维生素E含量的高效液相色谱检测方法与流程

本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种维生素e含量的高效液相色谱检测方法，属于分析化学技术领域。

背景技术：

维生素e(vitamine)是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是最主要的抗氧化剂之一。维生素e能促进生殖，提高生育能力，预防流产。其他功能方面还有保护t淋巴细胞、保护红细胞、抗自由基氧化、抑制血小板聚集从而降低心肌梗死和脑梗塞的危险性。还对烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容等方面有很好的疗效。还发现维生素e可抑制眼睛晶状体内的过氧化脂反应，使末梢血管扩张，改善血液循环。维生素e可有效对抗自由基，抑制过氧化脂质生成，祛除黄褐斑；抑制酪氨酸酶的活性，从而减少黑色素生成。酯化形式的维生素e还能消除由紫外线、空气污染等外界因素造成的过多的氧自由基，起到延缓光老化、预防晒伤和抑制日晒红斑生成等作用。

在已知的维生素e含量的测定方法中，主要是气相色谱法，但气相色谱法分析存在很多局限性，首先检测过程比较繁琐，需内标物，其次很多液体制剂以及多组分制剂中ve含量也很难得到很好的分离检测。为了解决这一难题，本发明简化检测过程，运用高效液相色谱法快速而准确的分析维生素e的含量。

技术实现要素：

本发明建立合适的样品处理过程以及色谱条件，提供一种简便、快速、准确的维生素e含量的高效液相色谱(hplc)检测方法，以替代传统的gc测定维生素e的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种维生素e含量的高效液相色谱检测方法，该方法包括如下步骤：(1)对照品溶液的配制：

标准品溶液：分别精密称取100.0mg维生素e对照品于100ml容量瓶中，加50ml四氢呋喃/甲醇混合液，超声使之溶解，再用四氢呋喃/甲醇混合液稀释至刻度，平行制备两份；

(2)样品处理：

样品用溶剂配制成样品溶液，样品溶液在超声水浴机中进行超声分散处理，温度为60±2℃，时间为25±2分钟，再用溶剂稀释成与标准品浓度相当的溶液；

(3)液相色谱检测：

分别吸取标准品溶液、样品溶液注入高效液相色谱系统中进行检测，液相色谱检测的条件是：①色谱柱：c18柱,250×4.0mm，5μm；②流速：2.0ml/min，③检测波长：280nm；④进样量：20μl；⑤柱温：30℃。

本发明通过运用高效液相色谱法(hplc)测定维生素e含量的方法，通过对样品处理过程以及色谱条件的选择，最终达到简便而准确地对单一组分以及复杂组分样品中维生素e含量的测定。本发明方法能够代替传统的gc法来测定ve含量，而且简便、快速、准确。

本发明采用等体积四氢呋喃/甲醇混合液作为溶剂体系的优点：由于四氢呋喃和甲醇互溶。本方法适用于纯品维生素e的检测，也适用于维生素e浓缩液及含有油类等其它剂型复杂成分的维生素e的检测，四氢呋喃作为溶解性较好的溶液，可以很好地将内容物溶解，达到主成分能完全提取的目的。而甲醇的加入，能很好地消除样品在仪器分析过程中，因样品溶解所需的溶液和流动相极性不同产生的干扰。

作为优选，样品处理过程中，采用四氢呋喃/甲醇混合液作为溶剂体系，二者的体积比为1:1。

作为优选，色谱条件中流动相试剂的选择及其比例为：甲醇:水:冰醋酸的体积比是970:30:2。

作为优选，步骤(2)中样品溶液的配制方法：

维生素e原料：根据标准品的配制浓度，精密称取一定量的原料于100ml容量瓶，用等体积四氢呋喃/甲醇混合液定容至刻度，配制成含ve与标准液接近的浓度；

维生素e软胶囊成品：取20粒软胶囊的内容物于一烧杯中，充分混合；精密称取内容物，用等体积四氢呋喃/甲醇混合液溶解并定容至刻度,配制成含ve与标准液接近的浓度。

与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

1、本发明维生素e含量的高效液相色谱检测方法适用于任何剂型(软胶囊、片剂等)；

2、本发明的检测方法以等体积四氢呋喃/甲醇的溶剂体系溶解样品，可以实现较好的溶解脂溶性维生素e，只需简短的超声处理就能使样品中ve一次性彻底溶解出来，再用等体积四氢呋喃/甲醇定容至刻度即可，从而缩短了样品处理时间；

