理论塔板数偏低，为535，谱图见图5；使用ultimateaq-c18(4.6×250mm，5μm)分析样品，拖尾因子为0.9266，理论塔板数为13442，谱图见图6，综合来看，优选型号为ultimateaq-c18(4.6×250mm，5μm)色谱柱对样品进行分析。实施例32-碘酰基苯甲酸样品由实验室合成制得。仪器：高效液相色谱仪agilent1260，dad检测器；色谱柱：ultimateaq-c18(4.6×250mm，5μm)；流动相a：0.1％磷酸溶液(取磷酸1ml加水稀释至1000ml)：乙腈＝96:4；流动相b：乙腈；流速：1.0ml/min；波长：225nm；柱温：30℃；进样体积：5μl；溶解液：3mg/ml氢氧化钠溶液；梯度洗脱程序与表1一致。试验步骤：溶液配制及试验(1)杂质贮备液：分别精密称取4.98mg杂质邻碘苯甲酸、25.66mg杂质iba置50ml量瓶中，加溶解液溶解稀释至刻度，制成每1ml中约含0.1mg杂质邻碘苯甲酸、0.5mg杂质iba的溶液，摇匀，得杂质贮备液。(2)系统适用性溶液：精密称取ibx25.33mg置50ml量瓶中，精密加入杂质贮备液5ml，加溶解液稀释至刻度，摇匀，得系统适用性溶液。(3)供试品溶液：称取ibx待分析样品25.35mg置50ml量瓶中，加溶解液溶解并稀释至刻度，制成0.5mg/ml的溶液(溶液不稳定，临用前现配)。精密量取5μl溶解液、系统适用性溶液、供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。图7中保留时间4.443min的峰为2-碘酰基苯甲酸，理论塔板数为2714，色谱纯度为96.28％，保留时间12.847min的峰为其杂质iba，分离度为38.59，保留时间16.929min的峰为杂质邻碘苯甲酸，分离度33.48。该色谱条件可以有效检出2-碘酰基苯甲酸中原料杂质邻碘苯甲酸及中间体杂质iba，分离度好，可以有效控制ibx的质量。当前第1页12