一种基于胶体金光热效应的免疫层析毛细管及其应用的制作方法

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种基于胶体金光热效应的免疫层析毛细管及其应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

沙门氏菌，属肠杆菌科，是一种兼性厌氧的革兰氏阴性菌。由于沙门氏菌不属于腐败菌，食品受污染难以被肉眼察觉，人食用后主要表现为食物中毒症状，即呕吐和腹泻，因此沙门氏菌被认为是引起食源性疾病的主要原因之一，在细菌性食物中毒中位列榜首。

目前，沙门氏菌的检测方法主要有传统检测方法和快速检测方法。传统检测方法需要经过前增菌、增菌、分离培养，对分离培养的菌落进行生化试验及血清学鉴定以确定菌型等步骤，虽然检测结果准确可靠，上述方法操作步骤复杂，检测时间长，难以满足快速检测食品中沙门氏菌的需要。快速检测方法包括荧光免疫分析法、酶联免疫吸附测定法和免疫层析技术等，其中，免疫层析技术近年来取得长足的发展，但发明人发现，目前的免疫层析技术的固相载体以硝酸纤维素膜为主，其生产工艺复杂，点样环境等易对样品与膜的结合产生影响，又易碎易折，容易使结果出现显色不均、拖带等现象。

技术实现要素：

基于上述现有技术的不足，本发明提供一种基于胶体金光热效应的免疫层析毛细管及其应用。本发明利用玻璃毛细管为载体，胶体金为示踪物，依据双抗夹心原理组建基于胶体金光热效应的沙门氏菌免疫层析毛细管检测方法，该方法以玻璃作为固相载体，耐高温和高离子强度，更加稳定，不易折损，不易受外界影响，且廉价易得，以胶体金为示踪物构建胶体金免疫层析毛细管，能够快速地实现样品中沙门氏菌的视觉检测；同时利用胶体金优异的光热转换性能，通过激光照射获得温度变化值，利用免疫层析毛细管实现对沙门氏菌的定量灵敏检测，因此具有良好的实际应用之价值。

本发明的第一个方面，提供一种免疫层析毛细管，所述免疫层析毛细管的制备方法如下：

s1、玻璃毛细管的修饰：

对玻璃毛细管进行洗涤、活化预处理，并使用修饰液通过共价结合使玻璃毛细管内壁具有稳定的可以连接目标识别材料的活性基团；

s2、免疫层析毛细管的组装：

基于双抗夹心法，分别将一抗和二抗连接在玻璃毛细管内壁的检测区和质控区，使用封闭液封闭未连接一抗和二抗的非特异性位点。

本发明的第二个方面，提供上述免疫层析毛细管在沙门氏菌检测中的应用；所述应用包括对沙门氏菌的定性检测和半定量检测。

其中，所述半定量检测具体为检测时引入的金标抗体，基于胶体金的光热效应进行半定量检测。

本发明的第三个方面，提供一种基于上述免疫层析毛细管的沙门氏菌检测方法，所述检测方法包括：

将待测样品液与金标抗体混合，注入免疫层析毛细管的检测区，孵育处理；

排出回收金标抗体，观察检测区显色情况，用于定性检测；

检测照射前后温度并记算温差，用于半定量检测。

本发明的有益技术效果：

本发明利用玻璃毛细管为载体，胶体金为示踪物，依据双抗夹心原理组建基于胶体金光热效应的沙门氏菌免疫层析毛细管检测方法，该方法以玻璃作为固相载体，耐高温和高离子强度，更加稳定，不易折损，不易受外界影响，且廉价易得，以胶体金为示踪物构建胶体金免疫层析毛细管，能够快速地实现样品中沙门氏菌的视觉检测；同时利用胶体金优异的光热转换性能，通过激光照射获得温度变化值，利用免疫层析毛细管实现对沙门氏菌的定量灵敏检测。

本发明在胶体金免疫层析基础上，以玻璃毛细管为载体，胶体金为标记物，利用双抗夹心原理组装免疫层析毛细管，并通过胶体金的光热效应实现对沙门氏菌的快速、定量灵敏检测，视觉检测限为5×10⁵cfu·ml^-1，光热检测限为1×10⁵cfu·ml^-1，利用胶体金的光热效应将灵敏度较视觉检测限提高5倍以上，与沙门氏菌其他检测方法相比具有方便快捷，适合现场检测，灵敏度高和稳定性好等诸多优点，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1鼠伤寒沙门氏菌免疫层析毛细管检测原理图。

