一种检测6-苄基腺嘌呤的试纸条及方法与流程

本发明涉及一种检测6-苄基腺嘌呤的试纸条及方法，具体涉及一种用于检测6-苄基腺嘌呤的胶体金试纸条，其特别适用于豆芽中6-苄基腺嘌呤残留的检测。

背景技术：

6-苄基腺嘌呤(6-benzylarninopuring，6-ba)是一种人工合成的细胞分裂素，为白色或类白色晶体，难溶于水，微溶于乙醇，在酸、碱中稳定。具有抑制植物叶内叶绿素、核酸和蛋白质分解的作用，主要用于粮食、果树栽培和园艺，作物各个生长阶段都可应用。6-ba目前被广泛用作无根豆芽的生长调节剂。人体摄入过多6-ba会刺激皮肤黏膜，造成食道、胃黏膜损伤，出现恶心、呕吐等。我国原国家食品药品监督管理总局、农业部、国家卫生和计划生育委员会关于豆芽生产过程中禁止使用6-苄基腺嘌呤等物质的公告(2015年第11号)中规定：生产者不得在豆芽生产过程中使用6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、赤霉素等物质，豆芽经营者不得经营含有6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、赤霉素等物质的豆芽。

目前已报道的检测6-苄基腺嘌呤的方法主要是液相色谱法、液相色谱串联质谱法等仪器方法。这些方法均须在实验室条件下操作，样品前处理繁琐费时，还需配备昂贵的仪器设备，检测成本较高、耗时长、操作复杂，在实际应用过程中有很大的限制性，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适于豆芽中6-苄基腺嘌呤残留的胶体金试纸条，可满足大量样品现场筛选和监控，能够更好地满足我国食品监管部门等开展检测工作。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能够检测豆芽中6-苄基腺嘌呤残留的胶体金试纸条，并且提供一种高效、准确、简便、适于现场监控和大量样本筛查的检测方法。

本发明所提供的检测6-苄基腺嘌呤的试纸条，包括试纸和微孔试剂；所述试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫，其依次连接，所述反应膜上具有包被有6-苄基腺嘌呤半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线；所述微孔试剂上冻干有6-苄基腺嘌呤单克隆抗体-胶体金标记物，其具有微孔塞。

所述6-苄基腺嘌呤单克隆抗体是以6-苄基腺嘌呤半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。

所述6-苄基腺嘌呤半抗原-载体蛋白偶联物由6-苄基腺嘌呤半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，所述6-苄基腺嘌呤半抗原是由氨基-6-苄基腺嘌呤与4-(3-氧代丙基)-苯甲酸反应得到，其分子结构式为：

所述底板可为pvc底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

1)制备冻干有6-苄基腺嘌呤单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)制备具有包被有6-苄基腺嘌呤半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有6-苄基腺嘌呤单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。

具体地说，步骤包括：

1)将氨基-6-苄基腺嘌呤与4-(3-氧代丙基)-苯甲酸反应，制备6-苄基腺嘌呤半抗原；

2)将6-苄基腺嘌呤半抗原与载体蛋白偶联，制备6-苄基腺嘌呤半抗原-载体蛋白偶联物；

3)用6-苄基腺嘌呤半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌6-苄基腺嘌呤单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

4)提取小鼠igg免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5)分别将6-苄基腺嘌呤半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线(t)和质控线(c)上；

6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

7)将制备的6-苄基腺嘌呤单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到6-苄基腺嘌呤单克隆抗体-胶体金标记物；

8)将6-苄基腺嘌呤单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中后，将微孔试剂加上微孔塞；

9)将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白、ph为7.2、0.1mol/l的磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装；

11)将制备好的微孔试剂和试纸组装成试纸条，2～8℃条件下保存12个月。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测豆芽中6-苄基腺嘌呤残留的方法，它包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用试纸条进行检测；