3、本方法可对各种结构的ve进行有效的分离，分离度均在1.5以上；

4、缩短了样品分析时间，提高样品检测效率。传统方法运行一次程序，需要约45min，而本方法仅需约20min就可完成一次程序的运行。

附图说明

图1(a)为实施例1中标准品测定的色谱图；

图1(b)为实施例1中样品测定的色谱图；

图2(a)为实施例2中的标准品测定的色谱图；

图2(b)为实施例2中的样品测定的色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

以下实施例所用供试品及试剂是：

试剂：四氢呋喃：色谱纯；水：超纯水；冰醋酸：分析纯；甲醇：色谱纯。

标准品：d-a生育酚，批号：mkbv6129v,纯度：≥95.5％，来源：sigma-aldrich

样品：1.维生素e油，批号：170109y004，来源：丰益春之谷生物科技(江苏)有限公司；

2.维生素e软胶囊,批号：e1426，来源：浙江康泰伦特生物科技有限公司。

实施例1维生素e原料中ve含量的测定

一种维生素e含量的高效液相色谱检测方法，具体过程如下：

(1)对照品溶液的配制：

标准品溶液：分别精密称取100.0mg维生素e对照品于100ml容量瓶中，加50ml四氢呋喃/甲醇混合液，超声使之溶解，再用四氢呋喃/甲醇混合液稀释至刻度，维生素e的浓度为1.49iu/ml。平行制备两份。

(2)样品处理：

根据对照品iu浓度，精密称取供试品(本实施例为维生素e油原料，厂家生产批次：171109v001)于100ml容量瓶，使二者浓度相等。用四氢呋喃/甲醇混合液定容至刻度，得到待检测样品溶液。

(3)采用液相色谱仪对样品进行检测：

色谱条件：

色谱柱：c18柱,250×4.0mm，5μm；

流动相：甲醇:水:冰醋酸＝970：30：2

流速：2.0ml/min

检测波长：280nm。

进样量：20μl

柱温：30℃

(4)根据峰面积计算，得到样品ve的含量：

计算公式是

式中：a样、a标：为样品、对照品的峰面积，

c标：对照品的浓度，iu/100ml；

v样：样品的稀释体积；

w样：样品的重量，mg。

备注：1mgdl-α醋酸生育酚＝1.0iu

1mgd-α醋酸生育酚＝1.36iu

1mgdl-α生育酚＝1.1iu

1mgd-α生育酚＝1.49iu

1mgd-α琥珀酸生育酚＝1.21iu

(5)样品检测结果：含量：1318.95iu/g，

样品检测结果见图1。

实施例2维生素e软胶囊中ve含量的测定

(1)标准品溶液：分别精密称取100.0mg维生素e对照品于100ml容量瓶中，加50ml四氢呋喃/甲醇混合液，超声使之溶解，再用四氢呋喃/甲醇混合液稀释至刻度，维生素e的浓度为1.49iu/ml。平行制备两份。

(2)样品溶液的配制方法：取20粒软胶囊的内容物于一烧杯中，充分混合；精密称取内容物，使其浓度与标准品溶液相等，用等体积四氢呋喃/甲醇混合液溶解并定容至刻度。

(3)采用液相色谱仪对样品进行检测：

色谱条件：

色谱柱：c18柱,250×4.0mm，5μm；

流动相：甲醇:水:冰醋酸＝970：30：2

流速：2.0ml/min

检测波长：280nm。

进样量：20μl

柱温：30℃。

(4)根据峰面积计算，得到样品ve的含量：

计算公式是

式中：a样、a标：为样品、对照品的峰面积，

c标：对照品的浓度，iu/100ml；

v样：样品的稀释体积；

w样：样品的重量，mg。

w装：样品的装量，mg。

备注：1mgdl-α醋酸生育酚＝1.0iu

1mgd-α醋酸生育酚＝1.36iu

1mgdl-α生育酚＝1.1iu

1mgd-α生育酚＝1.49iu

1mgd-α琥珀酸生育酚＝1.21iu

(5)样品检测结果：含量：408iu/cap，

样品检测结果见图2。

对比例1四氢呋喃/甲醇混合液作为溶剂体系(二者的体积比为1:1)

1)当四氢呋喃/甲醇混合液比例小于1：1时，会发现在溶解含油量比较大的软胶囊成品时，有肉眼可见得成份未全部溶解。

2)当四氢呋喃/甲醇混合液比例大于1：1时，会发现在进行样品分析时，会有干扰峰出现。

对比例2流动相试剂的选择

1)当流动相比例调整为：甲醇:水:冰醋酸的体积比是970:30:0时，各结构维生素e分离度降低，不易于杂质的分离。

2)当流动相比例调整为：甲醇:水:冰醋酸的体积比是970:30:3时，各主峰出峰保留时间会延长，导致程序运行一次周期变长。

方法学考察：

1)线性与范围：

取标准品储备溶液，分别稀释五个浓度，读取峰面积；以峰面积和浓度作线性回归方程，其相关系数：r²＝0.9998；

2)专属性试验：

准确称取空白溶液和对照品溶液，分别注入气相色谱仪，空白溶液图谱中，在主峰保留时间内，无干扰峰出现。

3)溶液稳定性试验：

取样品溶液进行稳定性试验，分别测定放置0、2、4、8小时，峰面积的rsd为：0.37％；

4)重复性试验：称取样品6份，依据上述色谱条件分别进样，计算样品的含量，rsd为：0.21％；

5)回收率：称取标准标品，用溶剂稀释，分别配制成80％，100％和120％浓度的溶液，回收率：99.7％。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。