图2为本发明实施例1鼠伤寒沙门氏菌免疫层析毛细管修饰和组装原理图。

图3为本发明实施例1胶体金光热效应用于免疫层析毛细管对鼠伤寒沙门氏菌标准液的定量检测示意图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，传统检测方法需要经过前增菌、增菌、分离培养，对分离培养的菌落进行生化试验及血清学鉴定以确定菌型等步骤，虽然检测结果准确可靠，但发明人发现，上述方法操作步骤复杂，检测时间长，难以满足快速检测食品中沙门氏菌的需要。快速检测方法包括荧光免疫分析法、酶联免疫吸附测定法和免疫层析技术等，虽然检测速度有所提高，单纯每一种方法都存在一定的缺点。

有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种免疫层析毛细管，所述免疫层析毛细管的制备方法如下：

玻璃毛细管的修饰：

玻璃毛细管经预处理除去表面的灰尘及杂质，同时活化毛细管壁上的羟基，然后使用氨基硅烷溶液进行修饰；

将经过预处理的玻璃毛细管浸入甲醇作为有机溶剂的3-氨丙基三乙氧基硅烷的修饰液中，通过共价结合使烷基偶联剂固定在玻璃毛细管内壁上，烷基偶联剂末端含有氨基，连接抗体；

本发明的又一具体实施方式中，所述预处理方法为：将玻璃毛细管经强酸、强碱清洗，并高温干燥，高温干燥具体条件为：温度控制为200～300℃，时间控制为0.5～1h。经过高温干燥步骤后可以使活化后的羟基更稳固。

本发明的又一具体实施方式中，所述甲醇浓度控制为10％～20％，优选为15％；

免疫层析毛细管的组装：

将修饰后的玻璃毛细管一端作为检测区，注入一抗，将玻璃毛细管直立于酶标板孔中，将剩余液体排出，检测区浸入pbst缓冲液中，抽动清洗；

在玻璃毛细管另一端注入二抗作为质控区；将检测区和质控区都固定好的玻璃毛细管浸于脱脂牛奶中，以封闭非特异性位点，然后浸于pbst缓冲液中，抽动清洗。

本发明的又一具体实施方式中，一抗注入浓度控制为0.2～0.4mg·ml^-1(优选0.3mg·ml^-1)；二抗注入浓度控制为0.1～0.3mg·ml^-1(优选0.2mg·ml^-1)；通过控制注入抗体浓度，使得待测物与抗体结合显色，同时激发胶体金光热转换性能。

本发明的又一具体实施方式中，将检测区和质控区都固定好的玻璃毛细管在37℃下浸于4～6％(优选为5％，w/v)的脱脂牛奶中1.5～3h(优选为2h)，以封闭非特异性位点。

目前的免疫层析技术的固相载体以硝酸纤维素膜为主，但其生产工艺复杂，点样环境等易对样品与膜的结合产生影响，又易碎易折，容易使结果出现显色不均、拖带等现象。采用玻璃作为载体可避免上述问题出现，首先玻璃基底可耐高温和高离子强度，更加稳定，不易折损，不易受外界影响，其次玻璃材质表面均一光滑、透光性好，使得实验结果易于观察；再者玻璃价廉易得，生产技术成熟，玻璃毛细管体积小方便携带。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述免疫层析毛细管在沙门氏菌检测中的应用。所述应用包括对沙门氏菌的定性检测和半定量检测。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种沙门氏菌的检测方法，所述检测方法包括：

将待测样品液与金标抗体混合，注入免疫层析毛细管的检测区，孵育处理；

排出回收金标抗体，观察检测区显色情况，用于定性检测；

检测照射前后温度并记算温差，用于定量检测。

本发明的又一具体实施方式中，进行定量检测时，使用532nm绿色激光照射毛细管检测线区域10～100s(优选为50s)。

目前光热效应在医疗诊断、治疗等多领域都发挥作用，其应用价值极高，胶体金等纳米金均具有良好的光热效应，其机理为：根据吸收光谱，胶体金在532nm的绿光处有较高的吸收峰，经照射后，电子发生能级跃迁现象，产生等离子共振效应，这种效应导致光能转化为热能，产生温度差。本发明以玻璃毛细管为载体，用双抗夹心法原理，以胶体金为示踪物构建胶体金免疫层析毛细管，能够快速地实现样品中沙门氏菌的视觉检测；同时利用胶体金优异的光热转换性能，通过激光照射获得温度变化值，利用免疫层析毛细管实现对沙门氏菌的定量灵敏检测。

本发明的又一具体实施方式中，进行定量检测时，毛细管放置的基底材料可选自纸质、玻璃、吸水垫、塑料；优选为吸水垫；其对实验结果的干扰较小，有利于实验组与对照组之间形成较大温差。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

本实施例具体实验原理如图1所示，在毛细管一端固定沙门氏菌一抗作为检测区，在另一端固定二抗作为质控区，将样品液与金标沙门氏菌抗体复合物混合，注入检测区，若含有沙门氏菌，则与一抗发生特异性结合反应，按照双抗夹心原理，形成金标抗体-沙门氏菌-一抗复合物，得到显红色的直观性现象，剩余的金标抗体经过质控区与相应的二抗发生特异性结合反应，毛细管呈现两端显色。若样品中无沙门氏菌，则检测区不显色，质控区显色。通过肉眼观察实现沙门氏菌定性检测，利用检测区胶体金的光热转换性能实现定量灵敏检测。