(3)分析检测结果。

本发明的6-苄基腺嘌呤快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将6-苄基腺嘌呤单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中，样品中的6-苄基腺嘌呤先与其充分反应，形成药物-抗体-胶体金标记物；再滴入试纸条卡孔内，样本中的药物在流动过程中与反应膜检测线上的6-苄基腺嘌呤半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合6-苄基腺嘌呤单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否含有6-苄基腺嘌呤残留。

检测时，样品经处理后滴入微孔试剂内，充分反应后再加入试纸条卡孔内，当6-苄基腺嘌呤在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的6-苄基腺嘌呤半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(t)和质控线(c)上各出现一条红色条带，且t线显色比c线显色深或与c线显色一致；如果6-苄基腺嘌呤在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与6-苄基腺嘌呤全部结合，从而在t线处因为竞争反应不会与6-苄基腺嘌呤半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带或比c线显色浅。如图4所示。

阴性：当质控线(c)显示出红色条带，检测线(t)同时也显示出红色条带，且(t)线颜色接近或深于(c)线时，判为阴性。

阳性：当质控线(c)显示出红色条带，而检测线(t)不显色或(t)线颜色浅于(c)线时，判为阳性。

无效：当质控线(c)不显示出红色条带，则无论检测线(t)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。

本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的6-苄基腺嘌呤单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。用本发明试纸条检测6-苄基腺嘌呤的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为6-苄基腺嘌呤半抗原合成图。

图2为试纸剖面结构示意图。

图3为微孔试剂图。

图4为试纸条检测结果判定图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1检测6-苄基腺嘌呤的试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1)制备冻干有6-苄基腺嘌呤单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)制备具有包被有6-苄基腺嘌呤半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有6-苄基腺嘌呤单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。

下面分步详细叙述：

1、6-苄基腺嘌呤半抗原的合成(合成路线见附图1)

取氨基-6-苄基腺嘌呤2.4g，加乙醇70ml溶解，加naoh0.45g，充分搅拌后，加4-(3-氧代丙基)-苯甲酸1.85g，60℃加热反应4h，冷却至室温，加硼氢化钠0.38g，继续搅拌2h，停止反应，加水120ml，加6mol/l盐酸调节ph值到6，加乙酸乙酯80ml，萃取，分去水相，有机相旋蒸蒸干，得到红色油状物，乙腈/正己烷(1:1，v/v)165ml重结晶，得到6-苄基腺嘌呤半抗原产物1.9g，收率47.26％。

2、免疫原的制备

取6-苄基腺嘌呤半抗原产物15mg，加n,n-二甲基甲酰胺(dmf)1ml，溶解澄清，加碳化二亚胺(edc)13mg、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)9.4mg，充分混匀后，反应4h，得到半抗原活化液a液；取牛血清白蛋白(bsa)60mg，加0.05mol/lpb溶解，得到b液；将a液滴加到b液中，4℃反应24h，0.02mol/lpbs透析纯化三天，每天换液3次，得到6-苄基腺嘌呤半抗原-bsa偶联物，即为免疫原，分装，-20℃保存。

3、包被原的制备

取6-苄基腺嘌呤半抗原产物9.6mg，加dmf1ml，溶解澄清，加edc7.7mg、nhs6.4mg，充分混匀后，反应4h，得到半抗原活化液a液；取卵清蛋白(ova)50mg，加0.05mol/lpb溶解，得到b液；将a液滴加到b液中，4℃反应24h，0.02mol/lpbs透析纯化三天，每天换液3次，得到6-苄基腺嘌呤半抗原-ova偶联物，即为包被原，分装，-20℃保存。

4、6-苄基腺嘌呤单克隆抗体的制备

(1)动物免疫

将步骤2得到的免疫原注入balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

(2)细胞融合和克隆化

取免疫balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向rpmi1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量分数)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量分数)；所述细胞培养基的ph为7.4。

5、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

6、6-苄基腺嘌呤单克隆抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％(质量分数)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，在日光下观察颜色为酒红色。