制备和检测方法如下：

(1)玻璃毛细管的修饰方法

玻璃毛细管经过强酸、强碱的清洗，除去表面的灰尘及杂质，同时活化毛细管壁上的羟基，高温干燥使活化后的羟基更稳固。将经过预处理的玻璃毛细管浸入浓度为15％的甲醇作为有机溶剂的3-氨丙基三乙氧基硅烷的修饰液中，通过共价结合使烷基偶联剂固定在玻璃毛细管内壁上，烷基偶联剂末端含有氨基，可以连接抗体。

(2)免疫层析毛细管的组装方法

将修饰后的玻璃毛细管一端作为检测区，注入3μl0.3mg·ml^-1一抗，在25℃的环境中，将玻璃毛细管直立于酶标板孔中2.5h。将剩余液体排出，检测区浸入pbst缓冲液中，抽动清洗三次，每次3min。在玻璃毛细管另一端注入3μl0.2mg·ml^-1二抗作为质控区。将检测区和质控区都固定好的玻璃毛细管在37℃下浸与5％的脱脂牛奶中2h，以封闭非特异性位点，然后浸于pbst缓冲液中，抽动清洗三次，每次3min，于4℃储存备用。

(3)沙门氏菌的培养方法

取沙门氏菌单菌落，将其置于lb培养基上进行培养，培养温度为37℃，待菌生长到对数生长期时收集然后进行前处理。取菌液1ml，进行梯度稀释，然后取25μl各稀释度菌液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃培养16h后计数。在使用菌液前先处理沙门氏菌，以降低培养基对实验的干扰，在1.5ml离心管中加入少量菌液，6000rpm离心5min，去上清液，用pbs溶液溶解沉淀，再离心，重复上述步骤3次，再用pbs溶液溶解沉淀，以备使用。

(4)免疫层析毛细管对沙门氏菌的检测方法

取前处理后的菌液与金标抗体稀释液以1：1的比例混合，用移液枪移取3μl上述混合液注入免疫层析毛细管的检测区，于37℃直立于酶标板孔中10min，然后排出回收金标抗体，用pbst抽动清洗3min重复清洗3次，观察检测区显色情况，之后进行光热检测，用热像仪记录照射前后温度并记算温差。

(5)对毛细管光热转换影响因素的探究方法

组装并调试设备，固定好照射距离，用532nm绿色激光分别照射置于纸质、玻璃、吸水垫、塑料上的毛细管检测线，用秒表计时保证照射时间相同，将照射前后的温度记录下来并计算温度差，每种基底材料进行三次重复实验，计算温差平均值，同时设置空白对照组，结果显示，50s时，纸质上的空毛细管与组装好的毛细管的前后温度差分别为18.7℃与14.02℃，吸水垫上的空毛细管与组装好的毛细管的前后温度差分别为6.074℃与12.006℃，玻璃上的空毛细管与组装好的毛细管的前后温度差分别为1.013℃与1.467℃，塑料上的空毛细管与组装好的毛细管的前后温度差分别为6.466℃与5.527℃，可以看出纸质、玻璃、塑料上组转好的毛细管与空毛细管在50s时的温度差相差不大，而吸水垫上组装好的毛细管与空毛细管的温度差可明显看出区别，说明纸质、玻璃、塑料较吸水垫对实验结果的干扰较大，吸水垫为最佳基底材料。随着激光开始照射，温度一直呈上升趋势，纸质、吸水垫、玻璃和塑料上的毛细管，在50s之前，温差逐渐增大，而在50s之后，温度差又逐渐缩小，证明50s为最佳照射时间。

(6)沙门氏菌的视觉检测限与光热检测限的确定方法

根据双抗夹心原理，一抗与沙门氏菌与金标抗体在检测区结合呈现红色，并且红色程度与沙门氏菌浓度成正比，随着沙门氏菌浓度降低，毛细管检测区红色逐渐降低，当沙门氏菌浓度为5×10⁵cfu·ml^-1时，检测区的显色仍可通过肉眼观测出，但到达下一个稀释度时，肉眼已分辨不出对应毛细管检测区颜色与空白组检测区颜色区别，定义5×10⁵cfu·ml^-1为视觉检测限。将免疫层析毛细管空白样品的3倍空白标准偏差0.24℃定义为此方法的检测限。用热像仪记录各毛细管的检测区温度，发现1×10⁵cfu·ml^-1时与空白毛细管的温度差为0.4℃，定义1×10⁵cfu·ml^-1为光热检测限，利用胶体金光热效应将灵敏度较视觉检测限提高5倍以上。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。