(2)6-苄基腺嘌呤单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/l碳酸钾溶液调胶体金的ph值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述6-苄基腺嘌呤单克隆抗体，继续搅拌混匀30min；静置10min后加入10％bsa，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％，静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含bsa的质量分数为0.1％～0.3％、吐温-80的质量分数0.05％～0.2％、ph7.2的0.02mol/l磷酸盐缓冲液。

7、微孔试剂的制备

向微孔试剂微孔板中加入100μl6-苄基腺嘌呤单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有6-苄基腺嘌呤单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存。

8、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含0.5％牛血清白蛋白、ph为7.2、0.1mol/l的磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃下烘干2h备用。

9、反应膜的制备

将6-苄基腺嘌呤半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。

包被过程：用磷酸缓冲液将6-苄基腺嘌呤半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到1mg/ml，用isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(t线)，包被量为1.0μl/cm；用0.01mol/l、ph7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(c线)，包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

10、试纸条的组装

根据附图2所示试纸剖面结构，将样品吸收垫(1)、反应膜(2)、吸水垫(3)依次按顺序粘贴在pvc底板(6)上；样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与pvc底板的始端对齐，吸水垫的末端与pvc底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线(4)和质控线(5)，检测线(t线)和质控线(c线)均为与所述试纸的长相垂直的条状带；检测线位于靠近样品吸收垫的末端的一侧；质控线位于远离样品吸收垫的末端的一侧；将试纸用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中。

根据附图3所示微孔试剂图，微孔试剂7上具有微孔塞8。

将上述试纸与微孔试剂组装成试纸条，在2～8℃的环境中贮存，有效期12个月。

实施例2豆芽中6-苄基腺嘌呤的检测

1、样品的前处理

用均质器均质豆芽样本(切勿研磨成粉末状)；称取2.0g±0.05g样本至10ml聚苯乙烯离心管中，加入3ml磷酸盐缓冲液，用涡旋混合仪涡动1min混匀；室温(20～25℃)4000r/min离心5min，取上层清液作为待测样本液。

2、用试纸条检测

用微量移液器吸取100μl待测样本液于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀；室温(20-25℃)孵育3min后，吸取混匀液90μl垂直滴于加样孔中；液体流动开始计时，反应8min，判定结果。

3、分析检测结果

阴性(－)：t线显色比c线显色深或与c线显色一致，表示样品中6-苄基腺嘌呤浓度低于检测限，如图4a、4b。

阳性(+)：t线显色比c线显色浅或t线不显色，表示样品中6-苄基腺嘌呤浓度等于或高于检测限，如图4c、4d.

无效：未出现c线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效，如图4e、4f。

实施例3样品检测实例

1、检测限试验

取空白豆芽样本，在其中分别添加6-苄基腺嘌呤至终浓度为25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg，取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸条检测豆芽样本时，当其中无6-苄基腺嘌呤和其添加浓度为25μg/kg时，试纸条上显示出t线显色比c线显色深或与c线显色一致，呈阴性；当其中6-苄基腺嘌呤添加浓度为50μg/kg、100μg/kg时，试纸条上显示出t线显色比c线显色浅或t线不显色，呈阳性，表明本试纸条对豆芽中6-苄基腺嘌呤的检测限为50μg/kg。

2、假阳性率、假阴性率试验

取空白豆芽样本及添加6-苄基腺嘌呤至终浓度为50μg/kg的阳性豆芽样本各20份，用3个批次生产的试纸条分别进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1。

表1检测豆芽样本结果

结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性豆芽样本时，结果全为阳性，可知阳性符合率为100％，假阴性率为0；检测20份阴性豆芽样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。说明本发明的检测6-苄基腺嘌呤的试纸条可以对豆芽样本中6-苄基腺嘌呤残留进行快速检测。

3、特异性试验

用本试纸条检测1000μg/kg4-氯苯氧乙酸、2,4,5-三氯苯氧乙酸、赤霉素、萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、多效唑、噻苯隆等其他植物生长调节剂时，试纸条上显示出t线显色比c线显色深或与c线显色一致，呈阴性，说明本试纸条对这些药物无交叉反应。